云南昆明地區(qū)南瓜白粉病病原菌生理小種鑒定

高婷 李梅 朱彩華 龍榮華

摘? ? 要：為明確云南省昆明市團結(jié)鄉(xiāng)地區(qū)南瓜白粉病病原菌種類及生理小種，通過病原菌孢子形態(tài)觀察、分子鑒定及國際通用的甜瓜白粉病生理小種鑒別寄主與標準鑒定體系，對該地區(qū)的南瓜白粉病病原菌及生理小種進行鑒定。結(jié)果表明，該白粉病菌孢子形態(tài)呈橢圓形，內(nèi)有纖維狀體；rDNA-ITS序列與單囊殼屬（Podosphaera xanthii）ITS序列聚為一類，一致性高達99%；病原菌樣本對鑒別寄主的抗感反應與單囊殼白粉菌生理小種2France表現(xiàn)一致。因此，引起昆明市團結(jié)鄉(xiāng)地區(qū)南瓜白粉病的病原菌為單囊殼屬白粉病菌（P. xanthii）的生理小種2France。

關鍵詞：南瓜；白粉病菌；生理小種

中圖分類號：S642.1 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2024）01-076-05

Identification of physiological race of pumpkin powdery mildew in Kunming region

GAO Ting1， LI Mei2， ZHU Caihua1， LONG Ronghua1

（1. Horticultural Research Institute， Yunnan Academy of Agricultural Sciences， Kunming 650205， Yunnan， China; 2. Dongchuan Economic Crop Technique Popularization Station， Kunming 654100， Yunnan， China）

Abstract： In order to identify the species and physiological race of powdery mildew in Tuanjie region， Kunming， Yunnan province， the pathogen and physiological race of pumpkin powdery mildew in Tuanjie region were identified through the observation of pathogen spore morphology， molecular identification of ITS sequence， international common physiological races identification hosts of melon powdery mildew and its standard identification system. The results showed that the spores were oval in shape with fibrous bodies. The rDNA-ITS sequence was grouped with the ITS sequence of Podosphaera Xanthii， and the similairities was up to 99%. The resistance and susceptible response of the pathogen samples to the identification of the host was consistent with that of the physiological race 2France. Therefore， the pathogen causing powdery mildew of pumpkin in Tuanjie region of Kunming city was identified as race 2France of P. Xanthii.

Key words： Pumpkin; Powder mildew; Physiological race

南瓜是葫蘆科（Cucurbitaceae）南瓜屬（Cucurbita Linn.）一年生草本植物。目前，中國主要栽培的南瓜有4個種，即中國南瓜（Cucurbita moschata Duch.）、美洲南瓜（西葫蘆）（Cucurbita pepo L.）、印度南瓜（Cucurbita maxima Duch.）和黑籽南瓜（Cucurbita ficifolia Bouche），但黑籽南瓜一般用作砧木或者飼料。南瓜具有風味好、易栽培、藥用價值高等特點，因此在我國種植廣泛。據(jù)FAO統(tǒng)計（https：//www.fao.org/faostat/en/#home），2021年南瓜在中國的栽培面積為40.16萬hm2，總產(chǎn)量為743.99萬t。白粉病是南瓜嚴重且常見的病害，常造成產(chǎn)量降低，嚴重時甚至影響果實品質(zhì)。

據(jù)報道，目前引起瓜類白粉病的病原菌是白粉病菌，主要有3個屬：白粉菌屬（Erysiphe）、內(nèi)絲白粉菌屬（Leveillula）及單囊殼屬（Podosphaera），6個種分別是E. cichoracearum（又稱Golovinomyces cichoracearum）、E. polygoni、E. polyphage、E. communis、L. taurica和P. xanthii（又稱Sphaerotheca fuliginea）。P. xanthii報道最多，其次為E. cichoracearum[1]，這2個種是我國的優(yōu)勢白粉病病原菌[2]。P. xanthii已發(fā)現(xiàn)有11個生理小種，分別是生理小種0、1、2U.S、2France、3、4、5、N1、N2、N3和N4，E. cichoracearum目前有2個生理小種Race0和Race1W。截至2022年，我國瓜類育種工作者分別在甘肅[3-6]、貴州[7]、廣西[8]、河南[9]、北京[10]、黑龍江[2，11-12]、陜西[13]、內(nèi)蒙古[14]、安徽[15]、湖南[16]等地開展白粉病菌種類及生理小種鑒定，發(fā)現(xiàn)國內(nèi)瓜類寄主上的白粉病病原菌均為單囊殼白粉菌（Podosphaera xanthii），但在不同地區(qū)致病生理小種有差異。主要的優(yōu)勢小種為2France和Race1，此外還存在N1、Race4，內(nèi)蒙古地區(qū)還發(fā)現(xiàn)一未知的生理小種。而目前關于云南昆明地區(qū)南瓜白粉病生理小種的鑒定還未見相關報道。

