HPLC 法同時(shí)測(cè)定大籽蒿和細(xì)葉亞菊中5 種成分

謝雨宸，彭 芳，王 悅，易 歡，徐鑫梅，范 剛

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137； 2.成都中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院，四川 成都 611137）

大籽蒿為常用藏藥材，在《晶珠本草》 《晶鏡本草》 等藏醫(yī)藥經(jīng)典著作中均有記載，為五味甘露藥浴湯散、二味小檗湯散等藏藥復(fù)方的組成藥味［1-2］。大籽蒿具有清熱、解毒、止血、消腫、利腎等功效，可用于治療四肢關(guān)節(jié)腫脹、肺病、腎病、咯血、氣管炎、風(fēng)濕痹痛等［3］?，F(xiàn)代藥理研究表明，大籽蒿提取物具有抗炎、抗癌、抗菌、降血糖［4-5］等活性。課題組前期調(diào)查發(fā)現(xiàn)，部分地區(qū)藏醫(yī)院或藥材市場(chǎng)以細(xì)葉亞菊Ajaniatenuifolia（Jacquem.ex DC.）Tzvelev in Schischk.＆ Bobrov 替代大籽蒿ArtemisiasieversianaEhrhart ex Willd.使用。然而，2 種藥材在臨床上能否替代使用仍然缺乏足夠的科學(xué)依據(jù)。

目前，對(duì)于大籽蒿和細(xì)葉亞菊的化學(xué)成分定性和定量研究較少［6-7］，然而2 種藥材之間的主要化學(xué)成分是否有差異目前沒(méi)有研究報(bào)道。HPLC 法具有分析速度快、靈敏度高、適用范圍廣等特點(diǎn)，在藏藥質(zhì)量控制及評(píng)價(jià)中發(fā)揮著重要的作用［8-11］。本研究采用HPLC 法首次建立大籽蒿和細(xì)葉亞菊中綠原酸、傘形花內(nèi)酯、蘆丁、異綠原酸A、異綠原酸C 的含量測(cè)定方法，并比較兩者的差異，以期為大籽蒿的質(zhì)量控制，以及細(xì)葉亞菊是否能替代大籽蒿入藥提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司）； Sartorius BP121s 電子天平［賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司］； SB-4200DTD 超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；ULUP-I-10T 優(yōu)普超純水機(jī)（成都超純科技有限公司）。

1.2 試劑與藥物 綠原酸（批號(hào)DSTDL002102）、傘形花內(nèi)酯（批號(hào)DSTDQ006602）、異綠原酸A（批號(hào) DSTDY054701）、異綠原酸 C （ 批號(hào)DSTDY003804）對(duì)照品購(gòu)自成都德思特生物技術(shù)有限公司； 蘆丁（批號(hào)MUST-17111601）對(duì)照品購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司，所有對(duì)照品純度均大于98%。甲醇、乙腈為色譜純； 其余試劑均為分析純； 水為超純水。

本研究共收集10 批大籽蒿和14 批細(xì)葉亞菊藥材，由成都中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院范剛教授鑒定分別為菊科蒿屬植物大籽蒿Artemisiasieversiana和亞菊屬植物細(xì)葉亞菊Ajaniatenuifolia的干燥地上部分。詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取綠原酸、傘形花內(nèi)酯、蘆丁、異綠原酸A、異綠原酸C 對(duì)照品適量，置于5 mL 量瓶中，加入甲醇制成質(zhì)量濃度為0.898、0.526、0.894、3.402、0.584 mg／mL 的貯備液。精密量取上述貯備液各3 mL 置于25 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL 含綠原酸0.108 mg、傘形花內(nèi)酯0.063 mg、蘆丁0.107 mg、異綠原酸A 0.408 mg、異綠原酸C 0.070 mg 的對(duì)照品溶液。

2.2 供試品溶液制備 取藥材粉末（過(guò)3 號(hào)篩）約0.2 g，精密稱定，置于100 mL 具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率480 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用50% 甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3 色譜條件 CAPCELL PAK-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）； 流動(dòng)相乙腈（A）-0.2%磷酸水（B），梯度洗脫（0 ～15 min，8% ～10% A；15～16 min，10% ～11%A； 16～20 min，11% ～14%A； 20～30 min，14% ～15%A； 30 ～40 min，15% ～17%A； 40 ～55 min，17% ～20% A； 55 ～65 min，20%A）； 體積流量1 mL／min； 柱溫30 ℃； 檢測(cè)波長(zhǎng)290 nm； 進(jìn)樣量10 μL。

2.4 專屬性試驗(yàn) 取對(duì)照品，大籽蒿、細(xì)葉亞菊供試品適量，在“2.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1。由此可知，各成分在同一保留時(shí)間上有相應(yīng)色譜峰，表明該方法專屬性良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.5 線性關(guān)系考察 精密量取對(duì)照品溶液0.5、1、2、4、8、10 mL，分別置于10 mL 量瓶中，加入甲醇定容至刻度，得到系列濃度的對(duì)照品溶液，在“2.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，結(jié)果見(jiàn)表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationship of various constituents

