豬UGT 1A1酶基因的克隆、表達及其對嘔吐毒素特異性降解的作用

賀衛(wèi)華 陳詩琪 王麗華 丁斕 翟曉虎 楊俊花

賀衛(wèi)華，陳詩琪，王麗華，等. 豬??? UGT 1A1??? 酶基因的克隆、表達及其對嘔吐毒素特異性降解的作用［J］. 江蘇農業(yè)學報，2023，39（8）：1722-1728.

doi：10.3969/j.issn.1000-4440.2023.08.012

收稿日期：2023-03-21

基金項目：江蘇農牧科技職業(yè)學院科研項目（NSF2023ZR06）；第二批國家級職業(yè)教育教師教學創(chuàng)新團隊課題研究項目（ZI2021100104）

作者簡介：賀衛(wèi)華（1982-），女，山西太谷人，碩士，副教授，主要從事動物毒理學研究。（E-mail）heweihua010@163.com

通訊作者：翟曉虎，（E-mail）zhaixiaohu010@163.com；楊俊花，（E-mail）yangjunhua303@126.com

摘要：為了在Sf9昆蟲細胞中表達豬尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶（UGT） 1A1蛋白并對其進行功能鑒定。首先，合成密碼子優(yōu)化的??? UGT 1A1??? 基因，克隆到載體pFastBacⅠ中，構建桿狀病毒重組轉移載體，然后導入DH10Bac中，獲得重組的穿梭質粒，再轉染Sf9細胞得到重組桿狀病毒，采用Western blotting方法鑒定重組后??? UGT??? ?1A1蛋白的表達；對鎳柱親和層析純化獲得目的蛋白酶的動力學參數(shù)及其對嘔吐毒素（DON）的代謝進行檢測。結果表明：pFastBac-UGT 1A1??? 質粒被成功構建，導入感受態(tài)細胞DH10Bac中獲得重組穿梭質粒Bacmid-UGT??? ?1A1，再轉染昆蟲細胞Sf9獲得重組Bacmid-UGT ????1A1蛋白，能夠與多組氨酸標簽單抗發(fā)生特異性反應。優(yōu)化目的蛋白表達，并對其體外代謝DON進行了酶學性質和動力學參數(shù)的研究。本研究通過基因克隆、表達和代謝產物的分析等技術手段獲得具有較好的生物活性且純化的Bacmid-UGT??? ?1A1蛋白，為揭示DON在肝臟中的代謝途徑、代謝產物和關鍵調控因子提供參考。

關鍵詞：嘔吐毒素（DON）；葡萄糖醛酸綴合物；尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶（UGT）；豬肝臟

中圖分類號：S852.23????? 文獻標識碼：A????? 文章編號：1000-4440（2023）08-1722-07

Expression and identification of porcine ????UGT 1A1??? ?gene and its special effect of degradation for deoxynivalenol

HE Wei-hua1 CHEN Shi-qi1 WANG Li-hua1 DING Lan1 ?ZHAI Xiao-hu1 YANG Jun-hua 2

（1.Jiangsu Agri-animal Husbandry Vocational College， Taizhou 225300，China；2.Institute for Agri-food Standards and Testing Technology，Shanghai Academy of Agricultural Sciences， Shanghai 201403，China）

Abstract：To express the porcine uridine diphosphate glucuronosyltransferase （UGT） 1A1 protein in Sf9 insect cells and characterize its function， the codon-optimized ????UGT 1A1??? ?gene was synthesized and cloned into pFastBacI vector to construct a recombinant baculovirus intermediate transfer vector. The vector was introduced into DH10Bac to obtain recombinant shuttling plasmid， which was used to transfect the Sf9 cells to get recombinant baculovirus. Expression of the recombinant UGT 1A1 protein was confirmed by Western blotting. Kinetic parameters of the target protease purified by nickel column affinity chromatography and its metabolism effect of deoxynivalenol （DON） were detected. The results showed that， the plasmid pFastBac-UGT 1A1was successfully constructed and was transducted into competent cells DH10Bac to obtain recombinant shuttling plasmid Bacmid-UGT 1A1. The recombinant shuttling plasmid was used to transfect Sf9 insect cells and obtained recombinant protein Bacmid-UGT 1A1， which was capable of taking specific reactions with His-tagged monoclonal antibodies. The optimal conditions for the target protein expression was screened， and the metabolism of DON in vitro was studied from the aspects of enzymatic properties and kinetic parameters. In this study， purified Bacmid-UGT 1A1 protein with good biological activities was obtained by technical methods such as gene clone and expression， analysis of metabolites， which provided references for revealing the metabolic pathways， metabolites and key regulatory factors of DON in the liver.

