不同果型西瓜單倍體誘導(dǎo)技術(shù)優(yōu)化

戴玉娟 龔詩琦 孫翔宇 陳浩杰 熊程 孫小武 戴思慧

摘? ? 要：西瓜未受精子房離體培養(yǎng)是誘導(dǎo)單倍體的有效方法，可縮短育種時(shí)間。為建立高效穩(wěn)定的單倍體誘導(dǎo)體系，提高單倍體誘導(dǎo)率，以大果型品種雪龍1號(hào)、雪龍3號(hào)，中果型品種早蜜、紅都2號(hào)和小果型品種小玉9號(hào)和黃小玉的6個(gè)雜交一代（2n=2x=22）西瓜的未受精子房為試驗(yàn)材料，研究不同植物生長調(diào)節(jié)劑種類和質(zhì)量濃度對(duì)西瓜單倍體誘導(dǎo)率的影響。結(jié)果表明，6個(gè)不同基因型品種在2 mg·L-1 6-BA+1 mg·L-1 NAA和2 mg·L-1 6-BA+2 mg·L-1 NAA的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中均能誘導(dǎo)出胚狀體，除黃小玉以外，均獲得了單倍體再生植株；其中，紅都2號(hào)的胚狀體誘導(dǎo)率最高，達(dá)63.89%；其次是早蜜，誘導(dǎo)率為55.56%。

關(guān)鍵詞：西瓜；植物生長調(diào)節(jié)劑；單倍體誘導(dǎo)

中圖分類號(hào)：S651 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1673-2871（2024）01-018-07

Optimisation of haploid induction techniques in watermelon with different fruit types

DAI Yujuan， GONG Shiqi， SUN Xiangyu， CHEN Haojie， XIONG Cheng， SUN Xiaowu， DAI Sihui

（Engineering Research Center for Horticultural Crop Germplasm Creation and New Variety Breeding， Ministry of Education/College of Horticulture， Hunan Agricultural University ， Changsha 410128， Hunan， China）

Abstract： Unfertilized ovary culture of watermelon is an effective method to induce haploids， which can shorten the breeding time. In order to establish an efficient and stable haploid induction system and improve the haploid induction rate， the unfertilized ovaries of six watermelon hybrids（2n=2x=22）of large-fruited variety Xuelong 1 and Xuelong 3， medium-fruited variety Zaomi， Hongdu 2， and small-fruited variety Xiaoyu 9， Huangxiaoyu were used as experimental materials. The effects of different plant growth regulators on the haploid induction rate of watermelon were studied . The results showed that six different genotypes of watermelon were induced in the induction medium 2 mg·L-1 6-BA+1 mg·L-1 NAA， 2 mg·L-1 6-BA + 2 mg·L-1 NAA， and haploid regeneration plants were obtained except for Huangxiaoyu. Among them， Hongdu 2 had the highest induction rate of 63.89%， followed by Zaomi with an induction rate of 55.56%.

Key words： Watermelon; Plant growth regulator; Haploid induction

西瓜（Citrullus lanatus）是中國重要的園藝作物，也是夏季主要的消暑果品之一，在全世界廣泛種植。傳統(tǒng)的西瓜育種周期長，很難產(chǎn)生突破性品種，獲得純合自交系需要6代以上，而雙單倍體育種只需要2代。利用單倍體技術(shù)還能迅速獲得個(gè)體完全純合的雙單倍體群體，為遺傳分析、分子標(biāo)記和數(shù)量性狀分析提供理想材料。但西瓜單倍體的自然發(fā)生率低[1]，雌核離體培養(yǎng)是一個(gè)有效的途徑。

