當(dāng)歸藤總黃酮超聲提取工藝優(yōu)化

姜鵬程，陸曄晗，常芮寧，宋 藝，王艾雯，王春麗*，郭美珠，張春芳

（1.華東理工大學(xué)藥學(xué)院，上海市新藥設(shè)計(jì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，制藥工程與過程化學(xué)教育部工程研究中心，上海 200030； 2.上海市寶山區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海 201999； 3.廈門大學(xué)附屬翔安醫(yī)院，福建 廈門 361005）

當(dāng)歸藤EmbeliaparvifloraWall.ex A.DC.又名小花酸藤子，為攀援灌木或藤本，具有活血化瘀、補(bǔ)腎強(qiáng)腰、調(diào)經(jīng)助陽等功效，民間常用于血瘀證、跌打骨折、腰腿酸痛、月經(jīng)不調(diào)、產(chǎn)后虛弱等病癥，也可用于風(fēng)濕免疫病、心痛或胃痛等［1-2］?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸藤在促進(jìn)血液循環(huán)、抗凝血、抗炎鎮(zhèn)痛方面具有一定療效［3-4］。目前，從當(dāng)歸藤中提取出的化學(xué)成分包含黃酮類、萜類、甾體類等［5］，但對當(dāng)歸藤總黃酮提取工藝優(yōu)化的研究尚少，本實(shí)驗(yàn)利用Plackett-Burman 法和Box-Behnken 響應(yīng)面法，探索其最佳超聲提取工藝。

1 材料

1.1 試劑與藥物 當(dāng)歸藤購于廣西中藥材養(yǎng)生堂，經(jīng)華東理工大學(xué)藥學(xué)院馬磊教授鑒定為紫金?？扑崽僮訉僦参锂?dāng)歸藤EmbeliaparvifloraWall.ex A.DC.的根與老莖。蘆丁對照品（上海笛柏生物科技有限公司，批號H355003）。硝酸鋁、氫氧化鈉、亞硝酸鈉（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；無水乙醇（上海沃化化工有限公司）。

1.2 儀器 FA2004 電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）； UV-754N 紫外分光光度計(jì)（上海奧譜勒儀器有限公司）； SHZ-DⅢ循環(huán)水真空泵（上海予華儀器設(shè)備有限公司）； RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海振捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）； DLF-18 流水式中藥粉碎機(jī)（溫州頂歷醫(yī)療器械有限公司）； KQ-300DE 數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 總黃酮含量測定

2.1.1 供試品溶液制備 當(dāng)歸藤置于50 ℃烘箱中烘干，粉碎過篩，分裝于密封袋中，陰涼處備用。稱取2 g 當(dāng)歸藤粉末，按料液比1 ∶30 加入60 mL 50%乙醇，60 ℃下超聲提取30 min，抽濾，濃縮除去乙醇，加水溶解定容至10 mL，即得。

2.1.2 對照品溶液制備 60% 乙醇溶解10 mg 蘆丁對照品，定容至50 mL，即得0.2 mg／mL 溶液。

2.1.3 測定方法 參考文獻(xiàn)［6-8］報(bào)道，取供試品、對照品溶液適量，加入5% NaNO2溶液0.4 mL，搖勻后靜置6 min，再加入10% Al （NO3）3溶液0.4 mL，搖勻后靜置6 min，最后加入4% NaOH 溶液4.0 mL，60% 乙醇定容。以純加試劑為空白對照，在510 nm 波長處檢測吸光度（A），測定總黃酮含量。

