不同誘導(dǎo)劑和誘導(dǎo)方法對西瓜單倍體染色體加倍效果的比較研究

李海倫 高寧寧 李曉慧 康利允 常高正 王琰 王慧穎 趙衛(wèi)星

摘? ? 要：為探究不同誘導(dǎo)劑和誘導(dǎo)方法對西瓜單倍體染色體加倍的效果，以西瓜花藥離體培養(yǎng)獲得的單倍體植株為材料，利用不同質(zhì)量濃度的秋水仙素和氟樂靈進(jìn)行培養(yǎng)基加倍、浸芽加倍、滴生長點(diǎn)加倍3種方法研究單倍體植株誘導(dǎo)二倍體植株的效果。結(jié)果表明，不同加倍方法對單倍體加倍的誘導(dǎo)率存在很大差異。秋水仙素誘導(dǎo)加倍，植株的存活率均達(dá)到100%，氟樂靈誘導(dǎo)加倍，加倍植株的致死率最高達(dá)到100%。組培法誘導(dǎo)加倍時(shí)，秋水仙素和氟樂靈均在質(zhì)量濃度為60 mg·L-1時(shí)，加倍誘導(dǎo)率最高，分別是50.00%和41.67%。浸芽法誘導(dǎo)加倍時(shí)，600 mg·L-1秋水仙素浸芽4 h加倍誘導(dǎo)率最高為75.00%；300 mg·L-1氟樂靈浸芽2 h加倍誘導(dǎo)率最高為50.00%。滴生長點(diǎn)誘導(dǎo)加倍時(shí)，600 mg·L-1秋水仙素誘導(dǎo)的加倍率最高為50.00%；500 mg·L-1氟樂靈誘導(dǎo)加倍率最高為27.78%。因此，秋水仙素誘導(dǎo)西瓜單倍體植株加倍效果優(yōu)于氟樂靈，且浸芽法誘導(dǎo)加倍效果最佳。

關(guān)鍵詞：西瓜；單倍體；秋水仙素；氟樂靈；染色體加倍

中圖分類號(hào)：S651 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1673-2871（2024）01-025-07

Comparative study on chromosome doubling effect of watermelon haploid with different inducers and induction methods

LI Hailun， GAO Ningning， LI Xiaohui， KANG Liyun， CHANG Gaozheng， WANG Yan， WANG Huiying， ZHAO Weixing

（Institute of Horticulture， Henan Academy of Agricultural Sciences， Zhengzhou 450002， Henan， China）

Asbtract： In order to investigate the effect of different inducers and induction methods on chromosome doubling of watermelon haploid， the haploid plants obtained from watermelon anther culture in vitro were used as materials. Different concentrations of colchicine and fluralin were used to study the effect of inducing diploid plants from haploid plants by three methods： medium doubling method， germination doubling method and droplet growing point doubling method. The results showed that the induction rate of haploid doubling by different doubling methods varied. The survival rate of plants induced by colchicine doubling reached 100%， and the mortality rate of plants induced by fluralin doubling reached 100%. When induced by tissue culture， the doubling induction rates of colchicine and trifluralin were the highest at a mass concentration of 60 mg·L-1， with 50.00% and 41.67%， respectively. When inducing doubling by soaking the buds with 600 mg·L-1 colchicine for 4 hours， the highest doubling induction rate was 75.00%; the highest doubling induction rate of 300 mg·L-1 fluralin soaking buds for 2 hours was 50.00%. When inducing doubling at the droplet growth point， the highest doubling rate induced by 600 mg·L-1 colchicine was 50.00%; the highest induction doubling rate of 500 mg·L-1 trifluralin was 27.78%. Therefore， the effect of inducing haploid watermelon plants to double with colchicine is better than that with trifluralin， and the soaking method has the best effect on inducing doubling.