目前單倍體誘導(dǎo)技術(shù)已在黃瓜[2-3]、南瓜[4-5]、大蔥[6]、洋蔥[7]等蔬菜作物上廣泛應(yīng)用，在西瓜[8-13]上的應(yīng)用也有報(bào)道，并已建立完整的誘導(dǎo)體系。Zou等[9]以中果型西瓜品種早佳為供體，通過雌核發(fā)育途徑獲得了西瓜單倍體植株，胚狀體誘導(dǎo)率最高為20.67%，并選取了50株再生植株進(jìn)行倍性鑒定，單倍體率為96%，二倍體率為4%，未發(fā)現(xiàn)四倍體與嵌合體。龔思等[10]以中果型西瓜早佳的未受精子房為試材，對(duì)影響西瓜未受精子房離體培養(yǎng)的條件進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)單倍體胚狀體誘導(dǎo)率為21.33%；其中單倍體率97%、二倍體率3%，這與Zou等[9]在西瓜單倍體培養(yǎng)試驗(yàn)中再生植株的倍性鑒定結(jié)果基本一致。李玲等[11]以大果型西瓜品種西農(nóng)9號(hào)和小果型西瓜品種早春紅玉、小綠黃為供體，芽點(diǎn)誘導(dǎo)率最高為17.2%，僅早春紅玉獲得了再生植株。李迎迎[12]以3個(gè)大果型和1個(gè)特大果型西瓜品種為試材，胚狀體誘導(dǎo)率最高僅1.67%，且未獲得單倍體再生植株。目前未見到以大、中、小3種果型在相同植物生長調(diào)節(jié)劑配方中均能誘導(dǎo)出單倍體植株的報(bào)道，且西瓜未受精子房誘導(dǎo)單倍體的研究所采用的主要材料大多為單一果型品種，雖已獲得再生單倍體植株，但誘導(dǎo)率仍然較低[8-13]。

針對(duì)上述問題，筆者以6個(gè)不同基因型的大、中、小果型西瓜品種為試材，研究不同植物生長調(diào)節(jié)劑種類和質(zhì)量濃度對(duì)西瓜單倍體誘導(dǎo)率的影響，并對(duì)獲得的再生植株進(jìn)行了倍性鑒定，以期篩選到能夠誘導(dǎo)大、中、小3種果型的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，建立高效穩(wěn)定的西瓜單倍體誘導(dǎo)體系，為西瓜單倍體育種提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料包括大果型西瓜品種雪龍1號(hào)、雪龍3號(hào)，中果型西瓜品種早蜜、紅都2號(hào)和小果型西瓜品種小玉9號(hào)、黃小玉，品種均為雜交一代材料（2n=2x=22），由湖南雪峰種業(yè)責(zé)任有限公司提供，材料特點(diǎn)見表1和圖1。試驗(yàn)于2022年3月至2023年6月在湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院實(shí)驗(yàn)室及金山基地進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 未受精子房離體培養(yǎng)與植株再生 參照Zou等[9]的方法進(jìn)行子房處理。在第2朵雌花開放后采收子房，開花前一天17：00套袋，開花當(dāng)天08：00前取回，取回的材料立即處理或放在4 ℃冰箱保存。首先去掉子房的花蕾和花莖，并沖洗干凈表面的絨毛；然后用75%的乙醇消毒1 min、蒸餾水沖洗3次后，將子房去皮，切成1 mm左右的切片；再用1%的次氯酸鈉溶液消毒1 min，蒸餾水沖洗4次；最后將切片放在無菌濾紙上吸干水分，接種至誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將中果型早蜜的子房切片接種到M1～M10誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，研究不同培養(yǎng)基配方對(duì)早蜜胚狀體誘導(dǎo)率的影響。將6個(gè)不同基因型的子房切片接種到M1、M7、M8、M9、M10等5個(gè)誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，研究不同基因型對(duì)胚狀體誘導(dǎo)率的影響。每個(gè)處理接種3瓶并設(shè)置3次重復(fù)，每瓶接種20片。