2.6 精密度試驗(yàn) 取同一份大籽蒿（批號(hào)DZH-4），按 “2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得綠原酸、傘形花內(nèi)酯、蘆丁、異綠原酸A、異綠原酸C 峰面積RSD 分別為0.10%、0.43%、0.17%、0.14%、0.71%，表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一份供試品溶液（批號(hào)DZH-4），于0、1、2、4、8、12、24 h 在“2.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得綠原酸、傘形花內(nèi)酯、蘆丁、異綠原酸A、異綠原酸C 峰面積RSD 分別為 0.13%、0.82%、0.27%、0.50%、1.75%表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取大籽蒿（批號(hào)DZH-4）6 份，按“2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得綠原酸、傘形花內(nèi)酯、蘆丁、異綠原酸A、異綠原酸C 含量RSD 分別為0.84%、1.18%、1.65%、1.21%、1.89%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn) 取各成分含量已知的大籽蒿粉末（批號(hào)DZH-4）6 份，每份0.1 g，精密稱定，精密加入各對(duì)照品適量，按“2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab.3 Results of recovery test of various constituents （n＝6）

2.10 樣品含量測(cè)定 取各批樣品粉末適量，按“2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 各成分含量測(cè)定結(jié)果（mg／g，n＝2）Tab.4 Results of content determination of various constituents （mg／g，n＝2）

2.11 大籽蒿與細(xì)葉亞菊5 種化學(xué)成分的比較分析 將表4 的數(shù)據(jù)導(dǎo)入GraphPad Prism 5.0 軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖2，可知2 種藥材中各成分含量均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

3 討論

3.1 供試品溶液制備及色譜條件考察 本研究考察了超聲、冷浸、水浴回流提取方法，考察了乙醇、甲醇、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇等溶劑的提取效率，并對(duì)提取時(shí)間（20、30、40 min）及溶劑用量（20、50、100 mL）進(jìn)行考察，最終發(fā)現(xiàn)以50 mL 50%甲醇超聲提取30 min 的效果最佳。此外，對(duì)流動(dòng)相、色譜柱、檢測(cè)波長(zhǎng)等進(jìn)行了考察，根據(jù)5 種化學(xué)成分的分離度、對(duì)稱因子等確定了最佳的HPLC 色譜條件。

3.2 各成分含量測(cè)定結(jié)果分析 本研究首次建立了大籽蒿中5 種化學(xué)成分的HPLC 含量測(cè)定方法。結(jié)果表明，大籽蒿中綠原酸、傘形花內(nèi)酯、蘆丁、異綠原酸A、異綠原酸C 的平均含量分別為3.61、0.71、1.46、8.74、1.44 mg／g，細(xì)葉亞菊中綠原酸、傘形花內(nèi)酯、蘆丁、異綠原酸A、異綠原酸C的平均含量分別為2.60、0.26、0.79、6.31、1.22 mg／g，兩者皆以異綠原酸A 含量最高，綠原酸含量次之，而傘形花內(nèi)酯的含量最低?，F(xiàn)代藥理研究表明，異綠原酸A 和異綠原酸C 具有抗炎、祛痰等作用［12］，綠原酸具有抗氧化、抗菌、保護(hù)心血管等作用［13-14］，蘆丁具有抗炎、抗菌、抗氧化等作用［15］，傘形花內(nèi)酯具有抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)［16-18］等作用。這5 種成分的藥理活性與大籽蒿的功能主治密切相關(guān)，可能為其主要的活性成分，因此建立這5 種成分的含量測(cè)定方法對(duì)大籽蒿藥材的質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)具有重要的意義。

3.3 大籽蒿與細(xì)葉亞菊化學(xué)成分的比較分析 由于“同名異物” 和“同物異名” 現(xiàn)象、資源限制、不同地區(qū)用藥習(xí)慣差異等因素，藏藥在市場(chǎng)流通和臨床應(yīng)用過(guò)程中常出現(xiàn)地區(qū)習(xí)用品或替代品［19］。課題組前期調(diào)查發(fā)現(xiàn)，部分藏醫(yī)院或藥材市場(chǎng)以細(xì)葉亞菊替代大籽蒿使用。然而，目前對(duì)于兩者在臨床上是否能等同使用仍然缺乏科學(xué)依據(jù)。本研究結(jié)果顯示，大籽蒿與細(xì)葉亞菊中5 種成分均無(wú)顯著性差異（P＞0.05），表明兩者具有相似的化學(xué)成分，這說(shuō)明部分藏區(qū)用細(xì)葉亞菊替代大籽蒿入藥有一定的科學(xué)性。然而，本研究只比較了5 種主要化學(xué)成分，2 種藥材中其他成分是否有差異還需進(jìn)一步的研究。今后需加強(qiáng)化學(xué)成分分離及定性定量分析研究工作。此外，也應(yīng)采用藥理學(xué)研究方法評(píng)價(jià)2 種藥材的生物活性是否具有差異。通過(guò)化學(xué)成分和生物活性的比較，可多維評(píng)價(jià)2 種藥材的質(zhì)量差異，為其臨床合理用藥提供參考依據(jù)。