基于腸道菌群調(diào)節(jié)研究桂枝加葛根湯治療頸型頸椎病家兔作用機(jī)制

秦宇航

南京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院·養(yǎng)生康復(fù)學(xué)院，江蘇 南京 210023

頸型頸椎病（NTCS）是頸椎病的初期形態(tài)，為其他各型頸椎病早期的共同表現(xiàn)，以頸肩疼痛為主癥。此病極為常見，約占頸椎病總發(fā)病率65.52%，影響范圍廣且呈低齡化趨勢[1]?！秱摗饭鹬痈鸶鶞捎谏朴i項強(qiáng)痛諸癥，被臨床廣泛用于治療NTCS 并取得了公認(rèn)效果。既往文獻(xiàn)多從活血化瘀和疏經(jīng)通絡(luò)等方面對桂枝加葛根湯治療NTCS 的機(jī)制加以闡述[2]，筆者經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，NTCS 之產(chǎn)生實與脾胃功能聯(lián)系密切，桂枝加葛根湯可能通過調(diào)節(jié)腸道菌群（IF）而實現(xiàn)對NTCS 的治療作用。本研究基于IF調(diào)節(jié)探討桂枝加葛根湯治療NTCS 家兔的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF 級6 月齡家兔[家兔購自南京中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，動物許可證號：SYXK（蘇）2018-0049]9 只，雌雄不限，體質(zhì)量2.5～3.0 kg。按清潔級的要求飼養(yǎng)，自由進(jìn)食。本實驗經(jīng)由南京中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會審核并批準(zhǔn)（審批號：20211116）。

1.2 主要藥品桂枝加葛根湯藥液（葛根12 g，桂枝、生白芍、生姜各9 g，紅棗12 枚，炙甘草6 g，按此劑量比例準(zhǔn)備藥材，用純凈水浸泡1 h，武火煮沸藥湯后，繼續(xù)文火煎煮30 min，去除藥渣，制成含生藥1 g/mL 的濃縮液，在4 ℃環(huán)境下保存?zhèn)溆茫?5%番瀉葉水煎液（桂枝加葛根湯藥液及番瀉葉水煎液均由南京仙林醫(yī)院藥房提供）。

3%戊巴比妥鈉（北京化學(xué)試劑公司，批號：AM00469）、4%多聚甲醛（武漢賽維爾生物科技有限公司，批號：CR2209049）；糞便DNA 提取試劑盒（天根：DP328-02）、Hieff NGS Ultima Pro DNA Library Prep Kit 全能型DNA 建庫試劑盒（YEASEN：2197ES96） 、 Hieff NGS Tagment Index Kit for Illumina（YEASEN： 12416ES97）； 血管活性腸肽（VIP）、神經(jīng)肽Y（NPY）、脂多糖（LPS）的酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）檢測試劑盒（規(guī)格：48T）及其相應(yīng)抗體。以上試劑及藥品均由江蘇安蒂默生物科技有限公司提供。

1.3 主要器材離心機(jī)（Eppendorf）、酶標(biāo)儀（Biotek ELX800）、超低溫冰箱（Eppendorf）、電泳儀（北京六一）、便攜式X 射線成像儀（平生醫(yī)療科技有限公司）。

1.4 分組將全部家兔以體質(zhì)量編號，再按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分成空白組、模型組、桂枝加葛根湯組（中藥組），共3 組，每組各3 只。空白組不造模，其余2 組均制成脾虛證NTCS 家兔模型。

1.5 動物模型建立

1.5.1 脾虛證家兔模型經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，參考文獻(xiàn)[3]，每隔1 d 予以模型家兔15%番瀉葉水煎液，按20 mL/kg 體質(zhì)量灌胃，共14 次，持續(xù)28 d，即可形成家兔脾虛證模型。

