紫蘇葉抗急性肝損傷活性組分篩選及機(jī)制研究

王琪瑤，張艷蕾，龔張斌，張 勇，賈 琦，李醫(yī)明，朱維良

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，上海 201203； 2.中國科學(xué)院上海藥物研究所，上海 201203； 3.上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海 201203； 4.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

紫蘇為唇形科紫蘇屬植物紫蘇Perillafrutescens的帶葉嫩枝，屬于藥食同源中藥，味辛，性溫，歸肺、脾經(jīng)［4］。紫蘇葉、梗、果實(shí)可分別入藥，其中紫蘇葉是其最常用入藥部位，《名醫(yī)別錄》 始載其功效，謂能“下氣，除寒中”［5］，具有解表散寒、行氣和胃功效，主治風(fēng)寒感冒、惡心嘔吐、魚蟹中毒等癥［6］?，F(xiàn)代研究表明，紫蘇葉具有抗炎［7］、抗氧化［8］、抑菌［9］、抗腫瘤［10］和保肝等生理活性?，F(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道，紫蘇葉水提物和多糖對急性化學(xué)性肝損傷有保護(hù)作用并且可以改善2 型糖尿病大鼠肝損傷［11-13］。但上述研究并未系統(tǒng)比較紫蘇葉水煎液各組分之間的保肝活性差異，同時(shí)也未見紫蘇葉水煎液中總黃酮的保肝活性相關(guān)報(bào)道。本研究旨在探討紫蘇葉傳統(tǒng)水煎液不同組分對四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)的小鼠急性化學(xué)性肝損傷的保護(hù)作用，篩選最佳活性組分并探究其作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動物 SPF 級C57BL 雄性小鼠，6 周齡，體質(zhì)量（20.0±2.0）g，購自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司［實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號SCXK （滬）2018-0006］，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心［實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號SYXK （滬）2020-0009］，環(huán)境溫度25 ℃，相對濕度45% ～55%，光暗周期12 h／12 h，自由進(jìn)食飲水。動物實(shí)驗(yàn)經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn) （倫理號PZSHUTCM201218014），符合3R 原則。

1.2 藥物與試劑 干燥紫蘇葉（批號200111，安徽旭松中藥飲片有限公司）。蘆丁對照品（批號ST03950120，純度＞98%，上海詩丹德生物技術(shù)有限公司）； 奧貝膽酸（批號20052315，純度98%，上海士鋒生物科技有限公司）。95% 乙醇、CCl4、氯仿、異丙醇 （ 批號 20210514、20210901、20110419、20171121，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）； SOD、MDA 檢測試劑盒 （ 批號 20211115、20211020，南京建成生物工程研究所有限公司）； TGF-β1、TNF-α、IL-6、IL-1β 檢測試劑盒 （ 批號 A98110545、A28210852、A20610936、A201BH20133，杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司）； RNAiso Plus 試劑、PrimeScript? RT Master Mix 試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒（批號AA7102-1、RR036A、RR820A，日本TaKaRa 公司）。

1.3 儀器 安捷倫1260 型高效液相色譜儀、DAD 檢測器（美國Agilent 公司）； FD-1000 冷凍干燥機(jī)（東京理化器械株式會社）； 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi 公司）； 7020 型全自動生化分析儀（日本日立公司）； Synergy2 型多功能酶標(biāo)儀（美國BioTek 公司）； 5804R 型冷凍離心機(jī)增儀 （德國Eppendorf 公司）； D3024R 型高速冷凍離心機(jī) （美國Scilogex 公司）； 電子天平［賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司］； SCIENTZ-48 高通量組織研磨機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）； 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（瑞士Roche公司）； 超微量紫外分光光度計(jì)（美國賽默飛公司）； 光學(xué)顯微鏡（德國Carl Zeiss 公司）。

2 方法

2.1 紫蘇葉各組樣品制備 取干燥紫蘇葉150 g，加入20倍量去離子水，在100 ℃下浸提1 h，提取2 次，用紗布粗濾，合并得到浸提液2.5 L，將浸提液蒸發(fā)濃縮至200 mL，向濃縮液中加入600 mL 95%乙醇，靜置過夜，將上清液和固體部分冷凍干燥，得到上清液干燥樣品（14.1 g）與固體干燥樣品（25.0 g）。再取紫蘇葉醇沉固體20 g 通過大孔樹脂D101，依次以蒸餾水、10%乙醇為洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，并按照不同體積分?jǐn)?shù)乙醇濃縮合并得到多糖（7.4 g）和水溶性總黃酮（2.5 g）。

