HS-SPME-GC-MS 結(jié)合主觀嗅覺評價研究不同批次地龍腥臭氣特征性物質(zhì)基礎(chǔ)

葉 慧，張定堃，韓 麗，劉 倩，阮世發(fā)，包曉明，高繼海，廖嘉寶*，許潤春*

［1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院西南特色中藥資源國家重點實驗室，四川 成都 611137； 2.華潤三九現(xiàn)代中藥制藥有限公司，廣東 深圳 518110； 3.島津企業(yè)管理（中國）有限公司，四川 成都 610023］

地龍為環(huán)節(jié)動物門鉅蚓科動物參環(huán)毛蚓Pheretima Aspergillum（E.Perrier）、通俗環(huán)毛蚓P.VulgarisChen、威廉環(huán)毛蚓P.Guillelmi（Michaelsen）或櫛盲環(huán)毛蚓P.PectiniferaMichaelsen 的干燥體［1］，性寒，味咸，歸肝、脾、膀胱經(jīng)，具有清熱息風(fēng)、通絡(luò)、平喘、利尿的功效，臨床常用于治療高熱神昏、驚癇抽搐、關(guān)節(jié)麻痹、半身不遂、肺熱喘咳、水腫尿少等癥，尤其對于小兒驚風(fēng)、高熱抽搐、咳喘等兒科疾病療效顯著。但地龍藥材腥臭氣強烈，遇水更甚，臨床用藥時患者易出現(xiàn)惡心嘔吐等不良反應(yīng)，服藥依從性不佳［2］，因此地龍腥臭氣問題亟待解決。

劉曉梅等［2］采用電子鼻和HS-GC-MS 技術(shù)發(fā)現(xiàn)地龍腥味物質(zhì)基礎(chǔ)主要為醛類（異戊醛，2-甲基丁醛，異丁醛，2-乙基己醛，己醛）和胺類（三甲胺）。但該研究僅選擇了一批地龍作為研究對象，HS-GC-MS 監(jiān)測成分較少（僅42 種），并缺少反映人體真實感受的主觀評價，主客觀評價之間的關(guān)聯(lián)性有待深入挖掘。

地龍藥源動物蚯蚓在我國分布比較廣泛，主產(chǎn)于我國東南地區(qū)，均處于自然的生長和繁殖狀態(tài)，不同產(chǎn)地的氣候、水質(zhì)、微生物種群、飼養(yǎng)方式等差異必然會導(dǎo)致不同產(chǎn)地地龍品質(zhì)差異。地龍的前處理也會導(dǎo)致地龍品質(zhì)差異，地龍藥源蚯蚓采集后及時剖開腹部，除去內(nèi)臟和泥沙，洗凈，曬干或低溫干燥即得到地龍飲片［1］。目前市場上普遍將地龍分級售賣，按照地龍剖開洗凈的開口程度分為統(tǒng)貨（不經(jīng)處理的小地龍）、小開（開口約1／4）、中開（開口約地龍長度的1／3）、半開（開口1／2）、全開 （全部開口）。課題組在市場調(diào)研與生產(chǎn)實踐中，發(fā)現(xiàn)地龍均存在明顯腥臭氣，且不同批次地龍藥材腥臭氣差異明顯，存在部分批次地龍魚腥味重，或土腥氣重，或煙熏味重等情況。而這種腥臭氣差異將持續(xù)傳遞到地龍湯劑、配方顆?；蚱渌嚓P(guān)中成藥，影響臨床服用的順應(yīng)性。因此，有必要明確地龍腥臭氣物質(zhì)基礎(chǔ)及特征異味物質(zhì)，針對特征異味物質(zhì)的理化性質(zhì)，開發(fā)高效的矯味技術(shù)。本研究采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（headspace-solid phase micro-extraction gas chromatography mass spectrometry，HSSPME-GC-MS），結(jié)合志愿者感官評價對多批次地龍藥材的共有腥臭氣物質(zhì)進行分析，旨在明確地龍代表性腥臭氣物質(zhì)基礎(chǔ)，并定位不同批次地龍腥臭氣差異的特征性物質(zhì)，為地龍去腥除臭研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器 TQ8050 三重四極桿氣質(zhì)聯(lián)用儀 （日本Shimadzu 公司），配置PAL 加熱磁力攪拌模塊、數(shù)據(jù)分析軟件、Off-flavor-TQ-MS 數(shù)據(jù)庫，PAL SPME Arrow 固相微萃取進樣器、PAL SPME Fiber 固相微萃取進樣器（1.5 mm×120 μm × 20 mm，PN ARR15-DVB／C-WR-120／20CT；95 μm×10 mm，Carbon WR Fiber，PN FIB-C-WR-95／10； 瑞士思特斯分析儀器有限公司）； BT125D 型分析天平（十萬分之一，德國Sartorius 公司）； UPR-11-5T 型純水儀（四川優(yōu)普超純科技有限公司）； HX-200K 型扣式中藥粉碎機（浙江省永康市溪岸五金藥具廠）。