Key words：deoxynivalenol;glucuronic acid conjugate;uridine diphosphate glucuronosyltrans ferase （UGT）;porcine liver

真菌毒素是在適宜的溫度、濕度環(huán)境下，由真菌在糧食作物中產生的次級代謝產物，全球每年都因真菌毒素污染造成農產品及其加工制品質量降低，間接對畜禽和人類健康產生危害，每年造成的經(jīng)濟損失高達數(shù)百億美元。聯(lián)合國糧農組織統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，赭曲霉毒素、黃曲霉毒素、嘔吐毒素（Deoxynivalenol，DON）等在農產品里檢出率較高[1]。其中DON的污染不僅范圍廣而且頻率高，在日常生產中危害極大。因此，探索DON在生物機體內的轉化代謝、降解途徑和控制代謝的關鍵因子對畜禽健康和其加工制品的生物安全性及保護人類健康安全具有重大意義。

DON屬烯醇類化合物，其化學結構式中含有多個羥基，對細胞、腸道和腎臟等具有較強的毒性作用[2]。由于種屬差異性，豬對DON的耐受性低[3]。以往有研究發(fā)現(xiàn)，DON在動物腸道或瘤胃中發(fā)生脫環(huán)氧作用并代謝產生脫環(huán)氧DON（DOM1）[4]。有研究結果表明，由尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶（UGT）催化的葡萄糖醛酸結合反應，是DON在肝臟內代謝的主要途徑，代謝成為DON葡萄糖醛酸綴合物[5]。DON結構上的羥基結合葡萄糖醛酸后，親水性大大增強，從而使生物機體更容易代謝和排泄DON。UGT基因存在多態(tài)性，已有研究發(fā)現(xiàn)，人肝臟有19種UGT亞型，如??? UGT 1A1、UGT 1A3、UGT 2B7??? 和UGT 2B15??? 等[6]，豬有??? UGT 2B31、UGT 2B4、UGT 2A1、UGT 1AB3??? 等4種UGT亞型。有研究發(fā)現(xiàn)，由于UGT基因亞型不同，除去受生物年齡、種類和飲食方面的影響，不同基因亞型在機體中的表達也不同，以致于降解藥物、毒素的效應也各不相同[7]。肝臟作為DON的主要解毒器官，在豬體內是如何將DON代謝為葡萄糖醛酸綴合物及哪種UGT酶起主要作用，還未見報道[8]。因此，本實驗室前期通過豬原代肝臟細胞培養(yǎng)，攻DON毒后發(fā)現(xiàn)豬??? UGT 1A1??? 表達量高?；诖?，本試驗擬通過質粒構建、Bac-to-Bac重組表達系統(tǒng)完成豬肝臟中??? UGT 1A1??? 的克隆表達[9]，再通過超高效液相色譜-串聯(lián)質譜（UPLC-MS/MS）[10-11]等技術分析DON的葡萄糖醛酸代謝物來充分驗證關鍵酶的功能。本研究旨在探索豬體內真菌毒素DON降解的途徑，挖掘潛在的降解酶及其功能，為后期靶向性開發(fā)DON高效脫霉劑、保障中國畜牧業(yè)養(yǎng)殖安全提供基礎數(shù)據(jù)和新思路。

