苦瓜中葫蘆烷型三萜成分及其抗肝纖維化活性的研究

岳佳音,徐 靜,張曉書(shū),趙余慶

1.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，沈陽(yáng) 110034；2.沈陽(yáng)藥科大學(xué)功能食品與葡萄酒學(xué)院，沈陽(yáng) 110016

肝纖維化（hepatic fibrosis，HF）是各種急、慢性肝病共同的病理基礎(chǔ)，主要特征為細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）合成增多、降解不足且過(guò)度沉積［1］。肝纖維化進(jìn)一步發(fā)展會(huì)演變?yōu)楦斡不踔粮伟?-3］，將嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。在肝損傷期間，靜止的肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSC）表型轉(zhuǎn)化成激活型并增殖，活化的HSC 是ECM 的主要來(lái)源細(xì)胞，因此抑制活化的HSC 增殖是治療肝纖維化的有效途徑。

苦瓜（Momordica charantiaL. ）系葫蘆科（Cucurbitaceae）苦瓜屬植物苦瓜的未成熟果實(shí)［4］，廣泛分布于熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)，在許多國(guó)家和地區(qū)均有入藥記載?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，苦瓜具有降血糖、降脂、抗腫瘤、抗病毒等作用［5-7］。自20 世紀(jì)60年代起，國(guó)內(nèi)外學(xué)者開(kāi)始對(duì)苦瓜的化學(xué)成分進(jìn)行研究，隨著分離手段和波譜技術(shù)的不斷進(jìn)步，目前分離得到的成分主要有酚類、黃酮類、三萜類、蛋白質(zhì)及多糖等［8］，其中葫蘆烷型三萜化合物被認(rèn)為是苦瓜中主要的活性成分，有抗腫瘤、降血糖、抗炎等多種生物活性［9-12］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，苦瓜中的葫蘆烷型三萜類成分能較好地抑制活化HSC 的增殖［13］。酸水解處理苦瓜乙醇提取物不但能富集一種或幾種活性好的苷元，還可能發(fā)現(xiàn)更多活性好的新苷元［14］。為進(jìn)一步從苦瓜中獲得更好的活性成分，本實(shí)驗(yàn)對(duì)苦瓜乙醇提取物酸水解后的化學(xué)成分進(jìn)行系統(tǒng)研究，從中分離并鑒定出10 個(gè)葫蘆烷型三萜化合物（結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1），并用四甲基偶氮唑鹽（methylthiazolyl tetrazolium， MTT）法對(duì)化合物1～7 進(jìn)行大鼠活化的肝星狀細(xì)胞t-HSC/Cl-6 的抑制增殖活性進(jìn)行測(cè)定，其中化合物1 和化合物2具有一定抑制t-HSC/Cl-6 增殖的作用。

圖1 化合物1～10 的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of compounds 1—10

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Bruker ARX-400 型核磁共振波譜儀、Bruker-IFS-55 紅外光譜儀、Bruker MicrOTOF-Q 高分辨電噴霧質(zhì)譜儀均購(gòu)自德國(guó)Bruker 公司；MOS 450 AF/CD 旋光測(cè)定儀（法國(guó)BioLogic 公司）；LC3000 型半制備高效液相色譜儀（北京創(chuàng)新通恒科技有限公司）；UV2800AH 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海尤尼柯儀器有限公司）；酶標(biāo)儀（美國(guó) Bio-Rad 公司）；柱色譜硅膠（青島海洋化工有限公司）；薄層硅膠GF254（青島海洋化工有限公司）；半制備色譜柱：YMCODS-A（250 mm×10 mm，5 μm，日本YMC 公司）；Sephedex HL-20 葡聚糖凝膠（瑞典GE-healthcare bio-sciences AB 公司）；MCI gel（75～150 μm，日本Mitsubishi 公司）。

1.2 試藥

氘代氯仿、氘代吡啶均購(gòu)自北京市漢威士波譜公司；色譜級(jí)甲醇、乙腈均購(gòu)自天津康科德科技有限公司；其余常規(guī)試劑均為分析純。DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基（HyClone 公司）；水飛薊素（silymarin，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%、MTT、二甲基亞砜均購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司）；大鼠肝纖維化細(xì)胞t-HSC/Cl-6 株（中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)）?？喙细稍镲嬈?013年購(gòu)自廣西柳州，由沈陽(yáng)藥科大學(xué)中藥學(xué)院路金才教授鑒定為葫蘆科植物苦瓜Momordica charantiaL. 的干燥未成熟果實(shí)。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取與分離