1.2 藥材 11 批地龍藥材采購于成都荷花池藥材市場，樣品信息見表1，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院國家中藥種質(zhì)資源庫高繼海副教授鑒定均為鉅蚓科動物參環(huán)毛蚓Pheretimaaspergillum（E.Perrier）的干燥體。

表1 樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 地龍樣品制備 取S01 ～S11 號樣品適量，粉碎，收集能通過2 號篩而不能通過4 號篩的粉末，即得。

2.2 地龍腥臭氣味感官評價 經(jīng)過培訓(xùn)及篩選后，選擇身體健康、無鼻炎、嗅覺正常、無不良嗜好的12 名志愿者組成評定小組進行感官評定［3］。在評定前4 h，志愿者不得抽煙飲酒，不得食用具有嚴重氣味的食物，不得使用帶有氣味的化妝品、香水等［4］。本研究腥臭氣味評定采用5 分制，0 分：無腥臭氣味； 1 分：略有腥臭氣味； 2 分：腥臭氣味明顯； 3 分：腥臭氣味嚴重； 4 分：腥臭氣味極重； 5 分：無法忍受的腥臭氣味。稱取2 g 樣品裝于3 號樣品袋（100 mm×70 mm）內(nèi)，密閉2 h，由志愿者對腥臭氣味進行評定并描述，評定結(jié)束后休息10 min，待志愿者嗅覺完全恢復(fù)后，再進行下一份樣品評定［4］。

由志愿者對S01 ～S11 地龍腥臭氣味進行評定并描述，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，魚腥味、煙熏味、發(fā)霉味、泥土味構(gòu)成了地龍藥材主要氣味特征。S02、S03、S06、S10、S11 地龍魚腥氣明顯； S02、S07、S09、S11 地龍煙熏氣明顯； 11 批地龍發(fā)霉味、泥土味均不明顯。由志愿感官評價結(jié)果可知，11 批地龍總體氣味構(gòu)成一致，但個別批次氣味特征突出。

表2 11 批地龍藥材氣味描述及腥臭氣評分（分，x±s，n＝3）

2.3 地龍腥臭氣味HS-SPME-GC-MS 分析

2.3.1 氣相色譜條件 InertCap Pure-WAX 毛細管柱（30 mm×0.25 mm×0.25 μm）； 進樣口溫度250 ℃，分流進樣，分流比5 ∶1，進樣口壓力83.5 kPa； 載氣高純氦氣，恒壓力模式； 吹掃體積流量3.0 mL／min； 程序升溫（初始溫度50 ℃，保持5 min，以10 ℃／min 升溫至250 ℃，保持20 min）； 柱平衡時間3.0 min。

2.3.2 質(zhì)譜條件 離子源為電子轟擊源（EI）； 離子化能量70 eV； 離子源溫度200 ℃； 質(zhì)譜傳輸接口溫度250 ℃；碰撞氣氬氣； MRM 監(jiān)測模式，檢測器電壓相對于調(diào)諧結(jié)果＋0.3 kV，溶劑延遲時間1.16 min。質(zhì)譜庫NIST17s、NIST17-1、NIST17-2［5］。

2.3.3 頂空-固相微萃取條件 精密稱取地龍藥材細粉0.1 g置于20 mL 惰性化頂空瓶內(nèi)； 50 ℃平衡40 min。進樣前后，固相萃取頭在270 ℃老化裝置中自動老化3 min，通過聚四氟乙烯隔墊插入頂空瓶內(nèi)，不接觸樣品，在50 ℃恒溫下萃取吸附10 min 后，抽出萃取頭，迅速插入在預(yù)運行狀態(tài)下的GC-MS 進樣口，于250 ℃條件下解吸2 min 后，進行GC-MS 分析［6］。