1? 材料與方法

1.1? 材料與試劑

DON標準品購自青島普瑞邦生物工程有限公司；PCR試劑盒、限制性內切酶和DNA連接酶等購自寶生物工程（大連）有限公司；DMEM培養(yǎng)基和胰酶等購買于賽默飛世爾科技公司；組氨酸標簽（His-tag）抗體購買于生工生物工程（上海）股份有限公司；質粒提取和膠回收試劑盒、Trizol試劑購買于天根生化科技有限公司；pFastBacTM 1購買于賽默飛世爾科技公司；Sf9細胞由上海市農業(yè)科學院動物傳染病預防與生物技術研究課題組提供。

本研究所用的主要儀器有：電泳凝膠成像系統(tǒng)，購自上海天能生命科學有限公司；微量紫外分光光度計，購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；蛋白質電泳儀、PCR儀、核酸檢測儀和多功能熒光酶標儀購自伯樂生命醫(yī)學產品（上海）有限公司；細胞培養(yǎng)箱購自賽默飛世爾科技公司；顯微鏡購自奧林巴斯（中國）有限公司；漩渦振蕩器購自艾卡（廣州）儀器設備有限公司；恒溫混勻器和超低溫冰箱購自艾本德（上海）國際貿易有限公司；電子天平購自梅特勒－托利多儀器（上海）有限公司等。

1.2? 引物設計和目的基因的擴增

根據(jù)NCBI（美國國立生物技術信息中心）已有豬??? UGT 1A1??? 的基因序列，設計與合成引物。用實驗室保存的新鮮豬原代肝細胞cDNA進行基因擴增。上游引物：5′-CATGTTGCTGGTGAACCAGAGCCACCAGGGCTT-3′，設計增加Bam HⅠ的酶切位點（用于酶切）以及包含ATG的起始密碼子；下游引物：5′-CGCTAGTGGGTCTTGCTCTTGTGGCTCTTCT-3′，在終止密碼子前加入連續(xù)編碼6個組氨酸的序列以及HindⅢ的酶切位點用于酶切。PCR的總擴增體系為50 μl：上下游引物各2 μl，2 μl DNA模板，Premix Primes STAR HS高保真酶體系25 μl，最后用ddH2O補充到50 μl。擴增程序：94 ℃保持5 min；94 ℃保持15 s，56 ℃保持35 s，72 ℃保持1 min，完成30個循環(huán)；72 ℃延伸8 min。使用1%凝膠對PCR產物進行電泳，并由生工生物工程（上海）股份有限公司測序，待用。

1.3? 重組pFastBac-UGT 1A1質粒的構建

在37 ℃條件下，用Bam H I及HindⅢ對目的基因和轉移載體質粒pFastBacⅠ雙酶切2 h，產物通過DNA膠回收。載體pFastBacⅠ片段與目的基因片段在DNA連接酶作用下，4 ℃連接過夜，轉化感受態(tài)細胞JM109。采用具有氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基進行篩選，挑選若干單個菌落，用特異性引物進行PCR擴增（方法同1.2），小量提取質粒。對陽性克隆提取質粒后進行Bam H I和Hind Ⅲ雙酶切鑒定、測序，檢驗插入位置和序列的正確性，其中完整的被命名為pFastBac-UGT 1A1。

1.4? 重組穿梭質粒Bacmid-UGT 1A1??? 的構建及鑒定

按Bac-to-Bac表達系統(tǒng)的操作說明，用5 μl的pFastBac-UGT 1A1??? 轉化感受態(tài)細胞DH10 Bac。在搖床上37 ℃培養(yǎng)4 h。將培養(yǎng)液倍比稀釋，選取適當?shù)?個濃度的菌液涂布在LB篩選培養(yǎng)基[包含質量濃度為10 μg/ml的慶大霉素、50 μg/ml的卡那霉素、7 μg/ml的四環(huán)素、40 μg/ml的IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷）和200 μg/ml的X-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）]上，37 ℃倒置培養(yǎng)48 h。挑取白色單菌落再次培養(yǎng)，接種到LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃過夜。提取重組質粒Bacmids，并用引物（MF：5′-GTTTTCCCAGTCACGAC-3′，MR：5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′）進行PCR驗證。20.0 μl反應體系：2×Taq 10.0 μl，上下游引物各0.8 μl，0.5 μl Bacmids， ddH2O 7.9 μl。擴增程序： 94 ℃保持5 min；94 ℃保持20 s，56 ℃保持15 s，72 ℃保持5 min，循環(huán)30次；最后72 ℃延伸5 min。成功的重組穿梭質粒被命名為Bacmid-UGT 1A1。

