HPLC波長(zhǎng)切換法同時(shí)測(cè)定白術(shù)及其不同麩制品中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ

吳 慧，趙文龍，單國(guó)順，賈天柱，2*

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧大連 116600;2.遼寧省中藥炮制工程技術(shù)研究中心，遼寧大連 116600)

白術(shù)為菊科Compositae植物白術(shù)Atractylodes macrocephala Koidz.的干燥根莖，具有健脾益氣，燥濕利水，安胎的功效，臨床用于脾虛食少、腹脹泄瀉、水腫、自汗、胎動(dòng)不安等癥［1］。白術(shù)的傳統(tǒng)炮制方法主要為麩炒法和土炒法［2-3］，2010年版《中國(guó)藥典》收載的是麩炒法［4］。白術(shù)的化學(xué)成分主要為揮發(fā)油，其中的倍半萜內(nèi)酯類化合物白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ有抗炎、抗癌、促進(jìn)胃腸運(yùn)動(dòng)等作用［5-8］。目前白術(shù)的麩炒品大多以白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的量變化作為其麩炒后“增酯增效”［9］的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，較少有文獻(xiàn)報(bào)道將白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的量共同作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。為了較全面的反映白術(shù)生、制品的質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)利用波長(zhǎng)切換色譜法［10］，同時(shí)測(cè)定白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的量，進(jìn)一步考察白術(shù)飲片及其炮制品的質(zhì)量，以期更全面地反映白術(shù)生、制品的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 日本島津LC—10ATVP液相色譜儀(SPD—10AVP檢測(cè)器，LC-10atvp泵，AT-330柱溫箱);島津 LC—Solution色譜數(shù)據(jù)工作站;FA1004B電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司);METTLER AE240型十萬(wàn)分之一分析天平(瑞士METTLER公司);KQ—250DB型數(shù)控超聲波清洗器(超聲電功率250 W，頻率40 kHZ);規(guī)格篩(20、40、60目各一套);液化氣灶;鐵炒鍋。

1.2 藥材與試藥 麥麩(市售品，遼寧中醫(yī)藥大學(xué)炮制教研室提供);白術(shù)(購(gòu)自浙江金華，經(jīng)鑒定為白術(shù)Atractylodes macrocephala Koidz.的干燥根莖);對(duì)照品白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ(購(gòu)自四川省維克奇生物科技有限公司，批號(hào)111127，純度≥98%);甲醇為色譜純，水為純凈水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 不同粒徑麥麩的制備［11］取樣品麥麩100 g，分別通過(guò)20、40、60目篩，即得＞20目、20～40目、40～60目、＜60目4種不同粒徑的麥麩。

2.2 不同含水量麥麩的制備 取樣品麥麩100 g，在105℃下烘干5 h［4］，平均分為4份，往每份麥麩中噴入定量清水，充分混勻，即得含水量為0%、10%(麥麩在正常環(huán)境下保存，含水量為10%左右)、20%、30%的麥麩。

2.3 蜜麩皮的制備［12］定量煉蜜置于預(yù)熱鍋內(nèi)，加水(約為煉蜜量的1/4)稀釋后，將樣品麥麩倒入，乘熱拌勻，搓散，用文火炒至不黏手。每100 kg麥麩，用煉蜜60 kg。

2.4 麩炒白術(shù)［1］先將炒制容器用中火加熱至均勻撒入經(jīng)上述處理的麥麩10 g，即刻煙起，隨之投入凈白術(shù)片100 g，不斷翻炒，至白術(shù)呈焦黃色，逸出香氣，取出，篩去麥麩，放涼。即得不同粒徑、不同含水量麥麩及蜜麩皮制白術(shù)。

2.5 清炒白術(shù)［13］取凈白術(shù)片100 g置于炒制的鐵鍋內(nèi)，用中火加熱，不斷翻炒，至白術(shù)呈焦黃色，逸出香氣，取出，放涼，備用。