2.3.4 HS-SPME-GC-MS 分析結(jié)果 在 “2.3” 項下條件進樣。島津針對食品中的氣味成分專門開發(fā)了Smart MRM 氣味數(shù)據(jù)庫，包含對氣味影響的化合物 （約150種）、MRM／SIM 參數(shù)以及感官信息 （氣味特征和氣味閾值）等內(nèi)容［7］。本實驗中目標(biāo)化合物的定性是根據(jù)定性定量離子對確認，目標(biāo)化合物的定量是根據(jù)島津Smart MRM 氣味數(shù)據(jù)庫的標(biāo)準(zhǔn)曲線來實現(xiàn)半定量分析［6］，采用面積歸一化法計算各成分的相對質(zhì)量分數(shù)。11 批地龍中共檢出揮發(fā)性成分132 種，其中有醛類17 種、酮類18 種、酸類16 種、烴類17 種、酯類12 種、醇類19 種、酚類16 種、雜環(huán)類10 種、醚類2種、酰胺1 種、硫化物4 種等，典型的S11 地龍樣品MRM 監(jiān)測總離子流圖見圖1。由于版面篇幅限制，本文并未列出所有揮發(fā)性成分，在下文中僅列出關(guān)鍵揮發(fā)性成分，見表3。

圖1 S11 地龍樣品揮發(fā)性成分HS-SPME-GC-MS 總離子流圖

表3 地龍共有腥臭氣物質(zhì)的相對質(zhì)量分數(shù)和平均ROAV

已知醛類物質(zhì)由肉中多不飽和脂肪酸氧化產(chǎn)生，且閾值較低，具有魚腥味、脂肪味，是動物藥氣味特征的主要組成［8］，低等碳鏈（C1～C5）的飽和醛具有令人不適的刺激氣味，中等碳鏈（C6～C9）醛產(chǎn)生脂肪、苦或油膩氣味，碳數(shù)更高的醛有柑橘皮香味； C5～C7 （Z）-2-烯醛有新鮮的油漆或油灰的氣味； C8～C9 的2-烯醛有堅果、牛脂或黃瓜的香味［9-10］。因此，正己醛、正辛醛、（E，E）-2，4-庚二烯醛、（E，E）-2，4-壬二烯醛、（E）-2-庚烯醛、反式-2-壬醛對地龍腥臭氣的貢獻較大。酸類成分是地龍揮發(fā)性成分的重要組成，不僅普遍存在且含量較高，氣味描述均為腐臭、酸味、汗臭等難聞的異味，對地龍腥臭氣的貢獻較大。芳烴類是魚肉中的異味成分［9］，在地龍中含量不高，且閾值較高，對氣味形成貢獻不大，但某些芳烴化合物如甲苯、萘等化合物閾值較低，且會產(chǎn)生化學(xué)刺激性氣味［11］。醇類與酮類成分可能來自于脂肪氧化［12-13］，羰基化合物對肉制品氣味的形成具有極大作用，但上述成分中酮類氣味多描述為香氣，而醇類物質(zhì)中以飽和醇居多，但其嗅閾值較高，除非濃度較高，否則對氣味貢獻不大。酯類成分含量不高，且多具香氣。酚類成分具有典型的煙熏風(fēng)味成分［14］，對地龍氣味貢獻大。雜環(huán)類中2-甲氧基-3-異丁基吡嗪嗅閾值較低，可能是地龍氣味的主要成分； 硫醚類物質(zhì)（二甲基二硫、二甲基三硫）具有嗅閾值低和強烈刺激性氣味的特點，是一類典型的腥臭氣物質(zhì)［15］； 萘、甲基萘等物質(zhì)具有焦油味、腐臭味等，也是不良異味的常見組成。根據(jù)實驗及參考文獻［2］報道，可判斷醛類、酸類、酚類、硫化物是地龍腥臭氣味的主要來源。

