小薊TLC 鑒別方法優(yōu)化及小薊炭“炒炭存性” 內(nèi)在表征研究

盧 琪，張?zhí)鞚?，朱娟娟，曲珍妮，徐春?mèng)，戴衍朋*，石典花*

（1.山東省中醫(yī)藥研究院，山東 濟(jì)南 250014； 2.國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥蜜制和制炭炮制技術(shù)與原理重點(diǎn)研究室，山東 濟(jì)南 250014； 3.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100105； 4.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250014）

小薊為菊科植物刺兒菜Cirsiumsetosum（Wild.）MB.的干燥地上部分。春、秋二季花開(kāi)時(shí)采割，除去雜質(zhì)，曬干，其性甘、苦、涼，歸心、肝經(jīng)，具有涼血止血、散瘀解毒消癰的功效，常用于治療衄血、吐血、尿血、血淋、便血、崩漏、外傷出血、癰腫瘡毒等癥［1］。小薊主要含有黃酮類、苯丙素類、木脂素類、萜類、有機(jī)酸類等成分［2-5］，具有抗炎、抗菌、抗腫瘤、降壓、止血、凝血等作用［6-11］。臨床上有生品、炒炭品兩種規(guī)格的飲片，生品以涼血為主，炒炭后涼性減弱，收斂止血作用增強(qiáng)［12］。

目前中藥的鑒別方法有很多［13-14］，TLC 鑒別為常用的理化鑒別方法，具有操作簡(jiǎn)單、成本低等特點(diǎn)。2005 年版《中國(guó)藥典》［15］中首次收載小薊的TLC 鑒別方法，蒙花苷為小薊藥材質(zhì)量控制的指標(biāo)成分［16］，至2020 年版《中國(guó)藥典》 未曾改變。本研究擬對(duì)小薊的TLC 鑒別方法進(jìn)行改進(jìn)，探尋采用最常規(guī)的、成本較低的硅膠G 薄層板替代聚酰胺薄膜，同時(shí)將展開(kāi)劑更換為常見(jiàn)的試劑，降低成本和毒性。另外中藥炭藥炮制傳統(tǒng)理論要求“炒炭存性”，針對(duì)“小薊炭” 項(xiàng)下僅收載顯微鑒別項(xiàng)，且目前市售小薊炭大部分炒制過(guò)重的現(xiàn)狀，嘗試探尋并建立小薊炭“炒炭存性” 的內(nèi)在表征方法，建立能夠基于內(nèi)在質(zhì)量變化的表征小薊炭“炒炭存性” 的方法，可用于完善和提升小薊和小薊炭質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，保障其臨床用藥質(zhì)量。

1 材料

1.1 儀器 XS205 10-5DU 型電子天平 （瑞士Mettler-Tolodo 公司）； DHG-9146 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）； 三頻數(shù)控KQ-300VED 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）； DK-S26 型數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）； WFH-201B 型紫外儀（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）。

1.2 試劑與藥物 蒙花苷對(duì)照品（批號(hào)111528-202112）、小薊對(duì)照藥材 （批號(hào)121436-201803）（中國(guó)食品藥品檢定研究院）； 金合歡素對(duì)照品（批號(hào)BP0114，成都普瑞法科技開(kāi)發(fā)有限公司）。聚酰胺薄膜 （浙江省臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠）； 硅膠G 板（批號(hào)20140422，青島海洋化工廠分廠）。甲醇、乙酰丙酮、丁酮、乙醇、甲苯等均為分析純； 水為純凈水。小薊、小薊炭批號(hào)及廠家見(jiàn)表1，經(jīng)山東省中醫(yī)藥研究院中藥資源研究所林慧彬研究員鑒定小薊均為菊科植物刺兒菜Cirsium setosum（Wild.）MB.的干燥地上部分的切制品，小薊炭均為小薊的炒炭品。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 小薊TLC 鑒別方法優(yōu)化