Key words： Watermelon; Haploid; Colchicine; Fluralin; Chromosome doubling

西瓜是世界十大水果之一，具有甘甜多汁、清爽解渴的特點(diǎn)，夏季廣受消費(fèi)者的喜愛，使其市場需求量大大增加。西瓜栽培周期短、上市快且經(jīng)濟(jì)效益高，已經(jīng)成為廣大農(nóng)民致富的重要產(chǎn)業(yè)[1]。目前優(yōu)異西瓜品種更新滯后，加上西瓜遺傳基礎(chǔ)狹窄，常規(guī)育種周期長，現(xiàn)有品種已不能滿足市場需求，所以擴(kuò)寬西瓜遺傳基礎(chǔ)，發(fā)掘優(yōu)異種質(zhì)，提高西瓜品種改良效率是西瓜育種的首要任務(wù)。單倍體育種是一條縮短育種年限、加快育種進(jìn)程的有效途徑?；ǚ圯椛鋄2]、花藥培養(yǎng)[3-4]、大孢子培養(yǎng)[5-6]等都是較為常用的單倍體誘導(dǎo)技術(shù)。從20世紀(jì)80年代初期起，薛光榮等[7-8]、袁萬良等[9]、魏瑛[10]、李娟等[11]、緱艷霞等[12]、朱迎春等[13]研究者就不斷地探究西瓜花藥離體培養(yǎng)技術(shù)，且獲得了單倍體植株。單倍體植株需要通過加倍才能用于育種材料和新種質(zhì)的創(chuàng)制，常用的誘導(dǎo)單倍體加倍的方法有浸芽、浸種、浸根、浸苗、滴生長點(diǎn)和組培法等[14-18]，常采用的誘導(dǎo)劑有秋水仙素、氟樂靈、炔苯酰草胺和氨磺靈等，及輔助添加劑二甲基亞砜（DMSO）、吐溫等，有助于提高加倍效率。高寧寧等[14]研究表明，輔助添加劑DMSO可以提高甜瓜單倍體的加倍率。適量的誘導(dǎo)劑配合適宜的加倍方法，將有效地提高加倍率。玉米[19]、黃瓜[20]、蘿卜[21]、南瓜[22]等作物在不同誘導(dǎo)劑和不同方法的誘導(dǎo)下，均得到很好的加倍效果。目前對西瓜單倍體加倍技術(shù)的研究較少，還未見成熟的西瓜單倍體加倍技術(shù)的報(bào)道。筆者總結(jié)了前人研究成功的經(jīng)驗(yàn)，利用秋水仙素和氟樂靈誘導(dǎo)劑，采用組培法、浸芽法、滴生長點(diǎn)法3種方法對利用西瓜花藥離體培養(yǎng)獲得的單倍體植株進(jìn)行加倍，以期建立高效的西瓜單倍體加倍體系，以便快速、高效地獲得純合的自交系優(yōu)異種質(zhì)材料，縮短育種年限，加快西瓜優(yōu)異新品種的選育進(jìn)程。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為小果型西瓜斯維特。試驗(yàn)于2022年5—9月在河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所組培分子實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，利用西瓜花藥離體培養(yǎng)獲得的單倍體植株進(jìn)行擴(kuò)繁，然后挑選長勢一致的擴(kuò)繁苗來研究不同誘導(dǎo)劑對西瓜單倍體植株加倍的效果。試驗(yàn)材料由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所西甜瓜研究室提供。

1.2 方法

1.2.1 西瓜單倍體植株擴(kuò)繁 把西瓜花藥離體培養(yǎng)獲得的單倍體植株接入芽增殖培養(yǎng)基MS+0.15 mg·L-1KT+10%椰汁+30 g·L-1蔗糖+6 g·L-1瓊脂（pH 5.80～5.85）中，放入每天光照時(shí)間16 h、光照度3000～4000 lx、溫度在（25±2） ℃的培養(yǎng)間中進(jìn)行增殖擴(kuò)繁培養(yǎng)，用于快速獲得大量的單倍體植株，為研究不同誘導(dǎo)劑對西瓜單倍體加倍的效果提供充足的試驗(yàn)材料。