2.3.5 關(guān)鍵揮發(fā)性物質(zhì)評價 采用相對氣味活度值（relative odor activity value，ROAV）分析各化合物對樣品的總體貢獻［16］。“嗅覺閾值” 是指人的嗅覺能感受到物質(zhì)的最小刺激時的物質(zhì)濃度或稀釋倍數(shù)［17］。在一定的條件下，嗅覺閾值越低，濃度越高，則氣味越易被感知，對整體氣味的貢獻越大［18］。采用ROAV 法確定地龍中關(guān)鍵揮發(fā)性氣味物質(zhì)，首先采用氣味活度值（odor activity value，OAV）方法先確定對樣品風(fēng)味貢獻最大的揮發(fā)性組分。氣味活度值即揮發(fā)性物質(zhì)相對質(zhì)量分數(shù)（C）與其嗅閾值（T）之間的比值，公式為，首先定義對樣品氣味貢獻最大的組分為ROAVmax＝100，對其他揮發(fā)性成分ROAV 進行計算，公式為式中Ci和Ti分別為各揮發(fā)性物質(zhì)的相對百分含量和相對應(yīng)的嗅覺閾值；Cmax和Tmax分別為對樣品總體氣味貢獻最大的組分相對百分含量和相對應(yīng)的嗅覺閾值［18］。

所有組分均滿足0＜ROAV≤100，且ROAV 越大說明組分對樣品總體氣味的貢獻也越大。一般認為ROAV≥1 的組分為樣品的關(guān)鍵氣味物質(zhì)，0.1≤ROAV＜1 的組分對樣品的整體氣味具有重要的修飾作用［18］。S01、S02、S03、S07、S09 的ROAVmax成分為間甲基苯酚，S04、S05 的ROAVmax成分為正己醛，S06、S10 的ROAVmax成分為二甲基三硫、S08、S11 的ROAVmax成分為2-甲氧基-3-異丁基吡嗪，以此計算11 批地龍的ROAV 和平均ROAV，并篩選ROAV＞0.1（3 批及以上地龍符合）、單個地龍ROAV≥1 以上的揮發(fā)性成分（即11 批地龍中普遍存在的關(guān)鍵氣味成分），定位關(guān)鍵氣味成分和氣味修飾成分，共得到59 種主要揮發(fā)性成分。通過Smart MRM 氣味數(shù)據(jù)庫中揮發(fā)性成分的氣味描述篩出構(gòu)成地龍腥臭氣的主要成分，以揮發(fā)性成分在11 批地龍藥材中的平均ROAV 進行從大到小排序，結(jié)果見表3，共33 個腥臭氣成分，其中構(gòu)成11 批地龍腥臭氣的關(guān)鍵成分為間甲基苯酚、2-甲氧基-3-異丁基吡嗪、二甲基三硫、正己醛、4-甲基苯酚、2-甲基異冰片、愈創(chuàng)木酚、仲辛酮、庚酸、2-茨醇、反式-2-壬醛，多散發(fā)塑料味、糞便味、土味、魚味、油脂味、煙熏味、發(fā)霉味、汽油味等不愉悅氣味；具有修飾作用的成分為2，3-二甲酚、2，6-二氯苯酚、己酸、α-蒎烯、4-甲基戊酸、抗氧劑264、2-氯-6-甲酚、芐基丙酮、乙酸、異戊酸、十二醛、4-甲基-3-戊烯-2-酮、正辛醛、4，5-環(huán)氧- （E）-2-癸烯醛、2-己酮、反式-2，4-癸二烯醛、2-甲基萘、格噢三鈱、2-甲基丁酸、丙酸、正癸酸、異丁酸。

2.4 主客觀相關(guān)性分析 Pearson 二元相關(guān)分析可以預(yù)測和解釋2 個變量之間的線性關(guān)系，從而得到2 個變量之間關(guān)系的性質(zhì)和緊密程度。將多批次地龍中各類物質(zhì)的相對質(zhì)量分數(shù)與感官評價中3 種氣味評分導(dǎo)入IBM SPSS Statistics 26.0 軟件，選擇雙變量相關(guān)分析進行Pearson分析。