2.1.4 線性關(guān)系考察 分別取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 對照品溶液，置于10 mL 量瓶中，按“2.1.3” 項(xiàng)下方法測定吸光度。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），吸光度為縱坐標(biāo)（A）進(jìn)行回歸，得方程為A＝0.007 5X＋0.043 9 （R2＝0.999 3），在4～24 μg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 取對照品溶液6 份，顯色后按“2.1.3” 項(xiàng)下方法測定吸光度，測得其RSD 為2.63%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取當(dāng)歸藤粉末2 g，按“2.1.1” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，顯色后于0、10、20、30、40、50、60 min 按“2.1.3” 項(xiàng)下方法測定吸光度，測得其RSD 為1.48%，表明溶液在60 min 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取“2.1.1” 項(xiàng)下供試品溶液6 份，顯色后按“2.1.3” 項(xiàng)下方法測定吸光度，測得其RSD 為4.36%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn) 按“2.1.7” 項(xiàng)下方法測得供試品溶液中黃酮含量為18.146 μg／mL，取1 mL 供試品溶液，加入18 μg 對照品，共6 份，按“2.1.1” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，顯色后按“2.1.3” 項(xiàng)下方法測定吸光度，計(jì)算回收率。結(jié)果，蘆丁平均加樣回收率為99.51%，RSD為1.98%。

2.2 單因素試驗(yàn) 本實(shí)驗(yàn)對不同乙醇體積分?jǐn)?shù)（30%、40%、50%、60%、70%）、料液比（1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30、1 ∶35、1 ∶40）、超聲功率 （180、210、240、270、300 W）、超聲溫度（30、40、50、60、70 ℃）、超聲時(shí)間（20、30、40、50、60 min）進(jìn)行考察，研究其對總黃酮得率的影響。

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù) 稱取2 g 當(dāng)歸藤粉末，按料液比1 ∶30分別加入30%、40%、50%、60%、70%乙醇，60 ℃水浴中180 W 超聲提取30 min，制成生藥量2 mg／mL 的供試品溶液，測定總黃酮得率。由圖1 可知，總黃酮得率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在60%時(shí)達(dá)到最大值，可能的原因是大多數(shù)總黃酮類化合物呈弱極性或非極性，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，溶劑極性減弱，對總黃酮得率產(chǎn)生一定影響［9］。因此，適宜當(dāng)歸藤總黃酮提取的乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮得率的影響

2.2.2 料液比 稱取2 g 當(dāng)歸藤粉末，分別按料液比1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30、1 ∶35、1 ∶40 加入60%乙醇，60 ℃水浴中180 W 超聲提取30 min，制成生藥量2 mg／mL 的供試品溶液，測定總黃酮得率。由圖2 可知，總黃酮得率隨著料液比增加呈現(xiàn)先升高后降低，總體下降的趨勢，在1 ∶25 時(shí)達(dá)到最大值，可能原因是料液比過低時(shí)，溶劑無法充分浸潤藥材，造成總黃酮得率有所損失，而當(dāng)歸藤總黃酮含量有最大值，料液比增加，總黃酮溶解量不變，雜質(zhì)溶出量增大，造成總黃酮得率降低； 較高的料液比會削弱空化效應(yīng)釋放的能量，并且能量被溶液的過量體積吸收和損失，導(dǎo)致總黃酮得率降低［10］。因此，適宜當(dāng)歸藤總黃酮提取的料液比為1 ∶25。

圖2 料液比對總黃酮得率的影響

2.2.3 超聲功率 稱取2 g 當(dāng)歸藤粉末，按料液比1 ∶25加入60%乙醇，60 ℃水浴中分別以180、210、240、270、300 W 功率超聲提取30 min，制成生藥量2 mg／mL 的供試品溶液，測定總黃酮得率。由圖3 可知，總黃酮得率隨著超聲功率增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在240 W 時(shí)達(dá)到最大值，可能原因是超聲波處理的提取物中活性成分含量增加是由于超聲波輻射壓力引起的機(jī)械振動(dòng)，加速溶劑滲透，然而功率過大會升高溫度，高溫導(dǎo)致氣蝕現(xiàn)象減少，這是蒸汽壓增加以及溶劑黏度和表面張力降低的結(jié)果，從而降低提取率［11］。因此，適宜當(dāng)歸藤總黃酮提取的超聲功率為240 W。