2.2 紫蘇葉上清液、固體及總黃酮組中黃酮含量測定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精確稱取蘆丁對照品5.3 mg 于25 mL 量瓶中，60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，得到質(zhì)量濃度為0.212 mg／mL 的蘆丁對照品溶液，再精密量取該蘆丁對照溶液0、1、1.5、2、3、4、5 mL，分別置于25 mL 量瓶中，加入0.3 mol／L 三氯化鋁溶液3.0 mL，再加入1.0 mol／L 醋酸鈉4.0 mL，用去離子水稀釋并定容至25 mL，搖勻，放置16 min，在344 nm 波長處測定吸光度，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），吸光度為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線［14］。

圖1為薏米添加量對產(chǎn)品品質(zhì)的影響。根據(jù)圖1所示薏米的添加量不能過多也不能過少，添加量過少會使薏米雞肉餅色澤較淺沒有薏米香味；而添加量過多會使薏米雞肉餅的顏色深且薏米的味道過重，掩蓋肉香味。所以可以確定薏米的添加量在20%左右適宜。

2.2.2 樣品含量測定 精確稱取固體、上清液干燥樣品及水溶性總黃酮各3.5 mg，分別置于10 mL 量瓶中，固體和總黃酮加去離子水定容至刻度，上清液加60%乙醇稀釋至刻度，搖勻得到質(zhì)量濃度為0.35 mg／mL 的供試品，再各取1 mL 供試品分別置于25 mL 量瓶中，加入0.3 mol／L 三氯化鋁溶液3.0 mL，再加入1.0 mol／L 醋酸鈉4.0 mL，用去離子水稀釋并定容至25 mL，搖勻，得到質(zhì)量濃度為14 μg／mL 的供試品。按照“2.2.1” 項(xiàng)下條件測定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出總黃酮含量。

2.3 動物分組、給藥及造模 將小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、陽性對照組（30 mg／kg 奧貝膽酸）、紫蘇葉水煎液組（120 mg／kg）、紫蘇葉水提醇沉上清液組（120 mg／kg）、固體組（120 mg／kg）、水溶性總黃酮組（120 mg／kg）及紫蘇葉多糖組（120 mg／kg），每組8 只。自造模前1 周起，分別灌胃給予相應(yīng)劑量藥物（20 mL／kg），每天1 次，連續(xù)7 d； 正常組和模型組灌胃給予等體積PBS。末次給藥2 h后，正常組腹腔注射花生油（10 mL／kg），其他各組小鼠腹腔注射0.5% CCl4（10 mL／kg）進(jìn)行造模。

2.4 血清生化指標(biāo)檢測 造模完成后禁食不禁水23 h，麻醉小鼠后摘除眼球取血，3 500 r／min 離心15 min，分離得血清，全自動生化分析儀檢測血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）活性和總膽紅素（TBIL）水平。

2.5 小鼠肝臟指數(shù)計(jì)算 將小鼠脫頸椎處死，迅速摘除肝臟置于生理鹽水中清洗，濾紙吸干水分、稱重，計(jì)算肝臟指數(shù)，公式為肝臟指數(shù)＝肝臟質(zhì)量／小鼠體質(zhì)量。

2.6 肝組織病理學(xué)檢查 迅速取出小鼠右葉肝臟組織，置于4%多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋，制備切片，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，蘇木素-伊紅（HE）染色，中性樹膠封固，于光鏡下觀察肝組織病理變化。

2.7 肝組織脂質(zhì)過氧化水平及炎性因子水平檢測 稱取肝組織100 mg，加入9 倍量0.9%氯化鈉溶液，研磨，制備成10%肝組織勻漿，按照試劑盒說明書檢測超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）水平，以及轉(zhuǎn)化生長因子-β1 （TGF-β1）、腫瘤壞死因子-α （TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）和白介素-1β （IL-1β）水平。

2.8 RT-qPCR 法檢測肝組織NLRP3、caspase-1、IL-1βmRNA 表達(dá) 稱取各組肝組織各25 mg，抽提總RNA，測定RNA 濃度，定量，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)制備cDNA。在PCR 八連管中加入各樣本，設(shè)置2 個(gè)復(fù)孔，向各cDNA 加樣本中加入相關(guān)引物和檢測試劑，上機(jī)反應(yīng)。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s； 95 ℃變性5 s，60 ℃退火35 s，70 ℃延伸60 s，共循環(huán)45 次。以2-ΔΔCT法計(jì)算各目的基因mRNA 相對表達(dá)。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列見表1。

表1 引物序列

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 22.0 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（±s）表示，組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 紫蘇葉上清液、固體和總黃酮中黃酮的含量 回歸方程為Y＝0.004 5X＋0.244 9 （R2＝0.999 2），在8.48～42.40 μg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

