益腎軟堅散對功能性失調(diào)子宮出血小鼠子宮內(nèi)膜血管重塑的影響

楊冰琦，高麗敏，李永章，劉 霞

（1.河北省中醫(yī)院導(dǎo)管室，河北 石家莊 050011； 2.河北省中醫(yī)院泌尿外科，河北 石家莊 050011；3.河北省中醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北 石家莊 050011）

功能性失調(diào)子宮出血 （dysfunctional uterine bleeding，DUB）簡稱功血，是一種婦科常見的癥狀和體征［1］，其發(fā)病率約11% ～13%［2］。DUB 是由于下丘腦-垂體-卵巢軸調(diào)節(jié)異常使神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)功能紊亂從而導(dǎo)致的非正常性子宮出血［3］。DUB患者的臨床表現(xiàn)為月經(jīng)周期延長，經(jīng)量異常等，有時甚至出現(xiàn)陰道持續(xù)出血的現(xiàn)象［4-5］。DUB 降低女性的生活質(zhì)量，并給患者帶來了沉重的醫(yī)療負(fù)擔(dān)。目前DUB 的發(fā)病機(jī)制還未清晰，而子宮內(nèi)膜腺上皮和血管的再生是子宮內(nèi)膜修復(fù)和脫落的主要機(jī)制［6］，但目前國內(nèi)外關(guān)于改善DUB 子宮內(nèi)膜血管重塑的分子機(jī)制研究鮮有報道。

中醫(yī)認(rèn)為，腎虛血瘀、脾虛、血不歸經(jīng)等是導(dǎo)致功能失調(diào)性子宮出血的主要誘因［7］，而活血化瘀軟堅散的多種有效成分已被證實具有健脾補(bǔ)腎、活血化瘀之效［8］，益腎軟堅散在臨床上對于治療DUB 有一定療效，但其研究還不是很深入，且分子機(jī)制尚不清楚。因此，本研究擬驗證益腎軟堅散對DUB 小鼠子宮內(nèi)膜形態(tài)學(xué)變化及細(xì)胞凋亡，生殖內(nèi)分泌激素水平的調(diào)節(jié)作用及其使子宮內(nèi)膜血管重塑相關(guān)分子機(jī)制，以期為治療DUB 提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥物 參照張聰?shù)龋?］方法制備益腎軟堅散水煎劑，將丹參、炙鱉甲、生黃芪、全當(dāng)歸、蟲草菌絲等8 味中藥藥材（北京同仁堂石家莊店，經(jīng)河北省中醫(yī)院主任中藥師相聰坤鑒定為正品）常規(guī)水煎，濃縮為生藥量2 g／mL 的水煎劑。宮血寧膠囊（云南白藥集團(tuán)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字Z20020087，規(guī)格0.13 g×18 粒）； 米非司酮、米索前列醇 （華潤紫竹藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H20010633、H20000668，規(guī)格10 mg×2 s、0.2 mg×3 s）。TUNEL 凋亡試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，批號KGA7071）； 一氧化氮（NO）、血管緊張素（Ang Ⅱ）、卵泡刺激素（FSH）、黃體生成素（LH）、雌二醇（E2）、孕酮（P）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所有限公司，貨號A012-1-2、H185、H101-1-2、H206-1-2、H102-1、H089）； 免疫組化SP 法試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號SPN-9002）； DAB 顯色試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，批號DAB-0031／1031）； 肌動蛋白（β-actin）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9 （MMP-9）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）抗體（美國Cell Signaling Technology 公司，貨號4970、65373、98658、3852、3711）。

1.2 動物 46 只成熟未生育的C57BL／6 雌性小鼠，23 只C57BL／6 雄性小鼠，體質(zhì)量18 ～20 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司［實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK （京）2019-0009］，獨立飼養(yǎng)在河北醫(yī)科大學(xué) ［實驗動物使用許可證號SYXK （冀）2020-002］，環(huán)境溫度20 ～25 ℃，相對濕度（50±5）%。動物實驗已獲得河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物福利倫理委員會批準(zhǔn)（倫理號IACUCHebmu-2021042），并盡最大努力減少動物痛苦，減少實驗中的動物數(shù)量。

1.3 儀器 高速低溫離心機(jī)（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司，型號H2050R）； 垂直電泳槽、電泳儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司，型號JY-SCZ4＋、JY200C）；、水平脫色搖床（江蘇科析儀器有限公司，型號TY-80A）； 化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀（上海天能科技有限公司，型號5200）； 高速低溫組織研磨儀（武漢賽維爾生物科技有限公司，型號KZ-III-F）； 超低溫冰箱（海爾集團(tuán)公司，型號DW-86L386）； 全功能酶標(biāo)儀 MK3 （美國Thermo Fisher Scientific 公司）。

