萬古霉素誘導人腎小管上皮細胞損傷及其Smad4 表達的研究

高瑞，肖曉琳，許建春，宋瑋*

1.天津市第五中心醫(yī)院 藥劑科，天津 300450

2.天津市第五中心醫(yī)院 中心實驗室，天津 300450

腎臟疾病分為急性腎損傷和慢性腎臟疾病2 種類型。急性腎臟損傷通常起病急，于7 d 內(nèi)腎臟功能減退。由于腎功能損傷程度不同，臨床表現(xiàn)為血肌酐極微量的升高，以及無尿的急性腎功能衰竭。急性腎功能衰竭是重癥患者死亡的主要原因之一，因急性腎衰竭死亡的重癥患者人數(shù)可達到50%[1]。據(jù)統(tǒng)計約20%急性腎臟損傷是藥物毒性引起，其中抗生素導致的腎損傷最為常見。萬古霉素能有效治療革蘭陽性菌，尤其是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌引起的感染，在危重患者的抗感染治療中具有重要地位。然而，萬古霉素作為首選藥的同時所導致的不良反應限制該藥物在臨床的廣泛應用，其中最主要的不良反應為急性腎臟損傷[2-4]。

萬古霉素引起急性腎損傷的機理目前還遠未明確。研究表明，萬古霉素引起腎損傷可能與萬古霉素誘導的腎小管上皮細胞引起的氧化應激[5]、細胞自噬[6]、阻塞性管型形成[7]和基因調控[8-9]等因素有關。還有研究證實萬古霉素引起腎損傷還可能與其有抑制P-糖蛋白（P-gp）功能和P-gp 在細胞膜上的表達相關[10]。

除上述機制外，研究還發(fā)現(xiàn)，Smad 介導的轉化生長因子-β（TGF-β）途徑是調控腎臟疾病中多種病理過程的重要信號通路[11]。Smad 蛋白家族根據(jù)其結構與功能分3 個亞型：調節(jié)型、共享型、抑制型蛋白。其中，Smad4 是哺乳動物中唯一存在的共享型Smad 蛋白。Smad4 作為受體調節(jié)型Smad 蛋白共同結合體，影響Smad2/3 在胞漿和胞核中的定位，在腎臟疾病中具有重要作用，且Smad4 在腎臟纖維化和腎臟炎癥中發(fā)揮截然相反的作用[12]。Tsuchida等[13]證實腎小球系膜細胞內(nèi)Smad4 截短突變可抑制TGF-β 誘導的細胞外基質沉積。Meng 等[14]指出腎小管上皮細胞特異性敲除Smad4 基因能抑制Smad3 反應啟動活性，降低Smad3 和靶基因的結合能力，進而減弱單側輸尿管結扎誘導的腎臟纖維化；然而敲除Smad4 基因后Smad7 轉錄受到抑制，Smad7 蛋白表達減少，進而抑制靶基因核因子κB（NF-κB）的抑制蛋白（IκB）表達，促進腎臟炎癥反應。目前關于Smad4 蛋白在萬古霉素誘導的急性腎臟損傷中的作用尚無報道。實驗通過研究萬古霉素誘導人腎小管上皮細胞損傷及其Smad4 的表達，希望能為對抗萬古霉素腎毒性尋找新的作用靶點。

1 試劑與儀器

HK-2 細胞購自美國ATCC 公司。

萬古霉素（貨號V2002）購自美國Sigma 公司。DMEM/F-12 培養(yǎng)基（貨號11330032）、胎牛血清（貨號10091-148）、胰蛋白酶（貨號25200-056）均購自美國Gibco 公司，Anti-Smad4（貨號ab244370）、Anti-B 淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）（貨號ab272102）、Anti-Bcl-2 相關X 蛋白（Bax，貨號ab10813）、Anti-βactin（貨號ab227387）抗體均購自美國Abcam 公司，辣根過氧化物酶（HRP）二抗購自美國Jackson公司。CCK-8 試劑盒（貨號CA1210）、TUNEL 試劑盒（貨號T2191）均購自索萊寶公司，Smad4 過表達質粒[pcDNA3.1(+)-Flag-Smad4，PPL00733-2b]購自PPL 質粒與蛋白共享庫。