2.1.1 2020 年版《中國(guó)藥典》 收載方法 取本品粉末0.5 g，加甲醇5 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL 使溶解，作為供試品溶液。另取小薊對(duì)照藥材0.5 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。再取蒙花苷對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg 的溶液，作為對(duì)照品溶液。按2020年版《中國(guó)藥典》 四部通則薄層色譜法0502，吸取上述3 種溶液各1 μL，分別點(diǎn)于同一聚酰胺薄膜上，以乙酰丙酮-丁酮-乙醇-水（1 ∶3 ∶3 ∶13）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以三氯化鋁試液，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1 可知，供試品與對(duì)照藥材、對(duì)照品在相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。

圖1 2020 年版《中國(guó)藥典》 法小薊TLC 色譜圖Fig.1 TLC chromatograms of Cirsii Herba using the methodoftheChinesePharmacopoeia 2020 Edition

2.1.2 方法優(yōu)化 取小薊粉末1 g，加甲醇10 mL，超聲處理15 min，過(guò)濾，作為供試品溶液。取小薊對(duì)照藥材，同法制成小薊對(duì)照藥材溶液。取蒙花苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL 含0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。按2020 年版《中國(guó)藥典》 四部通則薄層色譜法0502，吸取上述3 種溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 板上，以甲苯-丙酮-甲酸-甲醇（6 ∶3 ∶0.5 ∶2.5）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以三氯化鋁試液，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2 可知，供試品與對(duì)照藥材、對(duì)照品在相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。

圖2 優(yōu)化后的小薊TLC 色譜圖Fig.2 Optimized TLC chromatograms of Cirsii Herba

2.2 小薊炭TLC 鑒別及應(yīng)用研究 目前2020 年版《中國(guó)藥典》 中關(guān)于小薊炒炭程度是否適宜的評(píng)價(jià)僅有外觀標(biāo)準(zhǔn)，未有內(nèi)在評(píng)價(jià)指標(biāo)，使得目前市售小薊炭大部分炒制過(guò)重，影響臨床療效?；诖?，課題組結(jié)合小薊炭的外觀性狀，探尋采用TLC法建立小薊炭“炒炭存性” 的鑒別方法。

2.2.1 小薊炭TLC 鑒別研究 按2020 年版《中國(guó)藥典》 四部0213 炮制通則炒炭要求，對(duì)小薊炒炭時(shí)間及溫度進(jìn)行考察，經(jīng)全國(guó)第一批老藥工、知名中藥炮制專家姜保生鑒定，確定炒制溫度為400 ℃，炒制時(shí)間為20 min，所制得的小薊炭外表為棕褐色，符合2020 年版《中國(guó)藥典》 和傳統(tǒng)小薊炭炮制的外觀標(biāo)準(zhǔn)。按此條件用5 批小薊分別制備小薊炭，并進(jìn)行TLC 鑒別研究。

參照文獻(xiàn)［17］報(bào)道，取小薊炭粉末1 g，加甲醇10 mL，超聲處理15 min，過(guò)濾，作為供試品溶液。取小薊對(duì)照藥材，同法制成小薊對(duì)照藥材溶液。取蒙花苷、金合歡素對(duì)照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度均為0.50 mg／mL 的溶液，作為對(duì)照品溶液。按2020 年版《中國(guó)藥典》 四部通則薄層色譜法0502，吸取上述3 種溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 板上，以乙酸乙酯-甲醇-水（100 ∶20 ∶13）為展開(kāi)劑，展至約4 cm 時(shí)，取出，晾干，繼續(xù)以甲苯（水飽和）-甲酸乙酯-甲酸（4.5 ∶4.5 ∶0.5）展開(kāi)，晾干，噴以三氯化鋁試液，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，供試品與蒙花苷、金合歡素對(duì)照品在相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)。小薊炒炭前后化學(xué)成分發(fā)生變化，最明顯的是新產(chǎn)生了1 種成分，經(jīng)后續(xù)進(jìn)一步研究，確定其為金合歡素。