1.2.2 培養(yǎng)基添加法誘導(dǎo) 以培養(yǎng)基MS+0.15 mg·L-1 KT +10%椰汁為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加不同質(zhì)量濃度的秋水仙素（0、40、60、80、100 mg·L-1）和不同質(zhì)量濃度的氟樂靈（0、40、60、80、100 mg·L-1）配制成加倍培養(yǎng)基，然后將擴(kuò)繁的單倍體植株接入加倍培養(yǎng)基中，再在上述培養(yǎng)條件下培養(yǎng)21 d，之后轉(zhuǎn)接到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中做植株的倍性鑒定。試驗(yàn)共9個(gè)處理，每個(gè)處理接入4株西瓜單倍體植株，每個(gè)處理3次重復(fù)，并統(tǒng)計(jì)加倍植株存活率。加倍植株存活率/%=成活植株數(shù)/處理植株數(shù)×100。

1.2.3 浸芽法誘導(dǎo) 先配制不同質(zhì)量濃度的秋水仙素（0、200、400、600、800 mg·L-1）和不同質(zhì)量濃度的氟樂靈（0、100、300、500、700 mg·L-1），均以1.5%的DMSO（二甲基亞砜）作為助溶劑，然后過濾滅菌，再將單倍體植株分別在不同質(zhì)量濃度的秋水仙素中浸泡2、4、6 h和在不同質(zhì)量濃度的氟樂靈中浸泡2、3、4 h，以1.5%的DMSO浸芽6 h和4 h分別作為秋水仙素和氟樂靈浸芽的對照，浸芽結(jié)束后，用無菌水沖洗3遍，每遍1 min，最后控干水分，接入基礎(chǔ)培養(yǎng)基中（MS+0.15 mg·L-1 KT +10%椰汁），在上述培養(yǎng)條件中培養(yǎng)21 d。試驗(yàn)共30個(gè)處理，每個(gè)處理接入4株西瓜單倍體植株，每個(gè)處理3次重復(fù)，并統(tǒng)計(jì)加倍植株存活率。

1.2.4 滴生長點(diǎn)法誘導(dǎo) 用1.5%的DMSO（二甲基亞砜）配制無菌的不同質(zhì)量濃度的秋水仙素（200、400、600、800 mg·L-1）和不同質(zhì)量濃度的氟樂靈（100、300、500、700 mg·L-1），然后分別滴加2滴到西瓜單倍體植株的生長點(diǎn)，在1、3、5 d各滴加1次，以滴加1.5%的DMSO作為對照，在上述培養(yǎng)條件中培養(yǎng)28 d。試驗(yàn)共9個(gè)處理，每個(gè)處理4株植株，每個(gè)處理3次重復(fù)，并統(tǒng)計(jì)加倍植株的存活率。

1.3 植株倍性鑒定

取待測植株最新長出的嫩葉約0.2 g，用細(xì)胞裂解液與細(xì)胞染色液以體積比1∶4制作細(xì)胞懸浮液，用德國PARTEC公司的CyFlowRCube8流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測植株的倍性，以斯維特種子苗為參照。統(tǒng)計(jì)植株的加倍率，加倍率/%=加倍植株數(shù)/處理存活植株數(shù)×100。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，采用SPSS 21進(jìn)行方差分析，采用Duncan檢驗(yàn)法進(jìn)行多重比較，采用FCS Express V3對流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 植株倍性鑒定

西瓜花藥離體培養(yǎng)獲得的單倍體植株通過秋水仙素和氟樂靈誘導(dǎo)加倍，將獲得加倍的存活植株進(jìn)行流式細(xì)胞儀倍性鑒定分析，鑒定結(jié)果如圖1所示，以單倍體植株首個(gè)呈正態(tài)分布的最高峰的熒光強(qiáng)度100為對照，對誘導(dǎo)加倍存活的植株進(jìn)行鑒定，共得到二倍體和混倍體2種倍性植株。