二氧化碳培養(yǎng)箱購自美國Thermo scientific 公司，電泳儀、轉膜儀購自英國Cleaver scientific 公司，倒置熒光顯微鏡購自日本Olympus 公司，全自動酶標儀購自美國BIO-TEK 公司，臺式高速離心機、低溫高速離心機購自德國Eppendorf 公司，脫色搖床購自北京沃德生物醫(yī)學儀器公司，超純水儀購自德國Merck Millipore 公司。

2 方法

2.1 顯微鏡觀察萬古霉素對HK-2細胞形態(tài)的影響

HK-2 細胞使用DMEM/F12 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、100 U/mL 青鏈霉素和100 μg/mL 鏈霉素），于37 ℃、含5% CO2的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的HK-2 細胞接種于6 孔板，經(jīng)含0.2%胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基同步靜止12 h 后，加入不同濃度（0、1、2、3、4、5 mmol/L）的萬古霉素處理24 h，觀察不同濃度萬古霉素對HK-2 細胞形態(tài)的影響。

2.2 CCK-8 法檢測萬古霉素對HK-2 細胞活力的影響

HK-2 細胞使用DMEM/F12 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、100 U/mL 青鏈霉素和100 μg/mL 鏈霉素），于37 ℃、含5% CO2的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的HK-2 細胞接種于3 塊96 孔板，經(jīng)含0.2%胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基同步靜止12 h 后，分別加入不同終濃度（0、1、2、3、4、5 mmol/L）的萬古霉素依次處理6、12、24 h 后，分別加入濃度為10%的CCK-8 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，取出96 孔板，在酶標儀上檢測各孔在波長為450 nm 處的吸光度（A）值。同時折算出存活率作圖分析。

2.3 TUNEL 染色檢測細胞的凋亡情況

取對數(shù)生長期的HK-2 細胞接種于6 孔板（底部放置多聚賴氨酸包被的蓋玻片），經(jīng)含0.2%胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基同步靜止12 h 后，加入不同終濃度（0、1、2、3、4、5 mmol/L）的萬古霉素處理24 h 后用4%多聚甲醛固定，3%雙氧水封閉10 min，0.1% Triton-100 穿透3 min，用原位細胞死亡監(jiān)測試劑盒監(jiān)測，用TUNEL 反應混合液標記凋亡細胞，細胞核用4′,6-二脒基-2 苯基吲哚（DAPI）染色，熒光顯微鏡隨機獲取圖像，并檢測細胞凋亡情況。

2.4 蛋白質印跡（Western blotting）檢測HK-2 細胞中Smad4 蛋白的表達

取對數(shù)生長期的HK-2 細胞接種于6 孔板，經(jīng)含0.2%胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基同步靜止12 h 后，加入不同終濃度（0、1、2、3、4、5 mmol/L）的萬古霉素處理24 h，收集蛋白。將等量的蛋白裂解物在十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳，并轉移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。5%的牛奶室溫封閉l h，在4 ℃用不同的一抗對膜進行過夜孵育，將一抗清洗干凈，用二抗在室溫孵育l h，通過增強化學發(fā)光液ECL 并使用C-Digit 印跡掃描儀成像，檢測Smad4 的蛋白表達水平。

2.5 Western blotting 檢測HK-2 細胞凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2 的表達

取對數(shù)生長期的HK-2 細胞接種于6 孔板，經(jīng)含0.2%胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基同步靜止12 h 后，加入不同終濃度的萬古霉素（0、1、2、3、4、5 mmol/L）處理24 h，收集蛋白。按2.4 項下方法，通過增強化學發(fā)光液ECL 并使用C-Digit 印跡掃描儀成像，檢測Bax 和Bcl-2 的蛋白水平的表達，采用Image PRO Plus 6.0 分析軟件測定相關蛋白條帶的灰度值。

