HPLC 法同時(shí)測定小兒清咽顆粒中6 種成分

何 艷，胡小祥，劉洋伽，戴 瑞，唐佳齊，張 輝*

（1.湘南學(xué)院藥學(xué)院，湖南 郴州 423000； 2.郴州市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，湖南 郴州 423000）

小兒清咽顆粒收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)（中藥成方制劑第六冊(cè)）》，由玄參、蒲公英、牛蒡子（炒）、薄荷、蟬蛻、板藍(lán)根、連翹、牡丹皮、青黛9 味中藥組成，具有清熱解表、解毒利咽功效，用于治療外感風(fēng)熱引起的小兒發(fā)熱頭痛、咽喉腫痛、咳嗽音啞等癥［1］，臨床效果顯著，但該制劑現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅有牛蒡子、靛藍(lán)的TLC 鑒別，無含量測定項(xiàng)，質(zhì)控指標(biāo)單一。目前，雖有研究針對(duì)小兒清咽顆粒中蒲公英所含綠原酸、咖啡酸，連翹所含連翹苷，玄參所含哈巴苷、哈巴俄苷，靛藍(lán)所含靛藍(lán)、靛玉紅等單一或多種成分建立了含量測定方法［2-7］，但尚未涉及牛蒡子，并且2020 年版《中國藥典》 一部蒲公英含量測定項(xiàng)以菊苣酸為指標(biāo)成分。因此，本實(shí)驗(yàn)依據(jù)小兒清咽顆粒處方配伍和中藥質(zhì)量標(biāo)志物確定原則［8］，選擇君藥蒲公英主要活性成分單咖啡酰酒石酸、菊苣酸［9-10］，臣藥連翹主要活性成分連翹酯苷A、連翹苷［11-12］，牛蒡子（炒）主要活性成分牛蒡苷［13-14］，使藥玄參主要活性成分哈巴俄苷［15-16］為研究對(duì)象，采用HPLC 法同時(shí)測定其含量，以期更全面地對(duì)該制劑質(zhì)量進(jìn)行控制和評(píng)價(jià)，也為相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)提升提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 型高效液相色譜儀，配置G1315D 型二極管陣列檢測器 （美國Agilent 公司）； XSE-205 型電子天平（0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多公司）； DZKW-D-2 型電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）； KQ-500DE 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 單咖啡酰酒石酸對(duì)照品（批號(hào)PRF10012701，純度99.84%，成都普瑞法科技開發(fā)有限公司）； 連翹酯苷A、菊苣酸、連翹苷、牛蒡苷、哈巴俄苷對(duì)照品 （批號(hào)111810-201707、111752-201703、110821-202117、110819-201812、111730-201508，純度 97.2%、96.0%、94.9%、95.0%、96.0%，中國食品藥品檢定研究院）。小兒清咽顆粒共12 批 （批號(hào)ZFA2006、ZBA2102、ZCA2001，A 公 司； 批 號(hào) 201004、201003、211213，B 公司； 批號(hào)220103、211201、211203，C 公司； 批號(hào)SB20017、SB20034、SB20014，D 公司，6 g／袋，有效期3 年）。色譜純甲醇、乙腈（德國Merck 公司）； 分析純甲酸、磷酸（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent Zorbax SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）； 流動(dòng)相乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脫（0 ～5 min，8%A； 5 ～15 min，8% ～15% A； 15 ～28 min，15% A； 28 ～40 min，15% ～25% A； 40 ～50 min，25% ～29% A； 50 ～55 min，29% ～35%A； 55～56 min，35% ～8%A； 56 ～60 min，8% A）； 體積流量1.0 mL／min； 柱溫30 ℃； 檢測波長330 nm （0 ～40 min，單咖啡酸酒石酸、連翹酯苷A、菊苣酸）、278 nm （40 ～60 min，連翹苷、牛蒡苷、哈巴俄苷）； 進(jìn)樣量10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 分別精密稱取單咖啡酰酒石酸、連翹酯苷A、菊苣酸、連翹苷、牛蒡苷、哈巴俄苷對(duì)照品8.18、6.99、7.26、6.30、9.21、5.02 mg，置于20 mL 量瓶中，70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別吸取0.5、2.5、1、1.5、3、0.5 mL，置于同一10 mL 量瓶中，70%甲醇定容至刻度，即得（各成分質(zhì)量濃度分別為20.42、84.93、35.43、44.84、131.2、9.638 μg／mL）。

2.2.2 供試品溶液 取裝量差異項(xiàng)下本品，混勻，取適量至研缽中研細(xì)，精密稱取1.5 g，置于具塞錐形瓶中，精密量取70%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率500 W，頻率40 kHz）處理30 min，靜置至室溫，70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過，濾液過0.45 μm 微孔濾膜，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按本品處方工藝和比例，分別制成缺玄參、缺蒲公英、缺連翹、缺牛蒡子（炒）的陰性樣品，按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備，即得。