1.5.2 NTCS 家兔模型以低頭位寒濕刺激法[4]建立NTCS 家兔模型，具體操作方法如下：用剪毛器剔去家兔頸部毛發(fā)，置于自制家兔固定盒中，通過兔盒的卡槽式設(shè)計，使家兔維持低頭屈曲45°位，后頸部肌肉呈牽拉狀態(tài)，并敷以冰袋。固定完畢后，將吹風(fēng)機(jī)調(diào)至5 級給予兔頸部冷風(fēng)刺激。每次2 h，每天2 次，共4 h，造模周期為28 d。每次造模松解后置家兔于相應(yīng)籠中自由飼養(yǎng)，正常飲食。

NTCS 造模與脾虛證造模同時進(jìn)行，同時結(jié)束。造模結(jié)束后第1 天進(jìn)行模型評估：①模型家兔頸后肌肉組織出現(xiàn)痙攣、僵硬，或有明顯條索狀物觸及。②以便攜式X 射線成像儀對模型家兔進(jìn)行頸椎正側(cè)位攝片檢查，顯示有頸椎曲度變直、椎體緣增生或椎間隙狹窄改變。③模型家兔出現(xiàn)精神倦怠、飲食減少、拱背、大便稀溏、肛周污穢等表現(xiàn)。同時滿足上述3 項標(biāo)準(zhǔn)者，可認(rèn)為造模成功，不合格者予以剔除。

1.6 給藥方法從確認(rèn)所有家兔造模成功后第1 天開始，每天給藥1 次，連續(xù)給藥7 d。①空白組和模型組不予給藥，任其自主發(fā)展。②根據(jù)人兔給藥換算公式計算，中藥組以桂枝加葛根湯藥液按10 mL/kg灌胃。

1.7 觀察指標(biāo)與檢測方法于給藥結(jié)束后處死全部動物，進(jìn)行指標(biāo)檢測。

1.7.1 IF 的16SrRNA 基因高通量測序分析采集待測家兔新鮮的糞便樣品，置于滅菌的Eppendorf 管中，放置于-80 ℃冰箱保存。分別檢測家兔糞便中IF的種類和豐度，操作如下：以DNA 提取試劑盒提取家兔糞便樣本DNA。然后使用相應(yīng)引物對16SrRNA V3-V4 特異性基因片段區(qū)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增條件：98 ℃預(yù)變性1 min；隨后98 ℃變性10 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共計擴(kuò)增30 個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。繼之使用1.8%瓊脂糖凝膠對PCR 產(chǎn)物片段進(jìn)行篩選，檢測合格的產(chǎn)物在Illumina Hiseq 平臺上進(jìn)行文庫構(gòu)建及基因測序。然后利用相關(guān)軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接、過濾、聚類和比對，從而獲得菌群豐度差異。

1.7.2 直腸、迷走神經(jīng)、下丘腦和頸交感干中各神經(jīng)肽檢測①維持家兔麻醉狀態(tài)，在冰臺上立即展開無菌解剖。于距肛門0.5 cm 處切取直腸1 cm；于左頸動脈鞘內(nèi)切取迷走神經(jīng)及頸交感神經(jīng)各1 cm；繼以咬骨鉗夾出C3～5椎間盤組織；開顱切取下丘腦；最后剝離并切取左側(cè)斜方肌。所有標(biāo)本置于4%多聚甲醛溶液中，保存于-20 ℃低溫冰箱。②以ELISA 法行上述各組織中VIP、NPY 含量檢測。取上述各組織樣本適量，常溫后裂解勻漿，按照檢測試劑盒說明步驟嚴(yán)格操作，在酶標(biāo)儀上讀取OD 值，最后導(dǎo)出數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.7.3 斜方肌和C3～5椎間盤組織中LPS 檢測以ELISA 法進(jìn)行檢測，方法同上，嚴(yán)格按說明書操作。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法所有數(shù)據(jù)資料采用SPSS24.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析。計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，進(jìn)行方差分析及LSD-t檢驗；數(shù)據(jù)相關(guān)性檢驗采用Pearson 分析。設(shè)定α=0.05，P＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況空白組如常。模型組與中藥組家兔經(jīng)脾虛證NTCS 造模后，未見死亡，經(jīng)評估合格全部納入實驗對象。