紫蘇葉上清液、固體和水溶性總黃酮中的黃酮含量如表2 所示，表明紫蘇葉水提醇沉固體組分中不僅含有多糖，還含有部分水溶性總黃酮。通過該水提醇沉方法得到紫蘇葉總黃酮的提取率為6.26%，并且通過大孔吸附樹脂分離能得到黃酮含量較高的水溶性總黃酮組分。

表2 紫蘇葉上清液、固體和總黃酮中黃酮的含量

3.2 紫蘇葉各組分對急性肝損傷小鼠肝臟指數(shù)的影響 如表3 所示，與正常組比較，模型組小鼠肝臟指數(shù)升高（P＜0.01）； 與模型組比較，陽性對照組和各給藥組小鼠肝臟指數(shù)降低（P＜0.05，P＜0.01），以總黃酮組效果最為顯著。

表3 紫蘇葉各組分對急性肝損傷小鼠肝臟指數(shù)的影響（x±s，n＝8）

3.3 紫蘇葉各組分對急性肝損傷小鼠血清ALT、AST 活性和TBIL 水平的影響 如圖1 所示，與正常組比較，模型組小鼠血清ALT、AST 活性和TBIL 水平均升高（P＜0.01），表明CCl4致小鼠急性肝損傷模型建立成功； 與模型組比較，陽性對照組、固體組和總黃酮組ALT、AST 活性和TBIL 水平均降低（P＜0.05，P＜0.01），以總黃酮組效果最優(yōu)，水煎液組ALT、AST 活性均降低（P＜0.05）。

圖1 紫蘇葉各組分對急性肝損傷小鼠血清ALT、AST 活性和TBIL 水平的影響（±s，n＝8）

3.4 紫蘇葉各組分對急性肝損傷小鼠肝組織病理學(xué)的影響 如圖2 所示，正常組肝小葉完整，輪廓清晰，肝細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞核結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞無腫脹、炎性浸潤，無壞死； 模型組肝細(xì)胞顯著變性，細(xì)胞索紊亂，肝細(xì)胞腫脹，胞漿疏松，可見多數(shù)細(xì)胞壞死，細(xì)胞核固縮消失，匯管區(qū)可見大量炎性細(xì)胞浸潤； 陽性對照組肝損傷程度降低，肝小葉結(jié)構(gòu)基本完整，肝細(xì)胞排列較規(guī)則，肝組織內(nèi)炎性浸潤程度明顯減輕； 紫蘇葉各組分組均可不同程度地減輕肝組織病變，以水溶性總黃酮的改善效果最明顯，肝小葉清楚可見，肝細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞腫脹、壞死、炎性細(xì)胞浸潤等病理現(xiàn)象明顯改善。以上結(jié)果表明，紫蘇葉的水溶性總黃酮對肝臟的保護(hù)效果最為顯著，其次為固體組，且效果與陽性對照組無明顯差異。因此選用固體組和總黃酮組對保肝作用機(jī)制作進(jìn)一步研究。

圖2 各組小鼠肝組織HE 染色（×200）

3.5 紫蘇葉固體和總黃酮對急性肝損傷小鼠肝組織氧化應(yīng)激、炎癥及轉(zhuǎn)化生長因子水平的影響 如圖3 所示，與正常組比較，模型組小鼠肝組織TNF-α、IL-6、IL-1β 和MDA水平升高（P＜0.01），SOD 活性和TGF-β1 水平降低（P＜0.01）； 與模型組比較，固體組和總黃酮組小鼠肝組織TNFα、IL-6、IL-1β 和MDA 水平均降低（P＜0.05，P＜0.01），SOD 活性和TGF-β1 水平均升高（P＜0.05，P＜0.01），且總黃酮組效果更優(yōu)，陽性對照組小鼠肝組織TNF-α、IL-6、IL-1β 水平降低（P＜0.05），SOD 活性升高（P＜0.05）。

圖3 紫蘇葉固體和總黃酮對急性肝損傷小鼠肝組織氧化應(yīng)激、炎癥及轉(zhuǎn)化生長因子水平的影響（±s，n＝6）

3.6 紫蘇葉固體和總黃酮對急性肝損傷小鼠肝組織NLRP3、caspase-1 和IL-1βmRNA 表達(dá)的影響 如圖4 所示，與正常組比較，模型組小鼠肝組織NLRP3、caspase-1 和IL-1βmRNA 表達(dá)升高（P＜0.01）； 與模型組比較，陽性對照組、固體組和總黃酮組小鼠肝組織NLRP3、caspase-1 和IL-1βmRNA 表達(dá)均降低（P＜0.05，P＜0.01），且三組效果基本相當(dāng)。