2.6 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ對(duì)照品適量，置同一量瓶中，加甲醇配制成每1 mL含白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分別為0.256、0.102、0.216 mg的混合對(duì)照品溶液。

2.7 供試品溶液的制備 取白術(shù)藥材樣品適量，粉碎，過(guò)四號(hào)篩，精密稱取2 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，靜置，取上清液過(guò)0.45μm濾膜，備用。

2.8 色譜條件

2.8.1 色譜條件的選擇 Diamonsil C18色譜柱(5μm，150 mm×4.6 mm);流動(dòng)相為甲醇-水(60∶40);檢測(cè)波長(zhǎng)，0～25 min(220 nm)，25～55 min(276 nm);柱溫30℃;體積流量 1.0 mL/min;進(jìn)樣量20μL。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

2.8.2 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 取少量白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ對(duì)照品溶液，稀釋，置UV-3100型紫外分光光度計(jì)下掃描，結(jié)果白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ在220 nm處有最大吸收，白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ在276 nm處有最大吸收，故選擇在各自的最大吸收波長(zhǎng)下作為高效液相色譜法的測(cè)定波長(zhǎng)。

2.9 線性關(guān)系 精密吸取白術(shù)內(nèi)酯混合對(duì)照品1、2、5、7.5、10、15μL進(jìn)樣，按上述色譜條件測(cè)定，以峰面積分面積(mV)對(duì)進(jìn)樣量(μL)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為:白術(shù)內(nèi)酯ⅠY=643362X+156568，r=0.9995;白術(shù)內(nèi)酯ⅡY=430391X－607435，r=0.9996;白術(shù)內(nèi)酯ⅢY=451708X－206502，r=0.9999。結(jié)果表明，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ進(jìn)樣量在0.256～3.840μg、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ進(jìn)樣量在0.102～1.530μg、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ進(jìn)樣量在0.216～3.240μg的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.10 精密度試驗(yàn) 取同一對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，白術(shù)內(nèi)酯ⅠRSD=1.85%(n=6)，白術(shù)內(nèi)酯ⅡRSD=1.27%(n=6)，白術(shù)內(nèi)酯ⅢRSD=0.85%(n=6)。

2.11 穩(wěn)定性試驗(yàn) 將供試品溶液室溫下放置1、2、4、6、8、12 h，測(cè)定其峰面積，結(jié)果白術(shù)內(nèi)酯ⅠRSD=1.92%(n=6)，白術(shù)內(nèi)酯ⅡRSD=1.08%(n=6)，白術(shù)內(nèi)酯ⅢRSD=0.86%(n=6)。

2.12 回收率試驗(yàn) 精密稱取已知白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ含有量的同一批樣品1 g，分別精密加入一定量的蒼術(shù)酮及白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ對(duì)照品，按供試品溶液制備項(xiàng)下操作，平行操作6份，按上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ平均回收率為100.5%，RSD為2.0%;白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ平均回收率為100.1%，RSD為1.5%;白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ平均回收率為99.4%，RSD為1.9%。結(jié)果見表1。

2.13 樣品的測(cè)定 分別取生白術(shù)及其不同麩制品粉末，按照2.2項(xiàng)下方法制備供試品試液，分別精密吸取各供試品溶液20μL，注入高效液相色譜儀記錄峰面積，分別帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中各組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表2。

表1 回收率測(cè)定結(jié)果(n=6)Tab.1 Results of recovery tests(n=6)

表2 生白術(shù)及其不同麩制品中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的測(cè)定結(jié)果(n=6)Tab.2 Determination results of atractylenolideⅠ、Ⅱ、Ⅲin Atractylodis macrocephalae Rhizoma and different kinds of Atractylodis macrocephalae Rhizoma fried with bran(n=6)