2.2 培養(yǎng)基添加法對染色體加倍效果的影響

將西瓜花藥離體培養(yǎng)誘導(dǎo)的單倍體植株進(jìn)行增殖培養(yǎng)，把獲得的單倍體植株接種到含有不同質(zhì)量濃度的秋水仙素或氟樂靈的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)加倍，鑒定的加倍效果如表1所示。

利用秋水仙素作為誘導(dǎo)劑時(shí)，植株的存活率達(dá)到100%，生長良好（圖2-A），隨著秋水仙素質(zhì)量濃度的增加，二倍體的加倍率呈倒“V”形，先增后降，混倍體的加倍率呈線性增加。當(dāng)秋水仙素質(zhì)量濃度為60 mg·L-1時(shí)，二倍體加倍率達(dá)到最大值50.00%；當(dāng)質(zhì)量濃度為100 mg·L-1時(shí)，混倍體加倍率最高達(dá)到58.33%。利用氟樂靈作為誘導(dǎo)劑時(shí)，植株的存活率隨著氟樂靈質(zhì)量濃度的增加而降低，長勢較弱（圖2-B），當(dāng)氟樂靈質(zhì)量濃度為100 mg·L-1時(shí)，植株存活率降至75.00%，二倍體和混倍體加倍率的變化趨勢與秋水仙素加倍效果一致，二倍體和混倍體最高加倍率的質(zhì)量濃度與秋水仙素一樣，其最高加倍率分別為41.67%和44.44%。試驗(yàn)結(jié)果表明，秋水仙素的加倍效果優(yōu)于氟樂靈，加倍植株的致死率為0，而氟樂靈加倍植株的致死率最高達(dá)到25.00%，而且二倍體最高加倍率高出氟樂靈8.33個(gè)百分點(diǎn)，所以質(zhì)量濃度為60 mg·L-1的秋水仙素作為最佳誘導(dǎo)加倍濃度，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)在不添加誘導(dǎo)劑時(shí)，二倍體的加倍率也能達(dá)到8.33%。

2.3 浸芽法對染色體加倍效果的影響

利用不同質(zhì)量濃度的秋水仙素或氟樂靈對獲得的西瓜單倍體芽進(jìn)行浸芽處理，經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定植株倍性的結(jié)果如表2和表3所示，植株的長勢如圖3所示。秋水仙素誘導(dǎo)二倍體的最高比例（75.00%）高于氟樂靈誘導(dǎo)的最高比例（50.00%）。利用秋水仙素誘導(dǎo)加倍，植株的存活率均達(dá)到100.00%，而氟樂靈誘導(dǎo)加倍時(shí)植株的致死率最高達(dá)100.00%，表明氟樂靈對植株有一定的毒害作用。

由表2可知，當(dāng)秋水仙素浸芽2 h時(shí)，二倍體的加倍率隨著秋水仙素質(zhì)量濃度的增加呈先降低后升高的變化趨勢，最高加倍率為58.33%，其中400 mg·L-1秋水仙素浸芽處理未得到二倍體，其混倍體比例高達(dá)75.00%；浸芽4 h時(shí)，600 mg·L-1秋水仙素浸芽處理二倍體加倍率最高為75.00%；浸芽6 h時(shí)，二倍體加倍率與秋水仙素質(zhì)量濃度的增加呈反比，200～800 mg·L-1秋水仙素浸芽處理使二倍體加倍率由50.00%降至33.34%。

由表3可知，當(dāng)氟樂靈質(zhì)量濃度為100 mg·L-1時(shí)，二倍體加倍率隨著浸芽時(shí)間的增加呈現(xiàn)出先升高后降低的變化趨勢，浸芽3 h時(shí)二倍體加倍率達(dá)到最大值50.00%；當(dāng)質(zhì)量濃度為300 mg·L-1時(shí)，二倍體加倍率與時(shí)間的增加呈反比，浸芽2 h時(shí)二倍體加倍率最高，為50.00%；當(dāng)質(zhì)量濃度為500 mg·L-1時(shí)，浸芽2 h時(shí)沒有獲得二倍體，只得到72.22%混倍體；當(dāng)質(zhì)量濃度為700 mg·L-1時(shí)，只有浸芽2 h的處理有存活植株，得到二倍體加倍率為33.33%。