圖3 超聲功率對總黃酮得率的影響

2.2.4 超聲溫度 稱取2 g 當(dāng)歸藤粉末，按料液比1 ∶25加入60% 乙醇，分別在30、40、50、60、70 ℃水浴中240 W超聲提取30 min，制成生藥量2 mg／mL 的供試品溶液，測定總黃酮得率。由圖4 可知，總黃酮得率隨著超聲溫度增加呈現(xiàn)先升高后降低，再次升高的趨勢，在50 ℃時(shí)達(dá)到最大值，可能原因是在低溫時(shí)升高溫度，溶液黏度下降，分子運(yùn)動(dòng)加快，擴(kuò)散性增強(qiáng)，有利于總黃酮類化合物溶出，繼續(xù)升高溫度使得其他雜質(zhì)溶出，總黃酮得率下降。因此，適宜當(dāng)歸藤總黃酮提取的超聲溫度為50 ℃。

圖4 超聲溫度對總黃酮得率的影響

2.2.5 超聲時(shí)間 稱取2 g 當(dāng)歸藤粉末，按料液比1 ∶25加入60%乙醇，50 ℃水浴中240 W 分別超聲提取20、30、40、50、60 min，制成生藥量2 mg／mL 的供試品溶液，測定總黃酮得率。由圖5 可知，總黃酮得率隨著超聲時(shí)間增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在40 min 時(shí)達(dá)到最大值，可能原因是提取時(shí)間過短，總黃酮類化合物未充分溶出，總黃酮得率此時(shí)較低； 提取時(shí)間過長，使總黃酮的結(jié)構(gòu)遭到一定損壞，雜質(zhì)的溶出量也會有一定增加，進(jìn)一步使得總黃酮得率下降［12］。因此，適宜當(dāng)歸藤總黃酮提取的超聲時(shí)間為40 min。

圖5 超聲時(shí)間對總黃酮得率的影響

2.3 Plackett-Burman 法 Plackett-Burman 法能以較少的實(shí)驗(yàn)次數(shù)對眾多因素進(jìn)行快速篩選，得到顯著影響因素［13］。本研究選擇超聲時(shí)間（A）、料液比（B）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（C）、超聲功率（D）、超聲溫度（E）作為影響因素，總黃酮得率（Y）作為評價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)五因素二水平共12 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行篩選，因素水平見表1，結(jié)果見表2。

表1 Plackett-Burman 試驗(yàn)因素水平

表2 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

通過Design-Expert 8.0.6.1 軟件對表2 數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。由此可知，超聲時(shí)間（A）、超聲功率（D）、超聲溫度 （E）對總黃酮得率有顯著影響 （P＜0.05），影響程度依次為超聲溫度＞超聲時(shí)間＞超聲功率，其余2 個(gè)因素影響不顯著，故選擇超聲時(shí)間、超聲功率、超聲溫度作進(jìn)一步響應(yīng)面分析。

表3 Plackett-Burman 試驗(yàn)方差分析

2.4 Box-Behnken 響應(yīng)面法 在Plackett-Burman 法基礎(chǔ)上，選擇超聲時(shí)間（X1）、超聲功率（X2）、超聲溫度（X3）作為影響因素，總黃酮得率（Y）作為評價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)三因素三水平共17 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)作進(jìn)一步優(yōu)化，因素水平見表4，結(jié)果見表5。

表4 Box-Behnken 響應(yīng)面法因素水平

表5 Box-Behnken 響應(yīng)面法設(shè)計(jì)與結(jié)果

通過Design Expert 8.0.6.1 軟件對表5 數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得方程為Y＝12.62＋0.072X1-0.33X2＋0.14X3-0.19X1X2-0.22X1X3-0.078X2X3-0.81-0.82-0.61。

對所得模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)［14-17］，結(jié)果見表6。由此可知，模型P＜0.000 1，具有高度顯著性； 失擬項(xiàng)P＝0.648 1 （P＞0.05），表明失擬不夠顯著； 模型相關(guān)系數(shù)R2為0.988 8，調(diào)整后相關(guān)系數(shù)Radj2為0.974 4，即該模型與實(shí)際試驗(yàn)的擬合程度良好，可用于對當(dāng)歸藤總黃酮的提取進(jìn)行分析和預(yù)測； 超聲功率（X2）、超聲溫度（X3）P＜0.05，表明影響顯著； 交互項(xiàng)中X1X2、X1X3、X12、X22、均有顯著影響，X2X3項(xiàng)交互作用不明顯，影響較不顯著，表明不同提取工藝與當(dāng)歸藤總黃酮得率之間不是單純的線性關(guān)系； 根據(jù)F值大?。╔2＞X3＞X1），各因素影響程度依次為超聲功率＞超聲溫度＞超聲時(shí)間。