2.2 各組IF 豐度比較見表1。正常家兔體內(nèi)幾乎所有IF 均可以歸屬為厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門和放線菌門4 大類，其中又以厚壁菌門和擬桿菌門占主體地位。經(jīng)脾虛造模后，模型組與空白組厚壁菌門與擬桿菌門的豐度，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示家兔IF 失調(diào)已形成。經(jīng)給藥后，中藥組與模型組此2 種菌群豐度比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示中藥能有效改變菌群豐度，恢復(fù)正常的厚壁菌/擬桿菌比例。變形菌門和放線菌門豐度于實驗前后比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），其病理影響可以忽略。

表1 各組IF 豐度比較

2.3 各組直腸、迷走神經(jīng)、下丘腦和頸交感干中VIP、NPY 含量比較見表2。與空白組比較，模型組VIP 和NPY 在直腸、迷走神經(jīng)、下丘腦和頸交感神經(jīng)干中的含量均明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，中藥組各相應(yīng)組織內(nèi)的VIP 和NPY 含量均顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 各組直腸、迷走神經(jīng)、下丘腦、頸交感干中VIP、NPY 含量比較 ng/mL

2.4 各組斜方肌、椎間盤中LPS 含量比較見表3。與空白組比較，模型組斜方肌和椎間盤內(nèi)的LPS 含量均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，中藥組頸周組織內(nèi)的LPS 含量均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 各組斜方肌、椎間盤中LPS 含量比較（EU/L）

2.5 IF 豐度與各組織中VIP、NPY 及LPS 水平的相關(guān)性Pearson 分析見圖1、圖2 及圖3。各相應(yīng)組織中VIP、NPY 及LPS 的水平變化與厚壁菌群豐度呈正相關(guān)性（P＜0.01），而與擬桿菌群豐度呈負(fù)相關(guān)性（P＜0.05）。

圖1 IF 豐度與NPY

圖2 IF 豐度與VIP

圖3 IF 豐度與LPS

3 討論

頸椎病之本，實則本于脾胃?！端貑枴ねㄔu虛實論》 云：“頭痛耳鳴，九竅不利，腸胃之所生也?！薄鹅`樞·口問》云：“故上氣不足，腦為之不滿，耳為之苦鳴，頭為之苦傾，目為之眩?！薄端貑枴そ?jīng)脈別論》云：“飲入于胃，游溢精氣，上輸于脾，脾氣散精，上歸于肺?！本鞔_指出頭痛眩暈等病癥的主要原因是由胃腸失和、“上氣不足”引起。頭為諸陽之會，五臟六腑精氣均通過經(jīng)絡(luò)上注于頭，頭頸部正常生理功能的發(fā)揮皆有賴于脾之“升清”作用而實現(xiàn)?！镀⑽刚摗と乖獨馑ネ吩疲骸吧蠚獠蛔恪巳鏆馑v，皆由脾胃先虛，而氣不上行之所致也?！盵5]進(jìn)一步說明中氣虧虛、脾不升清是引發(fā)頭項強(qiáng)痛的根本原因。因此，NTCS 雖然名為頸椎病變，臨證亦有若干分型，但其證仍以脾虛為本，其治當(dāng)以健脾和胃、益氣升清為法。

