辛芳鼻炎膠囊對大鼠變應(yīng)性鼻炎的改善作用

張 勇，張 斌，吳 瑕，宋 紋

（1.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院中醫(yī)科，天津 300052； 2.黃驊神農(nóng)居醫(yī)院中醫(yī)科，河北 滄州 061100； 3.天津宏仁堂藥業(yè)有限公司，天津 300385）

辛芳鼻炎膠囊主要由辛夷、白芷、細辛等10 余味藥物組成，常用于治療慢性鼻炎、鼻竇炎。早期研究已初步證實辛芳鼻炎膠囊具有抗炎，抗過敏等藥理作用［1］，近年來亦有該藥物用于治療變應(yīng)性鼻炎（allergic rhinitis，AR）的散在臨床報道［2-3］，但目前尚未見該藥物干預(yù)AR 動物模型的實驗研究報道。本研究擬通過建立AR 大鼠模型，對辛芳鼻炎膠囊抗炎、抗過敏藥理作用及其干預(yù)機制進行初步研究，以期為擴大其臨床適應(yīng)癥提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 SPF 級雄性SD 大鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司［實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK （京）2016-0006］，體質(zhì)量160～200 g，分籠飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所實驗動物中心空調(diào)動物房，室溫22 ～26 ℃，相對濕度55% ～65%，12 h／12 h 晝夜節(jié)律光照，自由進食、飲水，定期更換、消毒飼養(yǎng)籠，保持環(huán)境清潔，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d 后開始實驗。本研究方案經(jīng)過中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所倫理委員會審核并通過（倫理號IRMDWLL-2020078）。

1.2 藥物與試劑 辛芳鼻炎膠囊（規(guī)格0.25 g／粒，批號BL09002，天津宏仁堂藥業(yè)有限公司）； 氯雷他定片［規(guī)格10 mg／片，批號JS12630，拜耳醫(yī)藥（上海）有限公司］。卵清蛋白 （OVA）、氫氧化鋁 ［Al （OH）3］（批號SLBX8657、WXBB1151，美國Sigma 公司）； 吸入用七氟烷（批號20011431，上海恒瑞醫(yī)藥有限公司）； 10%緩沖中性甲醛（批號B09D00119，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司）； 大鼠OVA-sIgE、HIS、LTC4、IL-4、IFN-γ ELISA試 劑 盒 （ 貨 號 ML620587、ML002986、ML003188、ML102825、ML002833，上海酶聯(lián)生物科技有限公司）。

1.3 儀器 DNM-9602 型酶標(biāo)儀［普朗科（北京）科技有限公司］； DM3000 型光學(xué)顯微鏡、DFC 420C 型顯微數(shù)碼成像系統(tǒng)（德國徠卡公司）； TL-18M 型臺式高速冷凍離心機（上海離心機械研究所有限公司）； AL204 型電子分析天平（瑞士梅特勒托利多公司）。

2 方法

2.1 大鼠AR 模型的建立

2.1.1 全身致敏 參照宋興興等［4］報道的方法并加以改進，首先將OVA 溶于無菌生理鹽水 （終質(zhì)量濃度為0.4 mg／mL），然后與等體積氫氧化鋁混懸液混合均勻，每只大鼠腹腔注射混合液l mL （含0.2 mg OVA 和20 mg 氫氧化鋁），隔日致敏1 次，連續(xù)致敏7 次； 對照組大鼠腹腔注射等體積無菌生理鹽水。

2.1.2 鼻腔激發(fā) 第15 天至第21 天，大鼠經(jīng)七氟烷吸入短暫全身麻醉后，以5% OVA 溶液雙側(cè)滴鼻，每次50 μL／鼻孔，每天1 次，對照組大鼠以等體積生理鹽水滴鼻。在末次滴鼻完成后，觀察大鼠噴嚏、抓鼻及流涕情況，按趙氏疊加量化計分法［5］進行評估，觀察時間30 min，總分≥5 分表示造模成功。評分標(biāo)準(zhǔn)為①鼻癢，大鼠抓鼻1 ～5次記為1 分，6～10 次記為2 分，10 次以上記為3 分； ②噴嚏，大鼠打噴嚏4 個以下記為1 分，4～10 個記為2 分，10個以上記為3 分； ③流涕，大鼠鼻涕流至鼻前孔記為1 分，超過鼻前孔記為2 分，涕流滿面記為3 分。將造模成功的大鼠隨機分為模型組、陽性對照組（氯雷他定）及辛芳鼻炎膠囊低、中、高劑量組，每組8 只。

2.2 藥物干預(yù) 所有藥物事先均以0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液懸浮，使用前充分搖勻，其中辛芳鼻炎膠囊低、中、高劑量分別為0.25、0.5、0.75 g／kg，氯雷他定劑量為1 mg／kg［6］。自第22 天（造模結(jié)束24 h 后）開始，各給藥組大鼠分別灌胃給予相應(yīng)藥物混懸液，對照組及模型組大鼠均予以等量0.5% CMC-Na 溶液灌胃，每天1次，連續(xù)干預(yù)14 d。