取苦瓜干燥未成熟果實(shí)飲片10 kg，用80 L 體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇加熱回流提取3 次，每次2 h，合并提取液濃縮至干，用水分散后，靜置冷卻，得到不溶于水的浸膏220 g。稱取浸膏100 g，用3 倍量甲醇溶解，得樣品溶液，加入100 mL 鹽酸水解，超聲30 min，靜置3 d，加大量水稀釋，離心，取沉淀于50 ℃干燥，稱定質(zhì)量，得水解產(chǎn)物48 g。

將鹽酸水解產(chǎn)物（48 g）用硅膠柱進(jìn)行層析分離，濕法裝入480 g 300～400 目硅膠，干法上樣，以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫（50∶1、25∶1、20∶1、10∶1、5∶1、3∶1、1∶1）。經(jīng)薄層色譜法檢識(shí)，用體積分?jǐn)?shù)為5%的香草醛溶液顯色，合并相同主斑點(diǎn)后得到6 個(gè)主要流份（Fr.A～Fr.F）。Fr.A 以石油醚為溶劑多次重結(jié)晶后，用半制備高效液相色譜純化（體積分?jǐn)?shù)為89%的甲醇），得到化合物3（50.1 mg）。Fr.B 經(jīng)硅膠柱層析，用石油醚-乙酸乙酯（100∶1、50∶1、20∶1）梯度洗脫，得到7 個(gè)流份（Fr.B1～Fr.B7）。 Fr.B4 經(jīng)Sephadex LH-20 凝膠柱層析（體積分?jǐn)?shù)為100%的甲醇） 洗脫，再用反相半制備HPLC 純化（體積分?jǐn)?shù)為83%的甲醇），得到化合物1（5.4 mg）和化合物2（4.6 mg）。Fr.C 經(jīng)硅膠柱層析，以石油醚-丙酮（100∶1、50∶1、20∶1、3∶1）梯度洗脫，得到8 個(gè)流份（Fr.C1～Fr.C8）。Fr.C5 經(jīng)Sephadex LH-20 凝膠柱層析（體積分?jǐn)?shù)為100%的甲醇）洗脫，再用HPLC 半制備高效液相色譜純化（體積分?jǐn)?shù)為89%的甲醇），得到化合物4（9.0 mg）、化合物6（15.0 mg）、化合物10（6.5 mg）。Fr.D 以石油醚-乙酸乙酯（10∶1）等度洗脫，得到5 個(gè)流份（Fr.D1～Fr.D5）。Fr.D3 經(jīng)反相半制備HPLC 純化（體積分?jǐn)?shù)為89%的甲醇），得到化合物7（11.3 mg）。Fr.F 經(jīng)MCI 柱色譜進(jìn)一步分離，以甲醇-水為流動(dòng)相梯度洗脫（30∶70、50∶50、70∶30、90∶10、100∶0），得到5 個(gè)流份（Fr.F1～Fr.F5）。Fr.F3經(jīng)過(guò)反相半制備HPLC 純化（體積分?jǐn)?shù)為89%的甲醇），分別得到化合物5（9.3 mg）、化合物8（23.8 mg）和化合物9（6.8 mg）。

2.2 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物3：白色無(wú)定形粉末。1H-NMR （400 MHz，CDCl3）δH：6.03（1H，dd，J= 9.7，1.9 Hz，H-6），5.63（1H，dd，J= 9.7，3.7 Hz，H-7），5.50（1H，m，H-23），δ5.39（1H，d，J=15.8 Hz，H-24），3.66（1H，d，J= 8.4 Hz，H-19A），3.50（1H，d，J= 8.4 Hz，H-19B），3.14（3H，s，25-OCH3），1.24（6H，s，CH3-26，CH3-27），1.19（3H，s，CH3-29），0.90（3H，s，CH3-21），0.88（3H，s，CH3-28），0.86（3H，s，CH3-30），0.85（3H，s，CH3-18）。13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δC：17.7（C-1），27.5（C-2），76.3（C-3），37.3（C-4），87.6（C-5），131.9（C-6），131.6（C-7），52.1（C-8），45.4（C-9），39.0（C-10），23.7（C-11），30.9（C-12），45.6（C-13），48.7（C-14），33.3（C-15），28.1（C-16），50.4（C-17），15.1（C-18），80.0（C-19），36.2（C-20），18.8（C-21），39.5（C-22），128.5（C-23），137.0（C-24），75.0（C-25），25.9（C-26），26.3（C-27），20.7（C-28），24.7（C-29），20.2（C-30），50.1（25-OCH3）。以上波譜數(shù)據(jù)與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的一致，故鑒定其為5β，19-epoxy-25-methoxycucurbita-6，23（E）-dien-3β-ol［17］。