IF 寄生在宿主的腸道之中，與宿主的消化功能休戚相關(guān)，IF 失調(diào)即意味著胃腸道消化功能出現(xiàn)了紊亂[6]。因此，本實驗中保持家兔脾虛腹瀉狀態(tài)，以便觀測IF 失調(diào)對NTCS 發(fā)病的影響。VIP 與NPY 均為神經(jīng)遞質(zhì)，其合成和分泌受IF 的重要調(diào)節(jié)，這些肽類物質(zhì)均能影響血管舒縮并能誘導(dǎo)組織的免疫炎癥反應(yīng)[7-8]；LPS 為細(xì)菌內(nèi)毒素，同樣具有強(qiáng)烈的致炎性。故實驗選取此三者作為IF 失調(diào)后產(chǎn)生的炎癥信號指標(biāo)。脾胃虛弱不能升清降濁則水谷精氣不能上承頭頸部而致痛，相當(dāng)于IF 失調(diào)產(chǎn)生代謝紊亂，由此生成的炎癥信號等可上傳至頭頸部而促進(jìn)發(fā)病。本實驗結(jié)果則證明了這一觀點，即IF 失調(diào)確與NTCS 存在密切相關(guān)性：在NTCS 的發(fā)病過程中，由于IF 失調(diào)顯著提升了模型組腸道、迷走神經(jīng)、下丘腦和頸交感神經(jīng)內(nèi)VIP、NPY 及頸周組織中LPS 的含量（P＜0.05），使源自于腸道內(nèi)的損傷信號上傳至頸部，進(jìn)而引發(fā)或加劇了頸部軟組織諸如斜方肌和頸椎間盤的免疫炎癥反應(yīng)，見表2、表3、圖1。而桂枝加葛根湯組則呈現(xiàn)了顯著的IF 調(diào)節(jié)作用（P＜0.05），即通過恢復(fù)正常菌群比例，抑制VIP、NPY及LPS 等有害信號在相應(yīng)部位內(nèi)上傳，從而消除頸周軟組織的炎癥以止痛。本實驗中所觀察到的這種通過腸道→迷走神經(jīng)→下丘腦→頸交感神經(jīng)的炎癥信號上傳途徑實際上是對已知存在的腸-腦軸之深化和延續(xù)，可以稱之為菌-腸-腦-頸交感軸。

腸-腦軸作為公認(rèn)的腸道與腦之間的信息交換渠道，為IF 失調(diào)影響NTCS 奠定了既有的物質(zhì)基礎(chǔ)和靶向通路。同時，中醫(yī)的經(jīng)絡(luò)學(xué)說也為菌-腸-腦-頸交感軸的存在提供了理論依據(jù)?！鹅`樞·經(jīng)脈》云：“（足陽明胃經(jīng)）其支者，從大迎前，下人迎，循喉嚨，入缺盆，下膈，屬胃，絡(luò)脾?！北砻髯汴柮魑附?jīng)支脈循行經(jīng)過了腹部與頸部，提示腸道與頸部的病理變化確有聯(lián)系。而菌-腸-腦-頸交感軸恰與胃經(jīng)支脈的循行路線相符，說明該通路亦應(yīng)具有調(diào)節(jié)腸-頸功能的作用，可視為胃經(jīng)支脈物化的代表。

桂枝加葛根湯之所以能對以NTCS 為代表的頸肩痛癥取得良好效果，歷千年而不衰，堪為后世圭皋，其中一個重要原因就是它實際上揭示了脾胃與頸椎之間的密切聯(lián)系，即脾胃功能深刻影響著頸項部的病理變化，這也是為什么通過調(diào)節(jié)IF 能治療NTCS 的理論基礎(chǔ)。如果說活血化瘀、祛風(fēng)除濕或者補(bǔ)益肝腎才是NTCS 的主導(dǎo)治法，醫(yī)圣為何舍桃仁、紅花、川芎之通絡(luò)，棄熟地黃、山萸肉、山藥之滋補(bǔ)，而全部以歸脾、胃二經(jīng)的葛根、桂枝、白芍，甘草、姜、棗入藥？如果僅認(rèn)為桂枝湯意在疏通血脈，那加入葛根四兩之重又是何意？細(xì)審立方之旨，可見處處著眼于顧護(hù)脾胃之氣，通過升發(fā)中焦之清氣以愈頸項之痙攣掣痛。本課題從調(diào)節(jié)IF 角度分析了桂枝加葛根湯治療NTCS 的作用機(jī)制，豐富了經(jīng)方治病的理論內(nèi)涵，也為從脾胃出發(fā)防治頸椎病提供了新的實驗依據(jù)，希望未來有更多的研究關(guān)注于此。