1.5? 重組桿狀病毒的獲得

依據(jù)試劑盒Cellfectin Ⅱ Reagent的說明書，在Sf9細胞處于對數(shù)生長期時轉染Bacmid-UGT 1A1??? ，同時設置染毒組Sf9細胞作為陰性對照，28 ℃培養(yǎng)約72 h，細胞出現(xiàn)明顯病變時，收獲P1代桿狀病毒，繼續(xù)傳代，獲得P2和P3代的重組桿狀病毒毒株。提取基因組DNA，用方法1.4中的引物擴增，完成重組桿狀病毒的鑒定。

1.6? 重組蛋白質的表達及鑒定

調節(jié)Sf9細胞數(shù)為1 ml 1.0×106，將P3代Bacmid-UGT1A1??? 接種于其中，28 ℃懸浮培養(yǎng)72.0 h，約80%細胞出現(xiàn)病變時，收集細胞。取培養(yǎng)液，低速（300 r/min）離心15 min，分離上清液和細胞，收集沉淀細胞，用含蛋白酶抑制劑的昆蟲活性蛋白抽提試劑裂解細胞，3×105 g離心后，用鎳親和層析柱進一步純化蛋白質。先進行蛋白質電泳，轉染PVDF（聚偏二氟乙烯）膜，用含量為5%的脫脂奶粉封閉1.0 h，一抗用鼠抗His（1∶2 500，稀釋度）4 ℃孵育過夜，二抗為羊抗鼠抗體（1∶2 500，稀釋度）室溫培養(yǎng)1.5 h，用DAB（二氨基聯(lián)苯胺）試劑盒顯色，檢測表達蛋白質的準確性。

1.7  重組酶動力學參數(shù)測定及對DON的降解分析

1.7.1? 重組酶動力學參數(shù)測定??? 精密量取不同濃度的DON溶液加入到最佳酶濃度的重組酶蛋白稀釋液中，選定最大激發(fā)波長410 nm，在酶標儀上對空白Sf9蛋白液和含DON的Sf9蛋白液中的孵育液進行掃描。其中底物濃度分別為2 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L，重組酶質量濃度為1 g/L，37 ℃預孵育5 min，加入啟動劑NADP/NADPH（還原型輔酶Ⅰ/還原型輔酶Ⅱ）反應，24 h后加400 μl含一定量內標DON的乙酸乙酯液終止反應，渦旋90 s混勻，6 000 r/min離心10 min，去除上清液后用氮氣吹干；樣品用100 μl流動相復溶，渦旋90 s混勻后13 000 r/min離心15 min，取上清液20 μl進行超高效液相色譜-串聯(lián)質譜分析，測定底物DON的剩余量和DON-3-Glu的生成量，每個底物濃度做3管平行試驗。按Lineweaver Burk雙倒數(shù)作圖法求得Km（酶在達到最大反應速度一半時的底物濃度）和Vmax（酶的最大反應速度），并根據(jù)公式計算清除率（CLint）： CLint=Vmax/Km×100%。

1.7.2? LC-MS/MS方法檢測培養(yǎng)液中DON和DON-3-GlcA??? 提取方法：DON染毒培養(yǎng)Sf9細胞24 h后，2 000 r/min離心收集1.0 ml上清液于1.5 ml離心管，取400 μl的上清液加入1.2 ml的甲醇溶液，漩渦30 s加速溶解，冰浴超聲40 min后，12 000 g離心10 min，取上清液，置于凍干機中。加60 μl 1%甲酸水溶液復溶，再次于4 ℃、12 000 g離心10 min。取上清液，用0.22 μm膜過濾，待上機分析。