將表3 中腥臭氣成分相對質(zhì)量分數(shù)與志愿者感官評分進行皮爾遜雙變量相關(guān)分析，結(jié)果見圖2。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，魚腥味與二甲基三硫呈正相關(guān) （P＜0.05，R＝0.724）； 煙熏味與異丁酸（P＜0.05，R＝-0.622）呈強負相關(guān)； 與間甲基苯酚（P＜0.01，R＝0.738）、4-甲基苯酚（P＜0.05，R＝0.809）、異戊酸（P＜0.05，R＝0.667）呈正相關(guān)； 發(fā)霉味、泥土味與2-氯-6-甲酚 （P＜0.05，R＝0.686）、2，3-二甲酚（P＜0.05，R＝0.700）、2-甲基丁酸（P＜0.05，R＝0.686）、2-甲氧基-3-異丁基吡嗪（P＜0.01，R＝0.790）、2-甲基萘（P＜0.05，R＝0.703）呈正相關(guān)。其中二甲基三硫、間甲基苯酚、4-甲基苯酚、2-甲氧基-3-異丁基吡嗪平均ROAV＞1，氣味貢獻度高，為腥臭氣差異的關(guān)鍵成分。

圖2 腥臭氣成分相對質(zhì)量分數(shù)與感官評價的皮爾遜相關(guān)系數(shù)矩陣熱圖

3 討論

研究結(jié)果表明，地龍藥材普遍存在腥臭氣味，HSSPME-GC-MS 明確了不同批次地龍共有腥臭氣物質(zhì)基礎(chǔ)，關(guān)鍵腥臭氣物質(zhì)為間甲基苯酚、2-甲氧基-3-異丁基吡嗪、二甲基三硫、正己醛、4-甲基苯酚、2-甲基異冰片、愈創(chuàng)木酚、仲辛酮、庚酸、2-茨醇、反式-2-壬醛，氣味描述與感官評價基本一致。志愿者感官評價發(fā)現(xiàn)個別批次地龍藥材腥臭氣突出，通過腥臭氣成分含量與感官評分的皮爾遜雙變量相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，二甲基三硫、甲基苯酚（間甲基苯酚和4-甲基苯酚）、2-甲氧基-3-異丁基吡嗪分別是地龍魚腥味、煙熏味、發(fā)霉味、泥土味的關(guān)鍵特征性異味物質(zhì)。

地龍腥臭氣特征物質(zhì)可能主要來源于：（1）地龍自身轉(zhuǎn)化：地龍中富含蛋白質(zhì)、氨基酸、核苷等成分，氨基酸發(fā)生脫氨基、脫羧基作用形成中間體和小分子，如吲哚、腐胺、酪胺、組胺、脂肪酸等，進而生成硫化氫、甲烷、氨、硫醇等［12］。尤其是在含硫氨基酸半胱氨酸的存在下，形成了許多雜環(huán)產(chǎn)物，例如吡嗪和甲基吡嗪、甲基噻唑等［19］。酪氨酸可能在微生物作用下生成4-甲基苯酚，地龍中的甲基苯酚可能來源于酪氨酸轉(zhuǎn)化［20］。地龍成分如蛋氨酸，是硫醚類物質(zhì)產(chǎn)生前體。（2）生長環(huán)境及加工過程帶入：地龍藥源蚯蚓是腐食生物，生活在潮濕疏松的土壤中，以含有機物腐殖質(zhì)土及分解產(chǎn)物為食，故體內(nèi)積存了大量泥沙［21］。而二甲基三硫、甲基苯酚（間甲基苯酚和4-甲基苯酚）、2-甲氧基-3-異丁基吡嗪均是水體、土壤中常見的臭味物質(zhì)。二甲基三硫作為地龍魚腥味的特征性物質(zhì)，也是為沼澤／腐敗氣味的主要來源，中國東南地區(qū)（地龍主產(chǎn)區(qū)）水域可檢測到高濃度硫醚類物質(zhì)［22-23］。水體中也常出現(xiàn)酚類污染，常造成魚類的“酚臭味”，可能是地龍中甲基苯酚的來源之一［24］。

因此，針對地龍中特征異味物質(zhì)的理化性質(zhì)、環(huán)境來源及生物轉(zhuǎn)化途徑，可開發(fā)不需輔料、炮制矯味的高效矯味方法。本研究通過明確地龍共有腥臭氣物質(zhì)基礎(chǔ)及特征異味物質(zhì)，為地龍去腥除臭提供新思路，為動物藥的腥臭氣研究提供參考。課題組將針對地龍不同氣味的特征物質(zhì)進一步開展矯味方法研究。