2.3 行為學(xué)觀察 末次給藥結(jié)束后，按照“2.1.2” 項下評分標(biāo)準(zhǔn)，再次對大鼠進行行為學(xué)觀察和評分，觀察時間30 min。

2.4 標(biāo)本采集 第36 天（干預(yù)結(jié)束24 h 后），所有大鼠經(jīng)10%水合氯醛溶液（300 mg／kg）腹腔注射麻醉后，腹主動脈取血5 mL，置于含有惰性分離膠和促凝劑的真空取血管中靜置2 h 后，3 000 r／min 離心15 min，血清經(jīng)分裝后置于-40 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈ⊙戤吅笱杆傺乇侵芯€剪開大鼠鼻腔，暴露鼻中隔及雙側(cè)鼻腔，提取鼻中隔（含鼻中隔軟骨及其雙側(cè)黏膜），置于10% 緩沖中性甲醛溶液中固定72 h。

2.5 鼻黏膜組織病理觀察 鼻黏膜組織標(biāo)本放入5%甲酸溶液中脫鈣3 d，梯度乙醇脫水，透明，石蠟包埋，切片（厚度4 μm），HE 染色后封片，于光學(xué)顯微鏡下觀察鼻腔組織內(nèi)覆蓋各部位的黏膜上皮細胞有無變性、壞死，黏膜下有無充血、水腫及炎細胞浸潤，鼻腔內(nèi)有無炎性分泌物等。

2.6 細胞因子水平檢測 采用ELISA 法檢測大鼠血清OVA-sIgE、HIS、LTC4、IL-4 及IFN-γ 水平，嚴(yán)格參照試劑盒說明書操作，于酶標(biāo)儀450 nm 波長處讀取吸光度，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算相應(yīng)細胞因子濃度值。

2.7 統(tǒng)計學(xué)分析 通過SPSS 22.0 軟件進行處理，計量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩組間比較方差齊性時采用LSD 檢驗，方差不齊時則采用Tamhane 檢驗。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 辛芳鼻炎膠囊對AR 大鼠一般情況的影響 在造模階段，對照組大鼠飲食及日常行為活動無異常，被毛光亮柔順，無頻繁的噴嚏、抓鼻、流涕等表現(xiàn)； 與對照組比較，其余各組大鼠體質(zhì)量減輕，活動力下降，常可看到前鼻孔甚至瞼結(jié)膜潮濕，頻繁出現(xiàn)噴嚏、抓鼻動作，部分大鼠可見血性鼻涕，少數(shù)大鼠還會出現(xiàn)一過性喉中哮鳴音。

3.2 辛芳鼻炎膠囊對AR 大鼠行為學(xué)評分的影響 如表1所示，給藥前，各給藥組與模型組大鼠行為學(xué)評分比較無差異（P＞0.05）。給藥結(jié)束后，與對照組比較，模型組大鼠行為學(xué)評分升高（P＜0.05）； 與模型組比較，辛芳鼻炎膠囊中、高劑量組以及陽性對照組大鼠行為學(xué)評分降低（P＜0.05）。

3.3 辛芳鼻炎膠囊對AR 大鼠鼻黏膜組織病理學(xué)變化的影響 對照組大鼠鼻黏膜組織結(jié)構(gòu)完整清晰，表面覆有假復(fù)層柱狀纖毛上皮，上皮間有多量分泌黏液的杯狀細胞，上皮細胞排列整齊，平滑，沒有杯狀細胞増生，黏膜下層腺體正常，未見增生，無嗜酸性粒細胞、中性粒細胞等炎性細胞侵潤，血管無擴張充血； 模型組大鼠鼻黏膜上皮細胞有不同程度的脫落、壞死，杯狀細胞增生，出現(xiàn)明顯的小血管擴張和組織間隙水腫現(xiàn)象，存在以嗜酸性粒細胞為主的炎細胞廣泛浸潤，腺體增生、腫脹，黏膜表面分泌物增多； 各給藥組大鼠鼻黏膜較模型組有不同程度的改善，炎性浸潤，小血管擴張和組織間隙水腫均減輕，其中陽性對照組和辛芳鼻炎膠囊中、高劑量組變化相近，見圖1。

圖1 各組大鼠鼻黏膜組織病理學(xué)觀察（HE，×400）

3.4 辛芳鼻炎膠囊對AR 大鼠血清OVA-sIgE、LTC4、HIS、IL-4I 及FN-γ 水平的影響 如表2 所示，與對照組比較，模型組大鼠血清OVA-sIgE、LTC4、HIS 及IL-4 水平升高（P＜0.05），IFN-γ 水平降低（P＜0.05）； 與模型組比較，辛芳鼻炎膠囊中、高劑量組及陽性對照組大鼠血清OVA-sIgE、LTC4、HIS 及IL-4 水平降低（P＜0.05），IFN-γ水平升高（P＜0.05）。