圖3 小薊炭TLC 色譜圖Fig.3 TLC chromatograms of Cirsii Herba Carbonisata

2.2.2 不同炒制程度小薊炭的識(shí)別 取小薊飲片適量，分別在400 ℃下制備炒制10、15、20、25、30 min 的小薊炭。根據(jù)傳統(tǒng)外觀鑒別經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為炒制10 min 為炒輕炭，炒制15 min 為炒較輕炭，炒制20 min 為炒適中炭，炒制25 min 為炒較重炭，炒制30 min 為炒重炭，按“2.2.1” 項(xiàng)下方法分別制備5 個(gè)炒制時(shí)間小薊炭供試品溶液。對(duì)照藥材溶液和對(duì)照品溶液的制備及展開(kāi)條件和顯色條件均同“2.2.1”，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4 可知，隨著炒制時(shí)間的延長(zhǎng)，蒙花苷的斑點(diǎn)逐漸縮小，顏色變淺，當(dāng)炒制時(shí)間為30 min 時(shí)，蒙花苷斑點(diǎn)基本消失，此時(shí)金合歡素斑點(diǎn)的面積亦變小，顏色變淺。炒制時(shí)間為10、15 min 時(shí)，供試品色譜中紅色的葉綠素斑點(diǎn)較明顯，結(jié)合小薊炭外觀性狀，認(rèn)為當(dāng)小薊炭TLC 鑒別中能夠同時(shí)識(shí)別出蒙花苷、金合歡素，且僅前沿處保留較小的葉綠素斑點(diǎn)時(shí)，小薊炭的質(zhì)量可達(dá)到“炒炭存性” 的標(biāo)準(zhǔn)要求，由此確定400 ℃炒制時(shí)間為20 min 的小薊炭為最佳炒制程度的小薊炭。

圖4 不同炒炭程度小薊TLC 色譜圖Fig.4 TLC chromatograms of differently charred Cirsii Herba

2.2.3 市售小薊炭TLC 鑒別 對(duì)市售5 批小薊炭的炒制程度進(jìn)行鑒別，供試品、對(duì)照藥材溶液和對(duì)照品溶液的制備及展開(kāi)條件和顯色條件均同“2.2.1”，結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5 可知，5 批市售小薊炭TLC 鑒別圖譜存在一定的差異，其中第1、4 批蒙花苷斑點(diǎn)較明顯，而第2、3、5 批小薊炭蒙花苷斑點(diǎn)較小，顏色較淺，根據(jù)TLC 鑒別結(jié)果，可判斷2、3、5 批小薊炭炮制較重，與外觀質(zhì)量判斷一致。

圖5 市售小薊炭TLC 色譜圖Fig.5 TLC chromatograms of Cirsii Herba Carbonisata in the market

2.3 UPLC 指紋圖譜 為驗(yàn)證“2.2.2” 項(xiàng)下不同炒制程度小薊炭TLC 鑒別結(jié)果，進(jìn)一步精確考察小薊及不同炒制程度小薊炭中蒙花苷、金合歡素的具體變化情況，對(duì)小薊炭“炒炭存性” 的內(nèi)在變化進(jìn)行進(jìn)一步表征，本研究采用UPLC 指紋圖譜法建立小薊炭“炒炭存性” 表征方法，并同時(shí)對(duì)蒙花苷、金合歡素的含量進(jìn)行測(cè)定。

2.3.1 色譜條件 ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）； 流動(dòng)相0.1%磷酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0 ～3.24 min，95% ～92%A； 3.24 ～15.12 min，92% ～75% A； 15.12 ～20 min，75% ～60%A； 20～25 min，60% ～20%A）；體積流量0.3 mL／min； 柱溫30 ℃； 檢測(cè)波長(zhǎng)330 nm； 進(jìn)樣量1 μL。理論板數(shù)按蒙花苷計(jì)算不低于1 500。

2.3.2 供試品溶液制備 取小薊和“2.2.2” 項(xiàng)下5 批不同炒制時(shí)間的小薊炭粉末（過(guò)3 號(hào)篩）約0.5 g，分別精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，回流提取30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3.3 對(duì)照品溶液制備 取蒙花苷、金合歡素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度為0.14、0.11 mg／mL 的對(duì)照品溶液。