前4 d將接種后的培養(yǎng)瓶放在33 ℃的黑暗環(huán)境下進(jìn)行熱激處理，第5 天轉(zhuǎn)至培養(yǎng)室中培養(yǎng)，溫度為25 ℃，光周期為16 h/8 h（光/暗）。經(jīng)過14 d的誘導(dǎo)培養(yǎng)，將子房切片轉(zhuǎn)至分化培養(yǎng)基中，大約35 d誘導(dǎo)出胚狀體，胚狀體誘導(dǎo)率/%=出胚數(shù)/接種片數(shù)×100。最后將有明顯形態(tài)學(xué)上端和下端的胚狀體轉(zhuǎn)至MS培養(yǎng)基中，直至生長成完整的再生植株。再生植株率/%=完整再生植株數(shù)/出胚數(shù)×100。

單倍體誘導(dǎo)過程中的具體培養(yǎng)基配方見表2。

1.2.2 流式細(xì)胞儀檢測 用刀片取0.5 cm2的再生植株幼葉，置于培養(yǎng)皿中，取400 μL Partec CyStain UV Precise P裂解沖液涂在葉片周圍，用刀片將葉片切碎，充分提取出完整的細(xì)胞核，提取時(shí)間約為10 s，隨后用后30 μm濾網(wǎng)過濾至樣品管中，再用1600 μL的Partec CyStain UV Precise P染液染色10 s，最后用Partec CyFlow Space檢測懸浮液的核DNA相對(duì)含量。樣本峰值的熒光強(qiáng)度X-Mean（橫坐標(biāo)）與細(xì)胞DNA含量成正比，所以由各樣本X-Mean之間的比例關(guān)系判斷倍性。用二倍體（2n=2x=22）的西瓜植株為參考標(biāo)準(zhǔn)，將對(duì)照的二倍體峰調(diào)整在橫坐標(biāo)100位置，則單倍體峰值會(huì)出現(xiàn)在50，而峰值在200位置的則為四倍體。圖形的縱坐標(biāo)代表細(xì)胞數(shù)量，峰的高低反映了細(xì)胞比例的不同。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 26.0與Excel 2019軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 胚狀體發(fā)育及誘導(dǎo)成苗過程

子房切片在33 ℃的黑暗環(huán)境下熱激4 d后，胚珠明顯膨大（圖2-a），再經(jīng)過5 d的光照培養(yǎng)，膨大的胚珠變綠（圖2-b）。培養(yǎng)35 d左右，胚狀體長出明顯的形態(tài)學(xué)上端和下端（圖2-c）時(shí)轉(zhuǎn)接至MS生根培養(yǎng)基中，生長成完整的再生植株（圖2-d）。

2.2 不同培養(yǎng)基配方對(duì)早蜜胚狀體誘導(dǎo)率的影響

由表3可知，早蜜在不同培養(yǎng)基配方中胚狀體誘導(dǎo)率由高到低依次為M9>M10>M1>M7>M8>M2>M3、M4>M5、M6，其中M9配方胚狀體誘導(dǎo)率最高，達(dá)49.44%，與其余9個(gè)配方呈顯著差異；選用5個(gè)誘導(dǎo)效果較好的培養(yǎng)基配方進(jìn)行下一步試驗(yàn)，即M1、M7、M8、M9、M10。

2.3 不同基因型對(duì)西瓜未受精子房胚狀體誘導(dǎo)率的影響

由表4可知，所選用的6個(gè)不同基因型材料都能誘導(dǎo)出胚狀體，但不同基因型之間的胚狀體誘導(dǎo)率存在較大差異，在0～63.89%之間。大果型雪龍1號(hào)和雪龍3號(hào)胚狀體誘導(dǎo)率最高分別為6.11%和8.89%；中果型紅都2號(hào)和早蜜的誘導(dǎo)率最高分別為63.89%和55.56%；小果型小玉9號(hào)和黃小玉的胚狀體誘導(dǎo)率最高分別為1.11%和2.22%。整體來看，中果型品種胚狀體誘導(dǎo)率較高，其次是大果型品種，小果型品種的誘導(dǎo)率最低，其中黃小玉僅在M9和M10培養(yǎng)基上成功誘導(dǎo)出胚狀體。