表6 Box-Behnken 響應(yīng)面法方差分析

響應(yīng)面分析見圖6，可知超聲時(shí)間與超聲溫度的響應(yīng)面斜面最陡，等高線呈橢圓形，P值為0.008 7 （P＜0.01），表明兩者的交互作用極明顯，達(dá)到極顯著水平； 超聲時(shí)間與超聲功率的斜面較陡，P值為0.018 3 （P＜0.05），表明兩者的交互作用較明顯，達(dá)到較顯著水平； 超聲功率與超聲溫度的斜面較平坦，等高線圖偏圓，P值為0.247 8 （P＞0.1），兩者交互作用不顯著，影響較小。

圖6 各因素響應(yīng)面圖

最終確定，最優(yōu)提取條件為超聲時(shí)間40.54 min，超聲功率233.53 W，超聲溫度51.18 ℃，總黃酮得率為12.67%，結(jié)合實(shí)際情況，將其修正為超聲時(shí)間40 min，超聲功率240 W，超聲溫度50 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，料液比1 ∶25。按上述條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，測得總黃酮平均得率為12.59%，與理論值12.67%相差0.08%，說明此模型的預(yù)測較為良好穩(wěn)定，可用于當(dāng)歸藤總黃酮的提取。

3 討論與結(jié)論

作為民間喜用、各科常用的藤類中藥，當(dāng)歸藤相關(guān)研究較少，有效成分分析也不夠明確。本研究在當(dāng)歸藤總黃酮的提取中運(yùn)用超聲提取法，相較于中藥傳統(tǒng)提取工藝，具有時(shí)間短、效率高、綠色且經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點(diǎn)，但過久的超聲時(shí)間，過大的功率，以及不合適的溫度、料液比、溶劑濃度都會對提取率存在不利影響，因此需要對各因素進(jìn)行探究［18-19］。本研究以單因素試驗(yàn)作為基礎(chǔ)，利用Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)從5 個(gè)因素中篩選影響較大的3 個(gè)，再通過Box-Behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化，得到最優(yōu)工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，料液比1 ∶25，超聲功率240 W，超聲溫度50 ℃，超聲時(shí)間40 min，總黃酮平均得率為12.59%。Plackett-Burman 試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)顯示，此方法重復(fù)性良好，有助于當(dāng)歸藤的進(jìn)一步開發(fā)利用。

在研究料液比對總黃酮得率的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，得率在達(dá)最高后隨料液比的增加逐步降低，然而料液比增加到1 ∶35 時(shí)又出現(xiàn)升高趨勢，料液比再增加后，總黃酮提取率又下降，其原因可能是影響得率的因素較復(fù)雜，呈現(xiàn)出的結(jié)果由多個(gè)因素作用而影響，此時(shí)積極因素大于消極因素，呈現(xiàn)略升高趨勢。隨液料比增加，導(dǎo)致黃酮得率上升的積極因素有逐漸增加提取溶劑的體積有利于擴(kuò)大樣品與提取溶劑的接觸面積，更有利于樣品中總黃酮溶出［20］。消極因素有隨料液比的增加，溶出的黃酮也會被復(fù)溶，或有雜質(zhì)溶出，導(dǎo)致總黃酮得率降低。推測在料液比為1 ∶35 時(shí)與溶劑的接觸面積較1 ∶30 時(shí)大，受復(fù)溶及雜質(zhì)的影響較1 ∶40 時(shí)小，所以呈現(xiàn)升高趨勢。然而具體影響因素以及作用方式有待進(jìn)一步研究。