GC-MS法測定12種含中藥成分滴眼液中抑菌劑

伍海濤，廖南英，黃天來，王寧生，宓穗卿

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)臨床藥理研究所，廣東廣州 510405)

近年來含中藥眼用制劑的臨床應(yīng)用有增多趨勢，2005年版《中國藥典》僅收錄四味珍層冰硼滴眼液(珍視明)，2010年版《中國藥典》新增馬應(yīng)龍八寶眼膏、復(fù)方熊膽滴眼液、夏天無滴眼液，另有更多已上市但尚未收錄的品種及健字號中藥產(chǎn)品。2010年版《中國藥典》定義眼用制劑為“直接用于眼部發(fā)揮治療作用的無菌制劑”［1］。除了少數(shù)自身有抗菌作用的制劑，這些眼用制劑開啟后的無菌狀態(tài)仍需靠添加抑菌劑維持［2］，我國現(xiàn)行藥典對抑菌劑的添加量是一個(gè)范圍，沒有硬性規(guī)定［3］，而抑菌劑含有量過高對角膜細(xì)胞有損害，在一定情況下正常濃度時(shí)對角膜細(xì)胞也有損傷［4］。

本實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)［5-7］對一些含中藥滴眼液中常用的抑菌劑苯扎氯胺進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)其濃度較國外制劑高一倍。其他種類抑菌劑是否也存在類似問題?是否會(huì)有非法添加的物質(zhì)?參考文獻(xiàn)［8-16］采用氣相-質(zhì)譜法(GC-MS)對未知物質(zhì)進(jìn)行譜庫匹配，結(jié)合對照品初步定性;用選擇性離子方法(SIM)提高低響應(yīng)物質(zhì)的信噪比，實(shí)現(xiàn)定量檢測。在此基礎(chǔ)上建立了眼科制劑常用抑菌劑三氯叔丁醇、苯氧乙醇、羥苯乙酯的檢測方法，對12個(gè)含中藥滴眼液品種進(jìn)行了檢測。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 GCMS—QP2010氣相質(zhì)譜儀(日本島津公司)，AOC 20i自動(dòng)進(jìn)樣器，GC-MS solution工作站，AUW220D島津分析天平(日本Shmadzu公司)，XW-80旋渦混合器(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠)。

1.2 藥品與試劑 三氯叔丁醇(Chlorobutanol，98%，購于阿拉丁試劑公司，批號31071)，苯氧乙醇(Phenylglycol，99%，購于Acros公司，批號130242500)，正十三烷(Tridecane，GC級，購于阿拉丁試劑公司，批號33701)，羥苯乙酯(ethyl hydroxybenzoate，99.0%，購于天津科密歐公司，批號2010.7.10)，正己烷(hexane，GC級，購于Sigma公司，批號305113)。

樣品為市售滴眼液。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備 精密吸取適量苯氧乙醇、正十三烷，精密稱取適量三氯叔丁醇、羥苯乙酯分別置于10 mL量瓶中，正己烷溶解配成22.0、7.58、2.0、2.0 mg/mL貯備液4℃貯存。分別移取適量苯氧乙醇，三氯叔丁醇，羥苯乙酯溶液用正己烷配制成200.0μg/mL標(biāo)準(zhǔn)混合液。

2.2 樣本處理方法 原裝受試滴眼液搖勻，舍棄第1滴，擠出后精密吸取20μL，與正己烷溶液1 mL(含內(nèi)標(biāo)1.0μg/mL正十三烷)渦旋2 min，5000 r/min 離心5 min，取上清200μL，以400μL正己烷稀釋混勻(含內(nèi)標(biāo)1.0μg/mL正十三烷)裝瓶，1.0μL進(jìn)樣。正己烷溶液作為溶劑對照。

2.3 氣相-質(zhì)譜法條件

2.3.1 氣相條件 DB-5MS色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25μm，Agilent公司);進(jìn)樣口溫度200℃;爐溫，80℃保持5 min，10℃/min升溫至200℃，保持2 min，40℃/min降溫至80℃;載氣為氦氣，65.2 kpa，壓力控制流速，柱體積流量1 mL/min;分流比為50∶1。

2.3.2 質(zhì)譜條件 離子源溫度250℃;界面溫度200℃;溶劑截止時(shí)間3 min;閾值1000;檢測器電壓Relative to the tuning Result;掃描范圍50～500 m/z。選擇離子監(jiān)測:三氯叔丁醇59.0 m/z，3.1～7.5 min;苯氧乙醇 94.0 m/z，7.5～11.5 min;正十三烷57.1 m/z，11.5～13.0 min;羥苯乙酯 121.0 m/z，13.0 ～17.5 min。

2.4 專屬性試驗(yàn) 各對照品和受試樣在全掃描模式下的總離子流圖見圖1，質(zhì)譜圖見圖2，實(shí)測滴眼液中相關(guān)物質(zhì)均能良好分離(見圖3)，滴眼液中內(nèi)含物無明顯干擾。按其碎片的相對豐度和專屬性選擇59.0 m/z(三氯叔丁醇)，94.0 m/z(苯氧乙醇)，121.0 m/z(羥苯乙酯)，57.1 m/z(正十三烷)為監(jiān)測離子，在各自對應(yīng)的出峰時(shí)間段監(jiān)測。

圖1 混合對照品的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograms of mixed standard sample

圖2 三種抑菌劑的離子碎片圖Fig.2 GC/MS fracture ion chromatograms of three kinds of bacteriostatic

圖3 實(shí)測滴眼液樣本(新樂敦)氣相-質(zhì)譜總離子流圖Fig.3 Total ion chromatograms of an actual sample(New Rohto)