3 討論

3.1 波長(zhǎng)切換應(yīng)用于白術(shù)的定量測(cè)定中，能夠?qū)崿F(xiàn)在同一色譜條件下，使其中有不同最大吸收波長(zhǎng)的指標(biāo)性成分能夠在各自的最大吸收波長(zhǎng)處進(jìn)行檢測(cè)，避免了干擾組分對(duì)待測(cè)物質(zhì)測(cè)定的影響，變兩次測(cè)定為一次測(cè)定，簡(jiǎn)化了白術(shù)測(cè)定的繁瑣步驟，該法具有快速、簡(jiǎn)便的特點(diǎn)。

3.2 本實(shí)驗(yàn)曾選用乙腈-水，甲醇-水等不同溶劑系統(tǒng)作為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，發(fā)現(xiàn)甲醇-水系統(tǒng)可獲得較好的峰形和合適的極性范圍。最終將流動(dòng)相確定為甲醇-水(60∶40)，該條件下，白術(shù)中的白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ能得到良好的分離。

3.3 本實(shí)驗(yàn)考察了不同的提取溶媒(甲醇、乙醇、丙酮等)、不同溶媒用量、不同提取方法(回流、索氏提取、超聲提取)、不同提取時(shí)間對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，最終確定提取方法為以10倍量甲醇作為提取溶劑，超聲提取30 min，該方法不需加熱，操作簡(jiǎn)便，提取效果好。

3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，白術(shù)經(jīng)過(guò)不同粒徑、不同含水量的麥麩及蜜麩皮炒制后，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的量較生品及清炒品均有所上升，說(shuō)明麩炒過(guò)程中輔料不可或缺，輔料麥麩對(duì)白術(shù)炒后“増酯增效”起著促進(jìn)作用。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)不同的麥麩炮制后，白術(shù)中的內(nèi)酯增量有所不同，其中＞20目麥麩、0%含水量麥麩及蜜麩皮炒制后的白術(shù)內(nèi)酯量增加比較多，提示我們?cè)邴煶磿r(shí)，輔料麥麩的某些性質(zhì)(粒徑、含水量、是否蜜制等)可能會(huì)影響到中藥的內(nèi)在質(zhì)量。

［1］賈天柱.中藥炮制學(xué)［M］.上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2008:107-108.

［2］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典:2010年版一部［S］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:68.

［3］陳鴻平，張杰紅，王曉宇，等.土炒對(duì)白術(shù)中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ含量的影響［J］.中藥材，2011，34(3):354-357.

［4］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典:2010年版一部［S］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:95-96，附錄52.

［5］Endo K，Toguchi T，Toguchi F，et al.Antiinflammatory principles of Atractylodes rhizomes［J］.Chem Pharm Bull，1979，27(12):2954.

［6］閻克里，朱秀卿，王 莉.HPLC法同時(shí)測(cè)定白術(shù)揮發(fā)油中5種抗腫瘤成分含量［J］.藥物分析雜志，2011，31(6):1106-1110.

［7］龔千鋒.中藥炮制學(xué)［M］.北京:中國(guó)中醫(yī)藥出版社，2004.

［8］李 偉，文紅梅，崔小兵，等.白術(shù)健脾有效成分研究［J］.南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，22(6):366-367.

［9］郝延軍.白術(shù)的炮制原理研究［D］.沈陽(yáng):遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，2006.

［10］石天松.HPLC波長(zhǎng)切換法同時(shí)測(cè)定消炎靈片中異嗪皮啶、迷迭香酸和苦玄參苷ⅠA［J］.中成藥，2012，34(6):1077-1080.

［11］鄧世坤，呂曉宇，劉陶世，等.麥麩粒徑對(duì)麩炒山藥外觀性狀的影響［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2006，17(5):678-679.

［12］上海市中藥飲片炮制規(guī)范［S］.2007:546.

［13］容穗華，林 海，高 妮.白術(shù)炮制工藝及炮制原理的研究品［J］.中國(guó)中藥雜志，2011，36(8):1001-1003.