同時(shí)發(fā)現(xiàn)在1.5%的DMSO溶液中浸芽6 h也能得到16.67%二倍體，植株的加倍率得到提高，表明DMSO輔助劑對植株加倍具有一定的促進(jìn)作用。綜合植株存活率和加倍率分析可知，秋水仙素誘導(dǎo)加倍效果好于氟樂靈，最佳誘導(dǎo)方法為600 mg·L-1的秋水仙素浸芽4 h。

2.4 滴生長點(diǎn)法對染色體加倍效果的影響

利用不同質(zhì)量濃度的秋水仙素和氟樂靈對西瓜單倍體植株的生長點(diǎn)滴加誘導(dǎo)劑進(jìn)行加倍，通過流式細(xì)胞儀鑒定的結(jié)果如表4所示，加倍植株的生長情況如圖4所示。二倍體的最高加倍率只有50.00%，由600 mg·L-1的秋水仙素處理所得。利用秋水仙素誘導(dǎo)液加倍時(shí)，植株的存活率都達(dá)到了100.00%，而500 mg·L-1的氟樂靈處理時(shí)植株的存活率只有58.33%，700 mg·L-1的氟樂靈處理時(shí)植株的存活率為0，說明氟樂靈對植株的毒害作用較大。隨著秋水仙素質(zhì)量濃度的增加，二倍體加倍率呈先升高后降低的變化趨勢，600 mg·L-1時(shí)達(dá)到最大值，為50.00%；混倍體一直保持遞增的變化趨勢，800 mg·L-1時(shí)達(dá)到最大值，為58.33%。隨著氟樂靈質(zhì)量濃度的增加，二倍體和混倍體加倍率均呈先升高后降低的變化趨勢，但二倍體的加倍率低于秋水仙素處理，最高加倍率只有27.78%，500 mg·L-1時(shí)混倍體的加倍率最高，達(dá)到61.11%。試驗(yàn)結(jié)果表明，滴生長點(diǎn)加倍的最佳方案為600 mg·L-1秋水仙素。

3 討論與結(jié)論

多倍體誘導(dǎo)時(shí)常用的誘導(dǎo)劑主要有秋水仙素、除草劑類物質(zhì)（氟樂靈）、植物激素（激動(dòng)素）等化學(xué)誘變劑，這些誘導(dǎo)劑對處在分裂旺盛期的細(xì)胞都具有一定的影響，能抑制細(xì)胞有絲分裂，從而使染色體加倍，同時(shí)添加DMSO等輔助劑，將會(huì)有效地提高植株加倍率。其中秋水仙素是典型的誘導(dǎo)劑，在蘋果[23]、黃瓜[20]、非洲菊[24]等很多種作物上都取得了一定成果，而氟樂靈作為誘導(dǎo)劑的使用范圍相對狹隘。筆者利用秋水仙素和氟樂靈2種化學(xué)誘變劑對單倍體西瓜進(jìn)行誘導(dǎo)加倍，結(jié)果表明，秋水仙素誘導(dǎo)加倍的植株存活率均達(dá)到100.00%，且長勢良好；氟樂靈誘導(dǎo)的加倍植株致死率最高達(dá)到100.00%，且呈現(xiàn)出一種病態(tài)的長勢。秋水仙素誘導(dǎo)二倍體的最高加倍率為75.00%，高于氟樂靈誘導(dǎo)二倍體的最高加倍率50.00%。李麗[25]在誘導(dǎo)萱草多倍體的研究中，發(fā)現(xiàn)秋水仙素和氟樂靈的誘導(dǎo)率沒有明顯區(qū)別，而褚麗紅等[26]對安祖花的研究結(jié)果表明，氟樂靈的誘導(dǎo)效果好于秋水仙素，可能與不同的植物對不同誘導(dǎo)劑的敏感程度存在差異有關(guān)，但具體原因還有待進(jìn)一步研究。筆者還發(fā)現(xiàn)在不添加任何誘導(dǎo)加倍劑的條件下，在含有激素KT、椰汁等基礎(chǔ)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)也能得到8.33%的二倍體，在通過1.5%DMSO處理后再接入基礎(chǔ)培養(yǎng)基誘導(dǎo)，二倍體的誘導(dǎo)率能達(dá)到16.67%，說明KT具有一定的加倍功效，DMSO具有輔助提高植株加倍率的功能，朱惠琴[27]在煙草上的研究也表明DMSO對加倍具有促進(jìn)作用。