南瓜在云南邊遠山區(qū)發(fā)展中具有重要意義，明確昆明地區(qū)南瓜白粉病病原菌生理小種，對該地區(qū)白粉病防治及抗病育種具有重大意義。筆者通過病原菌形態(tài)觀察、分子鑒定以及13個白粉病甜瓜通用鑒別寄主侵染試驗，確定昆明地區(qū)南瓜白粉病菌種類及生理小種，為今后該地區(qū)白粉病防治及抗病育種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

采用國際通用的鑒別寄主：Iran H、Top mark、Vedrantais、PMR45、PMR5、MR29、Edisto47、PI414723、MR1、PI124111、PI124112、PMR6和Nantais Oblong，由北京大學現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究院提供。白粉病寄主選用易感病南瓜自交系（云瓜1號），由云南省農(nóng)業(yè)科學院園藝作物研究所保存。

南瓜感病自交系及13個國際通用鑒別寄主均種植在人工氣候箱，用于病原菌分離與鑒定。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離純化 2022年7月在昆明市團結(jié)鄉(xiāng)種植基地，于南瓜白粉病發(fā)病盛期采摘發(fā)病嚴重的南瓜葉片，吹去葉表的老孢子，用滅過菌的刷子輕輕將小孢子刷入瓶子中，滴加1～2滴Tween-20，隨后加入蒸餾水制成孢子懸浮液，采用血球計數(shù)法在顯微鏡下調(diào)整濃度為2.5×105～5.0×105個·mL-1。于幼苗2葉至3葉1心時，將孢子懸浮液噴灑在南瓜幼苗上，以葉面布滿孢子液又不流下為宜。隨后先將幼苗置于25 ℃黑暗條件下24 h，然后在28 ℃、6000 lx、濕度80%、12 h與20 ℃、0 lx、濕度80%，12 h條件下交替培養(yǎng)，直至白粉覆滿整個葉面。繼代5次，活體保存，即可用于后續(xù)試驗。

1.2.2 病原菌形態(tài)觀察 將純化后的病原菌孢子，輕輕抖落在載玻片上，滴加1滴3%KOH溶液，蓋上蓋玻片，在顯微鏡下觀察白粉病孢子中是否存在纖維狀體。制作3個玻片，對每個玻片至少在3個視野下觀察孢子形態(tài)。二孢白粉菌E. cichoracearum的分生孢子呈細長圓柱形，沒有纖維狀體。單囊殼白粉菌P. xanthii的分生孢子呈橢圓形，有發(fā)達的纖維狀體。

1.2.3 病原菌分子鑒定 用植物DNA提取試劑盒提取白粉病病原菌的DNA。利用真菌核糖體ITS區(qū)段通用引物ITS 1、ITS 4進行擴增，序列分別為5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’和5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。PCR 體系為20 μL：DNA模板0.5 μL，上下引物各1 μL，2×Taq Master Mix（Vazyme）10 μL，ddH2O 18.75 μL。PCR反應條件為預變性94 ℃，5 min；變性94 ℃，30 s，退火50 ℃，30 s，延伸72 ℃，45 s，35個循環(huán)；再延伸72 ℃，10 min。通過1%凝膠電泳檢測，純化后，送至擎科公司測序。將ITS序列放入NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）進行BLAST比對，并使用DNAMAN進行多序列比對分析，采用MEGA構建系統(tǒng)進化樹，用于構建系統(tǒng)進化樹的序列來源于NCBI核酸數(shù)據(jù)庫。

1.2.4 病原菌生理小種鑒定 將分離純化后的白粉病菌，接種在國際通用的13個甜瓜鑒別寄主上。采用隨機區(qū)組設計，每個品種3次重復，每個重復9株苗。接種時間、濃度、管理條件均與1.2.1一致。接種10 d后調(diào)查發(fā)病情況，每個重復超過2/3的接種葉片出現(xiàn)白色分生孢子層的為感??；所有接種葉片無癥狀或出現(xiàn)褐色壞死病斑的為抗病。寄主對不同生理小種的抗病、感病表現(xiàn)見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌形態(tài)