1.4 分組、造模及給藥 參照呂小波等［10］方法，按照雌性小鼠與雄性小鼠2 ∶1 的比例合籠，次日8：00 檢查陰栓與陰道涂片，以發(fā)現(xiàn)精子為妊娠第1 天。隨機(jī)選擇32 只妊娠小鼠分為對照組、模型組、益腎軟堅散組和宮血寧膠囊組，每組8 只。造模組小鼠在妊娠第7 天8：00 灌胃米非司酮（8.3 mg／kg），18：00 灌胃米索前列醇（100 μg／kg），將棉球（60 ～65 mg）填入陰道內(nèi)，次日檢查棉球有血漬表示建模成功，對照組灌胃等量生理鹽水。造模成功后第1 天，對照組和模型組灌胃生理鹽水，宮血寧膠囊組灌胃0.07 g／kg 宮血寧膠囊溶液，益腎軟堅散組參照文獻(xiàn)［9］報道換算成小鼠用量，灌胃28.9 g／kg 益腎軟堅散水煎劑，每天1次，連續(xù)給藥7 d。

1.5 HE 染色觀察子宮內(nèi)膜組織形態(tài)學(xué) 妊娠第14 天，小鼠脫頸處死后，采集子宮內(nèi)膜組織，固定于4%中性甲醛溶液中，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，制備石蠟切片（4 μm），蘇木精與伊紅染色，于顯微鏡下觀察子宮內(nèi)膜組織形態(tài)學(xué)變化及子宮內(nèi)膜厚度變化，拍照并保存。

1.6 ELISA 法檢測血清FSH、LH、E2、P 水平和子宮內(nèi)膜組織Ang Ⅱ、NO 活性 妊娠第14 天，小鼠脫頸處死后采集腹主動脈血液2 mL，2 000 r／min離心15 min，分離得血清，采用試劑盒檢測血清FSH、LH、E2、P 水平。采集子宮內(nèi)膜組織后按照試劑盒說明書檢測Ang Ⅱ、NO 活性。

1.7 TUNEL 法檢測子宮內(nèi)膜組織凋亡情況 取子宮內(nèi)膜組織石蠟切片，置于染色缸中，用二甲苯浸洗2 次，每次5 min，使用TUENL 試劑盒染色，滴加50 μL TDT 酶反應(yīng)液（置于冰上），于濕盒內(nèi)37 ℃避光反應(yīng)60 min，PBS 漂洗3 次，滴加50 μL Streptavidin-HRP 工作液，于濕盒內(nèi)37 ℃避光反應(yīng)30 min，PBS 漂洗3 次，每次5 min，滴加50 ～100 μL DAB 顯色10 min，PBS 漂洗3 次，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，流水沖洗，脫水后加抗熒光衰減封片液封片，熒光顯微鏡進(jìn)行圖像采集。

1.8 免疫組化法檢測子宮內(nèi)膜組織α-SMA 蛋白表達(dá) 取子宮內(nèi)膜組織，按EnVision 試劑盒說明書對子宮內(nèi)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行α-SMA 免疫組化染色。首先在低倍鏡下（×200）全面觀察切片，找出高血管密度區(qū)，然后在高倍視野下（×400）記錄5 個視野的微血管數(shù)，取平均值。α-SMA 以細(xì)胞膜棕黃色為陽性，并測定各組平均光密度值作為陽性率。

1.9 Western blot 法檢測子宮內(nèi)膜組織VEGF、bFGF、MMP-9、TGF-β 蛋白表達(dá) 取子宮內(nèi)膜組織，提取蛋白，將蛋白質(zhì)樣品經(jīng)SDS-PAGE 凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移到PVDF 膜后，于5% 封閉液中（TBST 配制）封閉2 h，加入VEGF、bFGF、MMP-9、TGF-β、β-actin 抗體，4 ℃孵育過夜，次日加入用5% BSA 配制的相應(yīng)二抗，室溫?fù)u床孵育1.5 h，TBST 洗膜3 次后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光法顯影，采用Image J 軟件對圖像進(jìn)行定量分析。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析 通過SPSS 20.0 軟件進(jìn)行處理，計量資料以（±s）表示，各組間比較采用單因素方差分析，組間均數(shù)比較采用最小差數(shù)（LSD）法。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 益腎軟堅散對DUB 小鼠子宮內(nèi)膜形態(tài)學(xué)變化的影響 如圖1 所示，與對照組比較，模型組小鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞增生，呈多層排列，較紊亂，部分上皮細(xì)胞變性壞死，見胞核固縮、崩解，胞質(zhì)溶解，子宮組織內(nèi)膜層變?。≒＜0.01），子宮內(nèi)膜固有層基質(zhì)細(xì)胞排列較緊密，基質(zhì)細(xì)胞增生，較多炎性細(xì)胞浸潤，見中性粒細(xì)胞、漿細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，提示造模后子宮內(nèi)膜形態(tài)學(xué)變化為不同細(xì)胞數(shù)量增多，且伴有炎癥和壞死； 與模型組比較，益腎軟堅散組和宮血寧膠囊組子宮組織內(nèi)膜、肌層和外膜結(jié)構(gòu)清晰，子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞排列較規(guī)則，子宮內(nèi)膜固有層基質(zhì)細(xì)胞增生，少量炎性細(xì)胞浸潤，主要見中性粒細(xì)胞，子宮腺結(jié)構(gòu)正常，腺上皮細(xì)胞排列整齊，子宮組織內(nèi)膜層變厚（P＜0.01），未見擴(kuò)張，表明益腎軟堅散和宮血寧膠囊處理后子宮內(nèi)膜的異常形態(tài)學(xué)變化得到改善。