色譜條件。（1）色譜柱：XBridge BEH-C18柱（100.0 mm×3.0 mm，2.5 μm）。（2）流動相：A相為甲醇，B相為5 mmol/L乙酸銨溶液。（3）梯度洗脫程序：0～1.0 min，10% A；1.0～6.5 min，10%～90% A；6.5～6.7 min，90%～10% A；6.7～8.0 min，10% A；再保持平衡2.0 min，總運行時間為10.0 min，流速0.4 ml/min；進樣量3 μl；柱溫40 ℃[1]。

質譜條件：采用電噴霧電離 （Electron spray ionization，ESI）正負離子模式同時掃描；正負離子噴霧電壓：5 500 V和4 500 V；去簇電壓96 V；射入電壓8 V；射出電壓12 V；霧化溫度：500.0 ℃；霧化和輔助氣均選用高純空氣，其中霧化氣為10 342.14 Pa，輔助氣為17 236.89 Pa；碰撞氣為高純氮氣：55 158.06 Pa；噴霧電壓氣簾氣：2.41×105 Pa；通過多反應監(jiān)測（Multiple reaction monitoring，MRM）模式對目標化合物進行峰值積分和數(shù)據(jù)分析[11]。表1為2種毒素的質譜參數(shù)。

2? 結果與分析

2.1? 豬??? UGT 1A1??? 基因的PCR擴增及測序

經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后觀察PCR擴增產物，在約1 677 bp左右的位置出現(xiàn)1條與豬肝臟??? UGT 1A1??? 片段預期大小一致的條帶（圖1）。

2.2? pFastBac-UGT 1A1的鑒定

經(jīng)PCR分析和電泳鑒定，檢測出長約1 677 bp的1條特異性條帶；經(jīng)內切酶Bam H Ⅰ、HindⅢ雙酶切后，電泳結果呈現(xiàn)2條帶，其中1條為載體，約5 200 bp，另外1條為目的條帶，約1 677 bp，與預期結果一致。結果（圖2）表明，目標基因的序列正確，成功構建了pFastBac-UGT 1A1??? 的重組質粒。

2.3? 重組穿梭質粒Bacmid-UGT 1A1??? 的鑒定

圖3顯示，采用方法1.4的引物，以Bacmid-UGT 1A1??? 的DNA為模板完成PCR擴增。擴增結果與預測的結果一致，在大約4 000 bp的地方呈現(xiàn)1條特異性的DNA片段。

1～5：PCR產物；MK：DL5000 plus DNA標記。

2.4? 蛋白質表達結果的檢測

感染Sf9細胞72 h后，收集上清液，濃縮，用鎳親和層析柱進行純化，完成蛋白質電泳十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）（圖4）。轉膜后進行抗體反應，在62 200處出現(xiàn)1特異性條帶（圖5），與預測大小一致。并且??? UGT ????1A1蛋白主要在Sf9昆蟲細胞內表達。

2.5????? UGT 1A1??? 重組酶動力學參數(shù)分析

UGT 1A1??? 重組酶動力學參數(shù)采用Lineweaver-Burk法作圖。結果（圖6）表明，不同DON濃度培養(yǎng)條件下，Lineweaver-Burk曲線呈良好的線性關系（R2=0.99），說明試驗條件下??? UGT 1A1??? 重組酶對DON的代謝反應符合米氏方程。推算分別得到??? UGT 1A1??? 酶對DON的Km=（2.71±0.29）μmol/L，Vmax=（0.359 5±0.006 4） μmol/（min·mg） ，CLint=0.132 7 L/（min·mg）。

DON：嘔吐霉素。A：代謝速率與底物濃度的關系；B：UGT 1A1??? 重組酶代謝DON的Lineweaver-Burk曲線。

2.6? DON和DON-3-GlcA的LC-MS/MS分析結果

圖7為DON經(jīng)??? UGT 1A1??? 培養(yǎng)液代謝后的MRM圖譜，可見DON和DON-3-GlcA 2種物質色譜峰形較好且響應強度高。推測DON在??? UGT 1A1??? 的作用下可代謝為DON-3-GlcA，降解率為45%。