2.4 不同植物生長調(diào)節(jié)劑配方對(duì)西瓜未受精子房胚狀體誘導(dǎo)率的影響

由表4可知，5種誘導(dǎo)培養(yǎng)基均能誘導(dǎo)出胚狀體，其中M9和M10能誘導(dǎo)出大、中、小3種果型的胚狀體，但胚狀體誘導(dǎo)率差異大。大果型品種雪龍1號(hào)在M10中胚狀體誘導(dǎo)率最高（6.11%），雪龍3號(hào)在M9中胚狀體誘導(dǎo)率最高（8.89%），但均與其他誘導(dǎo)培養(yǎng)基之間無顯著差異。中果型品種紅都2號(hào)在M10中胚狀體誘導(dǎo)率最高，達(dá)63.89%，M9中誘導(dǎo)率為43.80%，均與M1、M7、M8培養(yǎng)基呈顯著差異；中果型品種早蜜在M9中胚狀體誘導(dǎo)率最高，達(dá)55.56%，M10中胚狀體誘導(dǎo)率為35.56%，均與其他誘導(dǎo)培養(yǎng)基呈顯著差異。小果型品種小玉9號(hào)、黃小玉在M9中的胚狀體誘導(dǎo)率分別為1.11%和2.22%，均與其他誘導(dǎo)培養(yǎng)基無顯著差異。

2.5 胚狀體成苗情況

通過對(duì)胚狀體后期生長狀況的觀察與記錄，發(fā)現(xiàn)部分發(fā)育不完全的胚狀體（圖3），包括無生長點(diǎn)植株、黃化苗、玻璃化植株和生長緩慢植株4種類型。共成功誘導(dǎo)胚狀體517個(gè)，產(chǎn)生完整再生植株233株，再生植株率為45.07%，見表5。整體來看，2個(gè)中果型品種在5個(gè)再生培養(yǎng)基上均能獲得完整的再生植株，再生植株率較高，其中早蜜的再生植株率在36.36%～52.00%，紅都2號(hào)的再生植株率在11.11%～60.00%；大果型和小果型品種雖有一定的再生植株率，但本身出胚數(shù)較少，再生植株率沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的意義。

2.6 流式細(xì)胞儀倍性鑒定

對(duì)得到的233株再生植株，利用流式細(xì)胞儀對(duì)其中的50株進(jìn)行倍性鑒定（圖4）。結(jié)果表明，47株為單倍體，3株為二倍體，單倍體率為94%。

3 討論與結(jié)論

基因型已被證明是許多植物未受精子房離體培養(yǎng)的關(guān)鍵因素，如黃瓜[14-17]、南瓜[5、18]、西葫蘆[19-21]等。在西瓜中，也有研究表明，基因型是影響雌核發(fā)育的關(guān)鍵[10-12]，不同基因型的西瓜胚狀體誘導(dǎo)率在1.67%～21.33%。在本研究中，筆者所選用的6個(gè)不同的基因型都誘導(dǎo)出了胚狀體，但不同基因型之間的胚狀體誘導(dǎo)率差異較大。在M9誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，大果型西瓜品種雪龍1號(hào)和雪龍3號(hào)的誘導(dǎo)率分別為4.44%和8.89%，雪龍3號(hào)的誘導(dǎo)率是雪龍1號(hào)的2倍；中果型西瓜品種早蜜的誘導(dǎo)率最高（55.56%），紅都2號(hào)次之（43.80%），早蜜的誘導(dǎo)率比紅都2號(hào)高11.76個(gè)百分點(diǎn)；但小果型品種小玉9號(hào)和黃小玉的誘導(dǎo)率均偏低，分別為1.11%和2.22%。由此可見，中果型西瓜品種的胚狀體誘導(dǎo)率均比大果型和小果型高，不同基因型的胚狀體誘導(dǎo)率存在顯著差異，也進(jìn)一步說明基因型是影響西瓜未受精子房培養(yǎng)誘導(dǎo)胚狀體的關(guān)鍵因素，與前人的研究結(jié)果一致。龔思等[10]以中果型西瓜早佳未受精子房為試材，對(duì)西瓜未受精子房的胚狀體誘導(dǎo)率進(jìn)行了研究，最高胚狀體誘導(dǎo)率為21.33%；而本研究中紅都2號(hào)的胚狀體誘導(dǎo)率最高為63.89%，是早佳的3倍。