圖4 紫蘇葉固體和總黃酮對急性肝損傷小鼠肝組織NLRP3、caspase-1 和IL-1β mRNA 表達(dá)的影響（±s，n＝6）

4 討論

CCl4誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷屬于化學(xué)性肝損傷，是保肝藥物篩選研究中的經(jīng)典模型。目前認(rèn)為CCl4誘導(dǎo)肝損傷的主要機(jī)制與其自由基代謝產(chǎn)物有關(guān)。當(dāng)CCl4進(jìn)入機(jī)體后，在肝臟內(nèi)通過CYP450 酶代謝產(chǎn)生大量CCl3-電子自由基，再與氧結(jié)合生成CCl3O2-氧自由基，導(dǎo)致重要的抗氧化酶SOD 活性降低［15］，氧化終產(chǎn)物MDA 異常升高，引起肝細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，使細(xì)胞膜通透性增加，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的ALT 和AST 進(jìn)入血液［16］。

炎性小體是由NLRP3、凋亡相關(guān)微粒蛋白及caspase-1組成的多蛋白復(fù)合物，在炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，與肝臟疾病的發(fā)生密切相關(guān)［17］。當(dāng)肝臟受到CCl4刺激后，NLRP3 被激活，進(jìn)而活化前體caspase-1 （pro-caspase-1）轉(zhuǎn)變成有活性的caspase-1，在此基礎(chǔ)上通過剪切前體IL-1β（pro-IL-1β）激活有炎性作用的IL-1β 的成熟和分泌［18］，同時(shí)刺激TNF-α 和IL-6 等炎性因子的釋放，產(chǎn)生炎癥級聯(lián)反應(yīng)［19］。TNF-α 能與肝細(xì)胞膜上跨膜型TNF （mTNF）受體結(jié)合進(jìn)而損傷肝細(xì)胞［20-21］，與肝細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化形成相互促進(jìn)的惡性循環(huán)［22］； IL-1β 可以誘導(dǎo)肝細(xì)胞產(chǎn)生更多的炎性因子，進(jìn)一步加重肝臟的炎性損傷［23］； 隨后IL-6 在受到TNF-α 和IL-1β 刺激后會進(jìn)一步對其他細(xì)胞因子進(jìn)行調(diào)控從而擴(kuò)大肝細(xì)胞的免疫病理反應(yīng)［19］。而TGF-β1 是一種多功能的細(xì)胞因子，它在肝臟長期受損的情況下可以促進(jìn)纖維化的形成，但在早期炎性反應(yīng)中它具有負(fù)性免疫調(diào)節(jié)的作用［24-25］，可抑制多種免疫細(xì)胞的分化及細(xì)胞因子如TNF-α、IL-6 的分泌從而發(fā)揮抗炎的作用［26］。當(dāng)機(jī)體發(fā)生細(xì)胞因子風(fēng)暴時(shí)，多種促炎因子的釋放會導(dǎo)致TGF-β1 的大量損耗從而加重肝臟的炎癥反應(yīng)。因此，TNF-α、IL-6、IL-1β 以及TGF-β1 的水平能反映肝臟早期炎性損傷的程度。

本研究對中藥紫蘇葉水煎液不同組分的黃酮含量進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)紫蘇葉水提醇沉固體中不僅含有多糖成分，還含有一定濃度的水溶性總黃酮組分，在紫蘇葉藥材中的含量為37.07 mg／g，且用該水提醇沉工藝方法，可使紫蘇葉總黃酮的提取率達(dá)到6.26%。

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步采用了CCl4誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷模型研究紫蘇葉各組分對肝損傷的保護(hù)效應(yīng)，初步探討可能的分子機(jī)制。研究結(jié)果表明，紫蘇葉各組分均能不同程度地降低小鼠血清ALT、AST 活性和TBIL 水平，其中以紫蘇葉水溶性總黃酮的效果最佳，能增加肝組織SOD 活性，降低MDA 水平，同時(shí)升高TGF-β1 水平，并抑制促炎性因子TNF-α、IL-6 和IL-1β 的釋放。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，水溶性總黃酮還可以降低急性肝損傷小鼠肝組織NLRP3、caspase-1、IL-1βmRNA 表達(dá)。結(jié)果提示紫蘇葉水溶性總黃酮可能通過抑制NLRP3／caspase-1 信號活化，減少炎性因子的釋放，從而減輕CCl4急性肝組織炎性損傷，達(dá)到保肝的作用。

綜上所述，紫蘇葉中水溶性總黃酮是紫蘇葉發(fā)揮保肝降酶作用的關(guān)鍵組分，抑制NLRP3／caspase-1 炎性小體信號通路可能是其抗CCl4急性肝損傷的作用機(jī)制之一。