2.3 專屬性試驗(yàn) 取對(duì)照品、供試品、陰性樣品溶液適量，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖1。由此可知，供試品、對(duì)照品溶液中各成分色譜峰保留時(shí)間一致，分離度均大于1.5，陰性無干擾，表明該方法專屬性良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取對(duì)照品溶液1、2、4、6、8、10 mL，70% 甲醇稀釋至10 mL，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.5 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液適量，70%甲醇稀釋2 倍，0.45 μm 微孔濾膜過濾，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6 次，測得單咖啡酰酒石酸、連翹酯苷A、菊苣酸、連翹苷、牛蒡苷、哈巴俄苷峰面積 RSD 分別為 0.26%、0.38%、0.45%、0.62%、0.64%、0.62%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取本品（批號(hào)ZCA2001）適量，按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于0、3、6、12、18、24 h 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6 次，測得單咖啡酰酒石酸、連翹酯苷A、菊苣酸、連翹苷、牛蒡苷、哈巴俄苷峰面積RSD 分別為1.75%、0.18%、1.29%、0.84%、0.76%、1.53%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取本品 （批號(hào)ZCA2001）6 份，每份約1.5 g，按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6 次，測得單咖啡酰酒石酸、連翹酯苷A、菊苣酸、連翹苷、牛蒡苷、哈巴俄苷含量RSD 分別為2.03%、0.64%、1.17%、0.50%、0.56%、0.79%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取各成分含量已知的本品（批號(hào)ZCA2001）6 份，每份0.75 g，置于具塞錐形瓶中，按1 ∶1 比例加入對(duì)照品溶液（0.137 6 mg／mL 咖啡酰酒石酸1 mL，0.357 3 mg／mL連翹酯苷A 2.5 mL，0.354 5 mg／mL 菊苣酸0.5 mL，0.298 7 mg／mL 連翹苷 1 mL，0.416 8 mg／mL 牛蒡苷2.5 mL，0.108 7 mg／mL 哈巴俄苷0.5 mL），70% 甲醇補(bǔ)足至25 mL，按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率。結(jié)果，單咖啡酰酒石酸、連翹酯苷A、菊苣酸、連翹苷、牛蒡苷、哈巴俄苷平均加樣回收率分別為97.63%、102.61%、96.80%、97.21%、98.27%、99.21%，RSD 分別為 1.93%、0.40%、1.11%、0.98%、0.78%、0.26%。

2.9 樣品含量測定 取12 批樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備2 份供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算含量，結(jié)果見表2。

表2 各成分含量測定結(jié)果（mg／袋，n＝2）Tab.2 Results of content determination of various constituents （mg／bag，n＝2）

3 討論

3.1 指標(biāo)成分選擇 預(yù)試驗(yàn)分別對(duì)蒲公英、玄參、板藍(lán)根、牡丹皮中咖啡酸、哈巴苷、（R，S）-告依春［17］、丹皮酚［18］進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)咖啡酸專屬性較差，哈巴苷、（R，S）-告依春、牡丹皮含量較低，故未納入本實(shí)驗(yàn)。

3.2 色譜條件選擇 本實(shí)驗(yàn)首先采用DAD 檢測器采集各成分在200 ～400 nm 波長范圍內(nèi)的光譜圖，發(fā)現(xiàn)單咖啡酸酒石酸、連翹酯苷A、菊苣酸、連翹苷、牛蒡苷、哈巴俄苷最大吸收波長分別為330、328、330、278、278、280 nm，故選擇278、330 nm 作為檢測波長。再考察了流動(dòng)相甲醇-水、乙腈-水，發(fā)現(xiàn)各成分色譜峰分離度、峰形較差，故分別添加不同體積分?jǐn)?shù) （0.05%、0.1%、0.15%）甲酸、磷酸，發(fā)現(xiàn)0.1%磷酸改善情況最好。同時(shí)，考察了不同色譜柱 ［Waters sunfire、Thermo Acclaim-C18、Agilent Zorbax-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）］對(duì)各成分色譜峰分離度的影響，發(fā)現(xiàn)Agilent Zorbax-C18色譜柱效果最好。

3.3 提取溶劑、方法選擇 本實(shí)驗(yàn)首先考察了甲醇／乙醇、70% 甲醇／乙醇、50% 甲醇／乙醇，發(fā)現(xiàn)70%甲醇提取時(shí)各成分得率最高，色譜峰峰形最好。再分別考察了超聲提取 （20、30、40、50 min）、回流提取（30、40、50、60 min）、溶劑體積（25、50 mL），發(fā)現(xiàn)25 mL 70% 甲醇超聲提取30 min 時(shí)各成分基本提取完全。

3.4 含量分析 表3 顯示，不同批次小兒清咽顆粒中連翹酯苷A、連翹苷含量波動(dòng)較大，可能與連翹產(chǎn)地、采收時(shí)間（老翹、青翹）有關(guān)，故生產(chǎn)廠家需密切關(guān)注該藥材質(zhì)量。