2.6 過表達Smad4 質粒轉染及驗證

根據(jù)lipofectamineTM2000（invitrogen）說明書操作步驟，將pcDNA3.1(+)-Flag-Smad4 過表達質粒轉染至HK-2 細胞48 h，收集細胞，提取總蛋白質。通過Western blotting 驗證Smad4 的過表達情況。同時設置空載對照組。

2.7 過表達Smad4 對HK-2 細胞損傷的影響

取上述轉染48 h并驗證Smad4過表達后的HK-2 細胞，隨機分為對照組（DMEM/F-12 培養(yǎng)基）、萬古霉素2 mmol/L 組。同時空載組也隨機分為對照組（DMEM/F-12 培養(yǎng)基）、萬古霉素組（2 mmol/L），共同培養(yǎng)24 h，顯微鏡下觀察HK-2 細胞形態(tài)變化情況；同時將上述分組細胞用4%多聚甲醛固定，3%雙氧水封閉10 min，0.1% Triton-100 穿透3 min，用原位細胞死亡監(jiān)測試劑盒監(jiān)測，用TUNEL 反應混合液標記凋亡細胞，細胞核用4′,6-二脒基-2 苯基吲哚染色，熒光顯微鏡獲取圖像，檢測萬古霉素誘導的過表達HK-2 細胞凋亡情況。

2.8 統(tǒng)計學分析

本研究所得數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。

3 結果

3.1 顯微鏡下觀察萬古霉素對HK-2 細胞形態(tài)的影響

顯微鏡下顯示，隨著萬古霉素濃度的逐漸升高，HK-2 細胞的活性細胞數(shù)量逐漸變少，細胞體積逐漸萎縮變圓，而細胞凋亡數(shù)量逐漸增多，如圖1所示。

圖1 萬古霉素對HK-2 細胞形態(tài)的影響（×100）Fig.1 Effect of vancomycin on HK-2 cell morphology (× 100)

3.2 CCK-8 法檢測萬古霉素對HK-2 細胞存活率的影響

結果顯示，隨著萬古霉素濃度升高，作用時間增長，HK-2 細胞增殖能力逐步降低；與6 h 組相比，12 h 組不同濃度萬古霉素對HK-2 細胞存活無顯著影響，而24 h 組不同濃度萬古霉素可顯著抑制HK-2 細胞存活（P＜0.05、0.01），見圖2。

圖2 萬古霉素對HK-2 細胞活力的影響（，n =3）Fig.2 Effect of vancomycin on the viability of HK-2 cells(,n =3)

3.3 TUNEL 染色檢測細胞凋亡

結果顯示，隨著萬古霉素濃度升高，TUNEL 陽性細胞逐漸增多，見圖3。

圖3 萬古霉素對HK-2 細胞凋亡的影響Fig.3 Effect of vancomycin on apoptosis of HK-2 cells

3.4 Western blotting 檢測HK-2 細胞Bax、Bcl-2、Smad4 蛋白的表達

免疫蛋白印跡結果顯示，與對照組相比，隨著萬古霉素濃度升高，Bax 蛋白表達顯著升高，Smad4、Bcl-2 表達顯著降低（P＜0.05、0.01、0.001），見圖4、5。

圖4 萬古霉素對HK-2 細胞中Smad4、Bax、Bcl-2 蛋白表達的影響Fig.4 Effects of vancomycin on Smad4,Bax,and Bcl-2 protein expression in HK-2 cells

圖5 HK-2 細胞中Smad4、Bax、Bcl-2 蛋白表達量化結果（，n =3）Fig.5 Quantitative results of Smad4,Bax,and Bcl-2 protein expression in HK-2 cells (,n =3)

3.5 過表達Smad4 對萬古霉素誘導的HK-2 細胞損傷的影響

Western blotting 檢測HK-2 細胞中Smad4 蛋白的表達水平。與對照組相比，發(fā)現(xiàn)Smad4 過表達的HK-2 細胞中Smad4 蛋白表顯著增高（P＜0.01），見圖6。