多倍體誘導(dǎo)的效果與誘導(dǎo)方法有著直接的關(guān)系。常用的有浸芽、浸種、浸根、浸苗、滴生長點(diǎn)和組培法等多種誘導(dǎo)方法。筆者利用不同質(zhì)量濃度的秋水仙素和氟樂靈2種誘導(dǎo)劑通過不同的誘導(dǎo)方法，誘導(dǎo)的二倍體加倍率在0～75.00%。在培養(yǎng)基添加法誘導(dǎo)加倍過程中，二倍體的加倍率隨著2種誘變劑質(zhì)量濃度的增加均表現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，均在60 mg·L-1時(shí)達(dá)到最大值，分別為50.00%、41.67%，均高于高寧寧等[14]的培養(yǎng)基添加法（37%）。浸芽法誘導(dǎo)加倍時(shí)，600 mg·L-1秋水仙素浸芽4 h時(shí)達(dá)到二倍體最高加倍率75.00%，300 mg·L-1氟樂靈浸芽2 h得到最高二倍體加倍率50.00%。從最佳誘導(dǎo)效果上來看，秋水仙素在質(zhì)量濃度和浸芽時(shí)長上都要高于氟樂靈，而氟樂靈在植株長勢和誘變率上都低于秋水仙素，在李麗[25]的研究中秋水仙素處理時(shí)長同樣高于氟樂靈處理，但誘導(dǎo)率卻沒有明顯的差異，可能是不同作物的倍性與誘變劑的劑量和處理時(shí)間有關(guān)。滴生長點(diǎn)誘導(dǎo)加倍法的研究比較少，在李勤菲等[17]對蕓薹屬3種單倍體染色體加倍中有研究報(bào)道，在筆者的研究中不同質(zhì)量濃度的秋水仙素滴生長點(diǎn)誘導(dǎo)二倍體加倍率均高于氟樂靈，誘導(dǎo)率最高為50.00%，但2種誘變劑的誘導(dǎo)率均高于李勤菲等[17]的17.54%的加倍率，可能是不同的作物對不同質(zhì)量濃度的誘變劑的敏感程度不同。

植物染色體倍性的改變是一個(gè)復(fù)雜的生理生化變化過程，受植物基因型、誘變劑類型和外界環(huán)境條件等多種因素的影響。因此，還需要進(jìn)一步利用基因工程技術(shù)探討染色體加倍的分子機(jī)制，以提高西瓜單倍體的加倍率，加快雙單倍體育種的進(jìn)程。筆者通過利用培養(yǎng)基添加法、浸芽法和滴生長點(diǎn)法3種不同的加倍技術(shù)對西瓜單倍體加倍的效果進(jìn)行研究，結(jié)果表明，浸芽法加倍效果最佳，秋水仙素誘導(dǎo)劑效果好于氟樂靈誘導(dǎo)劑，其二倍體誘導(dǎo)率和植株長勢均優(yōu)于其他。600 mg·L-1秋水仙素浸芽4 h，二倍體加倍率達(dá)到最高，為75.00%。研究結(jié)果為西瓜單倍體快速獲得純合的雙單倍體提供了技術(shù)參考，同時(shí)獲得的西瓜多倍體種質(zhì)豐富了育種材料，對加快育種進(jìn)程、提高育種效率具有重要意義。

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