表2 各組大鼠血清OVA-sIgE、HIS、LTC4、IL-4 及IFN-γ 水平比較（x±s，n＝8）

4 討論

AR 又稱過敏性鼻炎，是人體接觸變應(yīng)原后，由免疫球蛋白E （IgE）介導(dǎo)而涉及多種免疫細胞和炎癥因子共同參與的鼻黏膜非感染性疾病，屬于Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)性疾?。?］。該病典型癥狀為陣發(fā)性噴嚏，大量清水樣涕，鼻癢及鼻塞等，其發(fā)病率占整個人群的10% ～20%［8］。

AR 發(fā)病機制錯綜復(fù)雜，至今尚未完全明確，已知當(dāng)機體首次接觸變應(yīng)原后，經(jīng)抗原呈遞細胞傳遞給Th 細胞，并分化為Th2 細胞，Th2 細胞進而誘導(dǎo)B 細胞分泌IgE 并聚集于鼻黏膜。當(dāng)變應(yīng)原再次進入機體內(nèi)時，將會與IgE 結(jié)合，誘發(fā)肥大細胞脫顆粒后釋放組胺、白三烯等炎性遞質(zhì)，促進嗜酸粒細胞浸潤，致使鼻黏膜上皮細胞損傷，毛細血管擴張，通透性增高，腺體分泌增加，引起鼻塞、噴嚏、流涕等癥狀［9］。體內(nèi)IgE 異常表達是誘發(fā)此類鼻炎的主要原因，且血清總IgE 水平與患者病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)［10］。已有研究表明，組胺是引起機體過敏反應(yīng)的重要的血管活性物質(zhì)，其在體內(nèi)具有促進血管擴張、增強毛細血管通透性及腺體分泌增加等效應(yīng)，介導(dǎo)了I 型變態(tài)反應(yīng)的發(fā)生［11］。氯雷他定作為第二代抗組胺藥物，具有抑制肥大細胞釋放白三烯和組胺等藥理作用，是當(dāng)前治療AR 的一線口服藥物，故本研究將其作為陽性對照藥物。目前普遍認(rèn)為Th1／Th2 細胞免疫失衡是引起AR 的關(guān)鍵［12］，Th1 細胞主要分泌IL-2、IFN-γ 等細胞因子以參與細胞免疫應(yīng)答； Th2 細胞主要分泌IL-4、IL-5 等細胞因子以參與體液免疫應(yīng)答，其中IL-4 能夠促進β 細胞轉(zhuǎn)變?yōu)闈{細胞合成IgE，抑制IFN-γ 產(chǎn)生； 而IFN-γ 是IL-4 合成的生物拮抗劑，能增強Th1 細胞活性，抑制β 細胞合成IgE 和抑制Th0 細胞分化Th2 型細胞［13］，IL-4 和IFN-γ 常作為監(jiān)測Th 反應(yīng)的檢測指標(biāo)。當(dāng)特異性抗原作用于特應(yīng)性個體時，抗原信號呈遞給T 輔助淋巴細胞，使Th 細胞分化發(fā)生偏移，從而導(dǎo)致Th1／Th2 細胞因子網(wǎng)絡(luò)平衡失調(diào)，出現(xiàn)Th2＞Th1 反應(yīng)［14］。

現(xiàn)代藥理研究表明，辛夷的主要有效成分辛夷油能夠抑制Th2 細胞介導(dǎo)的免疫效應(yīng)，減少組胺的釋放，并且能夠上調(diào)Thl／Th2 的比值，促進IL-4、干擾素的表達，從而對AR 發(fā)揮一定的治療作用［15］。柴胡中的柴胡皂苷可抑制炎癥組織中組胺的釋放，抑制白細胞游走［16］。防風(fēng)的提取物能減少致敏小鼠血清IgE 的產(chǎn)生，從而延遲或減輕由卵蛋白致敏引起的I 型變態(tài)免疫反應(yīng)［17］。有研究表明，白芷內(nèi)的揮發(fā)油不但能夠抑制AR 患者肥大細胞脫顆粒，而且還能夠有效地對抗組胺引起的致炎反應(yīng)，降低毛細血管通透性，減輕或消除AR 癥狀［18］； 另有報道稱，白芷干預(yù)AR小鼠后，能有效改善小鼠的過敏性鼻炎癥狀，減輕其鼻黏膜組織損傷，其機制可能與下調(diào)Th17 比例，上調(diào)Treg 比例，恢復(fù)Th17／Treg 平衡有關(guān)［19］。有研究表明，黃芩的主要活性成分黃芩苷可調(diào)節(jié)Th1／Th2 細胞失衡，抑制IL-33／ST2 信號通路，對AR 治療作用明顯［20］； 另有報道稱，黃芩苷能夠緩解OVA 誘導(dǎo)的小鼠AR 癥狀，其機制與通過抑制細胞自噬來調(diào)控Th17／Treg 細胞分化平衡有關(guān)［21］。

本研究證實辛芳鼻炎膠囊可明顯改善AR 大鼠鼻黏膜癥狀，其機制與降低血清中OVA-sIgE、LTC4、HIS 和IL-4水平，升高血清IFN-γ 水平有關(guān)。