圖6 HK-2 細胞中構建的過表達Smad4 蛋白表達情況（，n =3）Fig.6 Expression of overexpressed Smad4 protein constructed in HK-2 cells (,n =3)

顯微鏡下顯示，空載對照組HK-2 細胞狀態(tài)良好，呈正常梭形、背景清晰，貼壁正常；空載萬古霉素2 mmol/L 組HK-2 細胞失去正常形態(tài)，出現(xiàn)較多凋亡小體，活性細胞數(shù)量減少，凋亡數(shù)量明顯增多。轉染對照組細胞形態(tài)較好，基本無凋亡；轉染萬古霉素2 mmol/L 組HK-2 細胞與空載萬古霉素2 mmol/L 組相比，活性細胞數(shù)量增多，凋亡數(shù)量減少，見圖7。TUNEL 法檢測過表達HK-2 細胞凋亡情況，發(fā)現(xiàn)熒光顯微鏡下，與空載對照組相比，轉染組陽性凋亡HK-2 細胞數(shù)量無顯著變化；空載萬古霉素2 mmol/L 組陽性凋亡HK-2 細胞數(shù)量顯著增多（P＜0.001）。與空載萬古霉素2 mmol/L 組相比，轉染萬古霉素2 mmol/L 組陽性凋亡HK-2 細胞數(shù)量顯著減少（P＜0.05），見圖8。

圖7 過表達Smad4 對萬古霉素誘導的HK-2 細胞損傷的形態(tài)學變化（×100）Fig.7 Morphological changes of vancomycin-induced HK-2 cell injury induced by overexpression of Smad4 (× 100)

圖8 萬古霉素誘導對過表達Smad4 的HK-2 細胞凋亡情況的影響（，n =3）Fig.8 Effect of vancomycin induction on apoptosis of HK-2 cells overexpressing Smad4 (,n =3)

4 討論

萬古霉素是治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌引起嚴重感染的一線抗生素，然而腎毒性是萬古霉素治療常見的不良反應[15]。萬古霉素可誘導急性腎損傷逐漸轉變?yōu)槁阅I病，在早期主要表現(xiàn)為腎功能不全和腎細胞凋亡，在后期腎臟纖維化和炎癥明顯加重[16]。

本研究通過加入不同濃度的萬古霉素處理HK-2 細胞，發(fā)現(xiàn)萬古霉素抑制HK-2 細胞的細胞活力，促進促凋亡蛋白Bax 表達，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表達，抑制HK-2 細胞中Smad4 蛋白表達，且呈劑量相關性。研究結果表明，萬古霉素可能通過調控Smad4 蛋白降解導致急性腎臟損傷。

此外，Smad 蛋白家族是TGF-β 下游最重要的信號轉導蛋白，在調節(jié)細胞的增殖、分化、遷移等過程中發(fā)揮重要作用。Shen 等[17]研究發(fā)現(xiàn)抑制Smad4 信號通路可發(fā)揮抗纖維化作用。另外，氧化應激在急慢性腎損傷的發(fā)展過程中起著關鍵作用，醉茄素A 可通過抑制Smad4 表達，降低TGF-β 及其下游信號分子水平，對腎損傷模型大鼠具有潛在的腎保護作用[18]。Zhang 等[19]研究發(fā)現(xiàn)大黃可通過抑制TGF-β/Smad 通路，改善慢性腎臟疾病異常代謝，預防腎損傷。本研究還發(fā)現(xiàn)，過表達Smad4 可降低萬古霉素誘導的HK-2 細胞的損傷，再次提示萬古霉素可能通過調控Smad4 蛋白降解導致急性腎臟損傷。

綜上所述，萬古霉素可能通過調控Smad4 蛋白降解導致急性腎臟損傷，為對抗萬古霉素腎毒性尋找了新的作用靶點。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突