圖1 益腎軟堅散對DUB 小鼠子宮內(nèi)膜形態(tài)學(xué)變化的影響（x±s，n＝5）Fig.1 Effects of Yishen Ruanjian Powder on morphological changes of endometrium in DUB mice （x±s，n＝5）

2.2 益腎軟堅散對DUB 小鼠血清激素水平的影響 如圖2 所示，與對照組比較，模型組小鼠血清FSH、E2、P 水平升高（P＜0.01），LH 水平降低（P＜0.01）； 與模型組比較，益腎軟堅散組和宮血寧膠囊組小鼠血清FSH、E2、P 水平降低 （P＜0.05，P＜0.01），LH 水平升高（P＜0.05）。

圖2 益腎軟堅散對DUB 小鼠血清激素水平的影響（±s，n＝10）Fig.2 Effects of Yishen Ruanjian Powder on serum hormone level in DUB mice （±s，n＝10）

2.3 益腎軟堅散對DUB 小鼠子宮內(nèi)膜組織凋亡的影響 如圖3 所示，與對照組比較，模型組小鼠子宮內(nèi)膜組織細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.01）； 與模型組比較，益腎軟堅散組和宮血寧膠囊組小鼠子宮內(nèi)膜組織細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.01）。

圖3 益腎軟堅散對DUB 小鼠子宮內(nèi)膜組織凋亡的影響（×400，x±s，n＝5）Fig.3 Effects of Yishen Ruanjian Powder on endometrial apoptosis in DUB mice （×400，x±s，n＝5）

2.4 益腎軟堅散對DUB 小鼠子宮內(nèi)膜血管重塑障礙的影響

2.4.1 益腎軟堅散對DUB 小鼠子宮內(nèi)膜組織α-SMA 蛋白表達(dá)的影響 如圖4 所示，與對照組比較，模型組小鼠子宮內(nèi)膜組織α-SMA 蛋白表達(dá)降低（P＜0.01）； 與模型組比較，益腎軟堅散組和宮血寧膠囊組小鼠子宮內(nèi)膜組織α-SMA 蛋白表達(dá)升高（P＜0.01）。

圖4 益腎軟堅散對DUB 小鼠子宮內(nèi)膜組織α-SMA 蛋白表達(dá)的影響（x±s，n＝5）Fig.4 Effects of Yishen Ruanjian Powder on endometrial α-SMA protein expression of DUB mice （x±s，n＝5）

2.4.2 益腎軟堅散對DUB 小鼠子宮內(nèi)膜組織AngⅡ和NO 活性的影響 如圖5 所示，與對照組比較，模型組小鼠子宮內(nèi)膜內(nèi)組織Ang Ⅱ活性升高（P＜0.01），NO 活性降低（P＜0.01）； 與模型組比較，益腎軟堅散組和宮血寧膠囊組小鼠子宮內(nèi)膜內(nèi)組織Ang Ⅱ活性降低（P＜0.05，P＜0.01），NO 活性升高（P＜0.05，P＜0.01）。

圖5 益腎軟堅散對DUB 小鼠子宮內(nèi)膜組織Ang Ⅱ和NO 活性的影響（x±s，n＝5）Fig.5 Effects of Yishen Ruanjian Powder on endometrial Ang Ⅱand NO activities of DUB mice （x±s，n＝5）

2.4.3 益腎軟堅散對DUB 小鼠子宮內(nèi)膜組織bFGF、MMP-9、TGF-β、VEGF 蛋白表達(dá)的影響如圖6 所示，與對照組比較，模型組小鼠子宮內(nèi)膜組織bFGF、MMP-9、TGF-β 蛋白表達(dá)升高 （P＜0.01），VEGF 蛋白表達(dá)降低（P＜0.01）； 與模型組比較，益腎軟堅散組和宮血寧膠囊組小鼠子宮內(nèi)膜組織bFGF、MMP-9、TGF-β 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05，P＜0.01），VEGF 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）。