在顯微鏡下觀察純化后的白粉病菌孢子，結(jié)果如圖1所示，試驗中白粉病菌孢子為橢圓形，孢子內(nèi)有纖維狀體。因此，初步判斷該病原菌為單囊殼白粉菌P. xanthii 。

2.2 病原菌分子鑒定

以昆明地區(qū)白粉病菌DNA為模板，ITS1、ITS4為引物擴增，得到一條約530 bp的片段（圖2）。使用DNAMAN進行多序列比對分析，發(fā)現(xiàn)該南瓜白粉病菌與Podosphaera xanthii一致性高達99%（圖3）。使用MEGA構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明，樣本病原菌（KMPW01）的ITS序列與其他單囊殼白粉菌（P. xanthii）聚為一類，而Golovinomyces cichoracearum聚為一類，Leveillula taurica聚為一類。通過分子鑒定，進一步證明了昆明市團結(jié)鄉(xiāng)基地2022年度的南瓜白粉病菌種類為單囊殼屬白粉病菌（P. xanthii）。

2.3 病原菌生理小種鑒定

將純化后的白粉病菌接種至4葉1心的13個國際通用鑒別甜瓜寄主上，觀察其發(fā)病情況。觀察發(fā)現(xiàn)，接種后第10天，Nantais Oblong、PMR45、Iran H葉片出現(xiàn)病斑，第12天，Top mark、Vedrantais出現(xiàn)病斑；第15天，Nantais Oblong、PMR45、Iran H、Top mark、Vedrantais發(fā)病嚴重，其余均未發(fā)病。對比表1中的寄主抗感反應，初步確定昆明市團結(jié)鄉(xiāng)基地的白粉病生理小種為單囊殼白粉菌P. xanthii的2France。

3 討論與結(jié)論

目前關于區(qū)分P. xanthii和E. cichoracearum的方法，主要有形態(tài)鑒定和分子鑒定。形態(tài)鑒定通常通過光學顯微鏡觀察分生孢子子囊性狀及其是否具有纖維狀體，P. xanthii分生孢子呈橢圓形，且具有纖維狀體[10]。當上述方法不能區(qū)分二者時，可通過萌發(fā)管寬度來確定其種類，P. xanthii平均萌發(fā)管寬度是（4.3±1.16）μm，比E. cichoracearum的萌發(fā)管窄[17]。分子鑒定一般采用rDNA-ITS序列分析法。ITS序列存在于保守序列18S和28S之間，具有較高的多態(tài)性，表現(xiàn)為種內(nèi)相對一致，種間差異較大，且片段較小，可用于區(qū)分不同種屬的真菌。筆者通過形態(tài)鑒定和分子鑒定，發(fā)現(xiàn)昆明市團結(jié)鄉(xiāng)地區(qū)的白粉病菌分生孢子呈橢圓形，具有纖維狀體，其ITS序列與P. xanthii ITS序列一致性高達99%，對國際通用甜瓜鑒別寄主抗感反應與2France表現(xiàn)一致。因此，確定2022年度昆明市團結(jié)鄉(xiāng)地區(qū)的白粉病菌為P. xanthii的2France。

大部分研究認為，P. xanthii有11個生理小種可侵染瓜類作物，但是早在2006年，Mccreight[18]提出P. xanthii已分化出28個小種可致病。我國學者馬鴻艷等[12]、李書頡等[14]、包海清等[19]均在對白粉病生理小種鑒定時，發(fā)現(xiàn)了除11個小種以外的未知小種；此外，馬鴻艷等[9]還發(fā)現(xiàn)，同一地區(qū)連續(xù)2年的優(yōu)勢生理小種會發(fā)生變化甚至消失。這些可能是白粉病菌基因組內(nèi)存在著大量的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，從而使白粉病菌變異速度很快導致的，但具體原因還需要更進一步的探究。

綜上所述，筆者通過病原菌孢子形態(tài)觀察、分子鑒定及國際通用的甜瓜白粉病生理小種鑒別寄主與標準鑒定體系，確定2022年度昆明市團結(jié)鄉(xiāng)地區(qū)的白粉病菌為P. xanthii的2France，但病原物在與寄主互作的過程中種類或生理小種類型可能發(fā)生變異，需對同一地區(qū)白粉病菌連年進行觀察，探索其種類和變化規(guī)律，為南瓜白粉病防治奠定理論基礎。

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