2.3.4 小薊及不同炒制程度小薊炭UPLC 指紋圖譜 分別導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A）” 進(jìn)行比較，見(jiàn)圖6。小薊炒炭后，UPLC 指紋圖譜發(fā)生明顯的變化，大部分色譜峰的峰面積降低，也產(chǎn)生了新的色譜峰，通過(guò)歸屬發(fā)現(xiàn)，隨著炒制時(shí)間的延長(zhǎng)，蒙花苷峰面積逐漸變小，金合歡素峰面積呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)炒制過(guò)重時(shí)，蒙花苷與金合歡素峰面積均變小，該變化趨勢(shì)與“2.2.2” 項(xiàng)下TLC 鑒別結(jié)果一致。計(jì)算蒙花苷、金合歡素含量，見(jiàn)表2。400 ℃炒制15、20 min 時(shí)蒙花苷、金合歡素含量差別不大，結(jié)合外觀性狀及TLC 鑒別結(jié)果，進(jìn)一步確定最佳條件為炒制溫度400 ℃，炒制時(shí)間20 min。

圖6 小薊及其不同程度炒制品UPLC 指紋圖譜Fig.6 UPLC fingerprint of Cirsii Herba and its differently charred products

表2 小薊及其不同程度炒制品中蒙花苷、金合歡素含量（%，n＝2）Tab.2 Content of buddleoside and acacetin in Cirsii Herba and its differently charred products （%，n＝2）

3 討論

本研究將小薊的TLC 鑒別方法中的聚酰胺薄膜改成硅膠G 板，將展開(kāi)劑從乙酰丙酮-丁酮-乙醇-水（1 ∶3 ∶3 ∶13）改為甲苯-丙酮-甲酸-甲醇（6 ∶3 ∶0.5 ∶2.5），改進(jìn)的小薊TLC 鑒別方法具有操作簡(jiǎn)單，蒙花苷斑點(diǎn)清晰，重復(fù)性好，有效節(jié)約成本，減少有毒試劑使用等眾多優(yōu)點(diǎn)。改進(jìn)的TLC 鑒別方法經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證和多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，展開(kāi)效果好，分離度高。

小薊在炒炭的過(guò)程中，受加熱溫度和時(shí)間的影響，其中的黃酮類成分會(huì)發(fā)生變化［18-19］。本研究發(fā)現(xiàn)，小薊炒炭后新產(chǎn)生了1 種成分，根據(jù)黃酮類成分蒙花苷在炒炭過(guò)程中減少的現(xiàn)象，初步推測(cè)其可能為蒙花苷加熱后新產(chǎn)生的成分，對(duì)該成分分離后，采用UPLC 法和液-質(zhì)聯(lián)用綜合確認(rèn)為蒙花苷的苷元——金合歡素。因此金合歡素可用于有效識(shí)別小薊和小薊炭，作為提升小薊炭質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)的指標(biāo)。基于此采用二次展開(kāi)的方法建立了小薊炭TLC鑒別方法，該TLC 鑒別方法經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，證明展開(kāi)效果較好。后采用該方法對(duì)不同炒制程度的小薊炭進(jìn)行鑒別，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著炒制時(shí)間的延長(zhǎng)，蒙花苷斑點(diǎn)逐漸減少并消失殆盡，炒制過(guò)重時(shí)金合歡素亦消失。進(jìn)一步采用UPLC 法建立了小薊及其不同程度炒制品UPLC 指紋圖譜，同時(shí)對(duì)其蒙花苷和金合歡素的含量進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)蒙花苷與金合歡素的含量變化與TLC 鑒別結(jié)果一致。基于上述變化建立了采用TLC、UPLC 指紋圖譜判斷小薊炭“炒炭存性” 的內(nèi)在表征研究方法，該方法可用于鑒別小薊炭的炮制程度，有效提升因個(gè)體主觀差異，使得對(duì)小薊炭外觀質(zhì)量判斷標(biāo)準(zhǔn)不一的現(xiàn)狀。綜上所述，本研究初步建立了小薊炭“炒炭存性” 的內(nèi)在質(zhì)量鑒別標(biāo)準(zhǔn)，并從定量上進(jìn)行了驗(yàn)證，下一步將健全小薊炭“炒炭存性” 的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，深度解析小薊炭“炒炭存性” 的科學(xué)內(nèi)涵，有效保障小薊炭臨床用藥質(zhì)量。