圖6 益腎軟堅散對DUB 小鼠子宮內(nèi)膜組織bFGF、MMP-9、TGF-β、VEGF 蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝5）Fig.6 Effects of Yishen Ruanjian Powder on endometrial protein expressions of bFGF，MMP-9，TGF-β and VEGF of DUB mice （±s，n＝5）

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為功血屬于“崩漏” 范疇，該病是由于脾氣虛弱、統(tǒng)攝無力、沖任失固、不能攝血從而導(dǎo)致的，如果崩漏日久，耗傷氣血，氣虛運血無力，氣虛血瘀致血不歸經(jīng)，會進(jìn)一步加重崩漏癥狀［11］。研究表明益腎軟堅散具有活血化瘀的功效，其主要成分菟絲子、夏枯草等對心血管循環(huán)系統(tǒng)發(fā)揮保護(hù)作用［12-13］，提示益腎軟堅散可能對改善血管重塑有促進(jìn)作用。臨床研究表明益腎軟堅散對于治療子宮內(nèi)膜囊腺型增生性功血有效果［14］。

功血的發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚，現(xiàn)階段主要認(rèn)為功血是由患者子宮內(nèi)膜局部微環(huán)境改變及神經(jīng)內(nèi)分泌異常所致［15］。子宮局部微環(huán)境包括血管活性物質(zhì)、生長因子、細(xì)胞外基質(zhì)等，其中血管活性物質(zhì)包括Ang Ⅱ、NO 等，生長因子包括VEGF、bFGF、MMP-9、TGF-β 等。研究表明Ang Ⅱ可誘導(dǎo)小鼠血管重塑，恢復(fù)彈性蛋白的表達(dá)［16］； miR-214 在血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）中建立了Ang Ⅱ誘導(dǎo)的AT1R 信號與TGF-β 誘導(dǎo)的TβRI／Smad 信號之間的串?dāng)_，從而在血管重塑中發(fā)揮著關(guān)鍵作用［17］； VEGF 可以誘導(dǎo)分泌和血管重構(gòu)，促進(jìn)血管生成［18］； MMP-9 在血管炎癥反應(yīng)中表達(dá)上調(diào)，參與血管重構(gòu)過程［19］； bFGF 和VEGF 的表達(dá)升高時會減輕炎癥反應(yīng)，增加細(xì)胞增殖和血管生成［20］。當(dāng)血管活性物質(zhì)、生長因子及細(xì)胞外基質(zhì)異常時會使血管擴(kuò)張從而引起子宮局部微環(huán)境的改變導(dǎo)致子宮內(nèi)膜出血［21］。神經(jīng)內(nèi)分泌異常會導(dǎo)致內(nèi)分泌激素含量失衡從而引起功血，內(nèi)分泌激素包括FSH、LH、E2、P 等。研究表明機(jī)體下丘腦-腺垂體-卵巢軸的持續(xù)反饋環(huán)節(jié)異常，會引起黃體生成素、卵泡刺激素、孕激素及雌激素含量比例異常進(jìn)而引起功血［22］。

本研究發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞紊亂排列，細(xì)胞外基質(zhì)中較多炎性細(xì)胞分布，子宮內(nèi)膜厚度變薄，Ang Ⅱ、NO 活性及VEGF、bFGF、MMP-9、TGF-β、α-SMA 蛋白表達(dá)異常，F(xiàn)SH、LH、E2、P 激素水平失衡，提示造模成功。而當(dāng)給予益腎軟堅散干預(yù)后，子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞排列變規(guī)則，炎性細(xì)胞變少，子宮內(nèi)膜厚度變厚，血管活性物質(zhì)Ang Ⅱ、NO 活性及FSH、LH 等內(nèi)分泌激素水平及血管相關(guān)生長因子的表達(dá)趨于正常，表明益腎軟堅散對功血引起的小鼠子宮內(nèi)膜形態(tài)學(xué)異常、子宮內(nèi)膜血管重塑障礙及內(nèi)分泌激素水平失調(diào)具有改善作用。另外，益腎軟堅散干預(yù)后DUB 小鼠子宮內(nèi)膜組織細(xì)胞凋亡率降低，提示益腎軟堅散可以改善DUB 小鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡情況。

綜上所述，益腎軟堅散可以改善DUB 小鼠子宮內(nèi)膜形態(tài)學(xué)異常、子宮內(nèi)膜血管重塑障礙及細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，并可能通過下丘腦-腺垂體-卵巢軸調(diào)節(jié)生殖內(nèi)分泌激素水平進(jìn)而促進(jìn)卵泡成熟及排卵。