DON：嘔吐霉素；DON-3-GlcA：DON-葡萄糖醛酸。A：DON代謝前的MRM圖譜；B：代謝后DON和DON-3-GlcA的質譜多反應監(jiān)測圖譜。

3? 討? 論

UGT是在內質網(wǎng)膜和核膜上催化Ⅱ相代謝途徑，是真菌毒素葡萄糖醛酸結合反應的超家族基因。??? UGT 1A和UGT 2B??? 亞家族的成員在終止生物作用和親脂性藥物的消除方面起著關鍵作用。這些酶主要催化源自輔因子尿苷二磷酸（UDP）-葡萄糖醛酸的葡萄糖醛酸，同樣，也可以催化具有共價連接的合適受體官能團的底物，這個過程被稱為葡萄糖醛酸化[12]。體內一般脂溶性物質的代謝主要通過這一反應，如內源性物質、膽紅素、類固醇等的降解過程[13-16]。前期研究發(fā)現(xiàn)DON主要在肝臟中被UGT催化，通過Ⅱ相代謝途徑發(fā)生葡萄糖醛酸結合反應而被迅速排出體外，降低其毒性作用。而UGT基因家族有多個亞型，在豬體內主要發(fā)現(xiàn)的UGT亞型包括? ??UGT 2B31、UGT 2B4、UGT 2A1、UGT 1AB3??? ?4種，這些亞型基因在真菌毒素體內代謝中的作用、解毒效應和代謝途徑各不相同。本研究在前期工作基礎上探索催化DON在豬肝細胞中發(fā)生葡萄糖醛酸化的??? UGT 1A1??? 關鍵亞型基因。

目前重組構建技術可以使對體外培養(yǎng)試驗中基因變化的觀察更為直觀，Bac-to-Bac 表達系統(tǒng)和傳統(tǒng)的同源重組相比可以更快速地產生重組桿狀病毒和同時進行大量重組目的蛋白鑒別，該表達系統(tǒng)主要包括合適的pFastBac菌體和DH10Bac感受態(tài)細胞及1個可以控制表達的質粒，通過感染細胞能形成重組桿狀病毒[17]。 pFastbac 1的特點是表達水平高、啟動子部位富含AcMNPV聚乙烯（PH），可用于簡單的大量克隆[18]。為探索豬體內Ⅱ相代謝途徑發(fā)生葡萄糖醛酸結合反應的關鍵??? UGT 1A1??? 酶基因，本研究通過合成??? UGT 1A1??? 基因，將目的基因克隆至pFastbac 1桿狀病毒載體上，然后轉化pFastbac-UGT 1A1??? 質粒至DH10bac感受態(tài)，制備Bacmid（桿粒），Sf9細胞被Bacmid轉染后得到子代的病毒可獲得大批量目的蛋白，Anti-His Western blot檢測和放大轉染、表達檢測的結果一致，顯示獲得的蛋白質中??? UGT 1A1??? 基因表達。通過UPLC-MS/MS分析DON代謝產物發(fā)現(xiàn)，DON在豬肝細胞中通過??? UGT 1A1??? 酶的催化作用代謝為DON-3-葡萄糖醛酸，提示豬肝細胞中DON葡萄糖醛酸反應關鍵UGT酶基因? ??UGT 1A1??? 具有重要作用。

由于真菌毒素污染在畜禽日常生產中難以避免和降解，研究促進真菌毒素在機體內更快消除代謝的關鍵因子和調節(jié)機制具有重大意義。本研究發(fā)現(xiàn)，DON在豬肝細胞中通過Ⅱ相代謝途徑發(fā)生葡萄糖醛酸結合反應的關鍵UGT酶基因是? ??UGT 1A1??? ，后續(xù)或許可能通過對??? UGT 1A1??? 基因結構進行突變誘導等處理，提高毒素轉化代謝及降解效率，為后期飼料中DON脫毒劑開發(fā)研究和畜禽制品食品安全監(jiān)督等提供參考。

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（責任編輯：陳海霞）