前人研究結(jié)果表明，不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基的胚狀體誘導(dǎo)率差異顯著，植物生長調(diào)節(jié)劑在胚狀體誘導(dǎo)中發(fā)揮了重要作用[9-10，22-23]。Zou等[9]在西瓜未受精子房培養(yǎng)中選用中果型西瓜品種早佳和黑媚娘，在MS+3 mg·L-1 2， 4-D+2 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 NAA誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，早佳的胚狀體誘導(dǎo)率最高，為20.67%，黑媚娘的誘導(dǎo)率為14.72%，而在MS+3 mg·L-1 2，4-D+1 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 NAA中，早佳和黑媚娘胚狀體誘導(dǎo)率僅為1.67%和6.94%，說明不同植物生長調(diào)節(jié)劑的添加量是重要因素。在筆者的研究中，M9（MS+2 mg·L-1 6-BA+1 mg·L-1 NAA）和M10（MS+2 mg·L-1 6-BA+2 mg·L-1 NAA）是西瓜未受精子房誘導(dǎo)單倍體的最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基，6個(gè)不同基因型的西瓜品種在M9和M10誘導(dǎo)培養(yǎng)基中都能誘導(dǎo)出胚狀體，當(dāng)使用不同的誘導(dǎo)培養(yǎng)基時(shí)，胚狀體誘導(dǎo)率有顯著差異。以中果型為例，紅都2號(hào)在M10誘導(dǎo)培養(yǎng)基中胚狀體誘導(dǎo)率最高，達(dá)63.89%，誘導(dǎo)率是M1的10倍；而早蜜在M9誘導(dǎo)培養(yǎng)基中效果最好（55.56%）。本研究中，紅都2號(hào)在M7（MS+1 mg·L-1 2，4-D+2 mg·L-1 6-BA+1 mg·L-1 NAA）誘導(dǎo)培養(yǎng)基的培養(yǎng)下，胚狀體誘導(dǎo)率僅為6.67%，可能是添加了2，4-D的原因，這與榮文娟等[13]在未受精胚珠培養(yǎng)萌發(fā)的研究結(jié)果一致，認(rèn)為2，4-D能有效促進(jìn)愈傷組織生長，但得到的愈傷組織難以分化。

在筆者的研究中，共獲得了233株再生植株，這是西瓜單倍體育種的一個(gè)很大突破。筆者利用流式細(xì)胞儀對(duì)50株再生植株進(jìn)行倍性鑒定，結(jié)果表明，47株為單倍體，3株為二倍體，單倍體率為94%。在研究過程中，盡管篩選到了能夠誘導(dǎo)大、中、小果型胚狀體的培養(yǎng)基，但大果型和小果型品種的胚狀體誘導(dǎo)率和再生植株率偏低，可能與基因型、誘導(dǎo)培養(yǎng)基所添加的植物生長調(diào)節(jié)劑的種類和濃度有關(guān)，且小果型品種黃小玉未獲得再生單倍體植株。下一步，筆者一方面將調(diào)整植物生長調(diào)節(jié)劑的種類和濃度，以提高大、小果型品種的胚狀體誘導(dǎo)率；另一方面，根據(jù)流式細(xì)胞儀倍性鑒定的結(jié)果，筆者將利用化學(xué)藥劑（秋水仙素、氨磺樂靈等）對(duì)獲得的西瓜單倍體再生植株進(jìn)行染色體加倍，以獲得雙單倍體植株。

綜上所述，筆者篩選到了適合大、中、小果型的西瓜單倍體誘導(dǎo)培養(yǎng)基，提高了西瓜單倍體誘導(dǎo)率，并獲得了除黃小玉外的單倍體再生植株。研究結(jié)果對(duì)提高西瓜育種效率具有重要意義，有助于推進(jìn)西瓜育種發(fā)展，為西瓜單倍體育種提供技術(shù)支持。

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