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液以正己烷稀釋 成 20.0、10.0、5.0、2.0、1.0、0.5、0.2、0.1、0.05、0.02μg/mL梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液，各加入等量適宜濃度的正十三烷作為內(nèi)標(biāo)(終質(zhì)量濃度為1.0μg/mL)。

自動(dòng)進(jìn)樣器吸取上述溶液各1.0μL，按上述條件進(jìn)樣測定，以選擇離子峰的面積比(A樣本/A內(nèi)標(biāo))為縱坐標(biāo)，對照品的進(jìn)樣質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程分別為 C1=0.9899(A樣本/A內(nèi)標(biāo)) －0.4962，r2=0.9949，C2=6.331(A樣本/A內(nèi)標(biāo)) －0.4861，r2=0.9946，C3=15.193(A樣本/A內(nèi)標(biāo)) － 0.1231，r2=0.9991。

2.6 檢測限和最低定量下限 按上述測定法，精密吸取線性項(xiàng)下對照品溶液定量稀釋，以信噪比(S/N)為3∶1的質(zhì)量濃度為檢測限，以信噪比(S/N)為10∶1的質(zhì)量濃度為最低定量限(LOQ)，重復(fù)進(jìn)樣6次。三氯叔丁醇、苯氧乙醇、羥苯乙酯的定量限分別為 20.0 ng/mL，50.0 ng/mL，100.0 ng/mL。

2.7 基質(zhì)效應(yīng) 由于檢測的滴眼液種類較多，組方復(fù)雜，不易找到同時(shí)適合多個(gè)物質(zhì)的有較強(qiáng)選擇性的凈化方法，因本方法樣品稀釋倍數(shù)較大，正己烷萃取可排除絕大部分鹽類和水溶性物質(zhì)，對離子化的干擾較小，選擇樣品直接稀釋進(jìn)樣。

2.8 精密度試驗(yàn) 按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下配制0.1、1.0、10.0μg/mL的低、中、高3個(gè)混合對照品溶液，每個(gè)濃度測定5次，計(jì)算日內(nèi)精密度。三氯叔丁醇的日內(nèi)RSD在2.67%和7.21%間，苯氧乙醇的日內(nèi)RSD在1.36%和5.62%間，羥苯乙酯的日內(nèi)RSD在2.43%和7.10%間，基本符合檢測要求。

2.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取3種標(biāo)注不同抑菌劑的滴眼液各3份，分別加入等體積(0.75 mg/mL，1.5 mg/mL，3.0 mg/mL)低、中、高3種混合對照品溶液，每種質(zhì)量濃度重復(fù)配制3份。按2.3項(xiàng)下操作，以標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算回收率和RSD，加樣回收率位于91.9% ～104.1%，均符合要求。

2.10 樣品測定 精密吸取各供試品20μL，按2.2項(xiàng)下處理進(jìn)樣，每個(gè)樣本平行操作一次。結(jié)果見表1。測得的抑菌劑均在規(guī)定范圍類，以四個(gè)未標(biāo)注待檢抑菌劑的滴眼液品種作為陰性對照，三個(gè)未檢出抑菌劑，一個(gè)制劑含有說明書中未標(biāo)明的抑菌劑三氯叔丁醇。

表1 滴眼液中脂溶性抑菌劑含有量Tab.1 Results of bacteriostatics concentration in eye drops

3 討論

3.1 研究對比了不同溶劑萃取的效果，采用乙酸乙酯萃取會(huì)帶入較多的雜質(zhì)干擾質(zhì)譜檢測;同時(shí)考察了OV-1701柱的分離效果，同樣條件下樣本峰形展開較DB-5MS差，但羥苯乙酯的峰形較好，與毛細(xì)管柱的極性選擇有關(guān)。較高的爐溫會(huì)導(dǎo)致低沸點(diǎn)物質(zhì)(三氯叔丁醇等)過早出峰，隱沒在溶劑峰中，采用80℃的起始溫度并停留5min，再緩慢升高爐溫至200℃，使制劑中含有的大部分揮發(fā)性成分得到展開。

3.2 利用正己烷萃取滴眼液中的脂溶性成分，采用程序升溫、全掃描模式(SCAN)得到大部分揮發(fā)性成分的總離子流圖，對照品結(jié)合GC-MS譜庫可對大部分物質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確定性，有效地監(jiān)測眼用制劑中的未知成分，防止未注明物質(zhì)被當(dāng)做干擾峰或溶劑峰忽略。確認(rèn)待測物質(zhì)(抑菌劑)后，針對特征離子碎片，進(jìn)行選擇性離子掃描(SIM)，能很好地抑制中藥成分造成的背景噪聲，對低濃度的受試物也可進(jìn)行定量。用本法測得各滴眼液含有的抑菌劑均在規(guī)定范圍類，發(fā)現(xiàn)其中一個(gè)制劑使用了說明書中未標(biāo)明的抑菌劑。

3.3 常用眼用抑菌劑除苯扎氯胺、硫柳汞外，大部分脂溶性較好，有一定的揮發(fā)性，可以利用氣相或氣質(zhì)聯(lián)用進(jìn)行檢測。2010年版《中國藥典》對三氯叔丁醇、羥苯乙酯的定量檢測方法靈敏度較低［13］，更適合原料藥的檢測。本研究的三氯叔丁醇、苯氧乙醇的檢測限較其他氣相-質(zhì)譜檢測的文獻(xiàn)報(bào)道高1～2個(gè)數(shù)量級［14-15］，與萃取方式、受試劑型有關(guān);羥苯乙酯的靈敏度較液相-紫外檢測略高［8-10，16］，與其在毛細(xì)管柱中的保留強(qiáng)，峰形矮胖而液相的紫外響應(yīng)好有關(guān)。

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