化合物4：白色無(wú)定形粉末。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δH：5.83（1H，dd，J= 4.9 Hz，H-6），5.50（1H，m，H-23），5.38（1H，d，J=15.8 Hz，H-24），3.34（3H，s，7-OCH3），3.14（3H，s，25-OCH3），1.24（6H，s，CH3-26，CH3-27），0.89（3H，d，6.1 Hz，CH3-21），1.20，1.03，0.98，0.92，0.69（各3H，s，CH329，28，19，18，30-）。13C-NMR （100 MHz，CDCl3）δC：21.2（C-1），28.7（C-2），76.9（C-3），41.9（C-4），146.9（C-5），121（C-6），77.3（C-7），48.1（C-8），34.1（C-9），38.8（C-10），32.7（C-11），30.2（C-12），46.2（C-13），48.0（C-14），34.8（C-15），27.7（C-16），50.1（C-17），15.6（C-18），28.9（C-19），36.3（C-20），18.9（C-21），39.6（C-2），128.6（C-23），136.9（C-24），75.0（C-25），26.2（C-26），25.9（C-27），27.9（C-28），25.5（C-29），18.1（C-30），56.4（7-OCH3），50.4（25-OCH3）。以上波譜數(shù)據(jù)與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的一致，故鑒定其為karavilagenin A［18］。

化合物5：白色無(wú)定形粉末。1H-NMR （400 MHz，CDCl3）δH：6.11（1H，d，J= 15.8 Hz，H-24），6.03（2H，dd，J= 9.7，1.6 Hz，H-6），5.58（1H，m，H-23），5.63（2H，dd，J= 9.7，3.7 Hz，H-5），4.85（2H，s，H-26），3.66（1H，d，J= 8.4 Hz，H-19B），3.51（1H，d，J= 8.4 Hz，H-19A），1.19（3H，s，CH3-28），0.89（6H，s，CH3-29，CH3-30），0.88（3H，s，CH3-18），0.86（3H，s，CH3-27）。13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δC：17.6（C-1），27.4（C-2），76.2（C-3），37.2（C-4），87.5（C-5），131.8（C-6），131.5（C-7），52.0（C-8），45.3（C-9），38.8（C-10），23.6（C-11），30.8（C-12），45.5（C-13），48.6（C-14），33.2（C-15），28.1（C-16），50.3（C-17），14.9（C-18），79.9（C-19），36.6（C-20），18.7（C-21），39.8（C-22），129.2（C-23），134.2（C-24），142.2（C-25），114.2（C-26），18.7（C-27），20.5（C-28），24.6（C-29），20.1（C-30）。以上波譜數(shù)據(jù)與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的一致，故鑒定其為（23E）-5β，19-epoxycucurbita-6，23，25-triene-3β-ol［19］。

化合物6：白色無(wú)定形粉末。1H-NMR（400 MHz，Pyridine-d5）δH：6.14（1H，dd，J= 9.7，2.0 Hz，H-6），5.97（2H，m，H-23，H-24），5.62（1H，dd，J= 9.7，2.9 Hz，H-7），1.56（3H，s，H-27），1.56（3H，s，H-26），1.39（3H，s，H-28），0.97（3H，d，J= 5.9 Hz，H-21），0.90（3H，s，H-29），0.82（3H，s，H-18），0.77（3H，s，H-30）。13CNMR（100 MHz，Pyridine-d5）δC：18.4（C-1），28.4（C-2），76.6（C-3），38.0（C-4），88.0（C-5），132.8（C-6），131.8（C-7），52.5（C-8），45.8（C-9），39.6（C-10），24.2（C-11），31.3（C-12），46.0（C-13），49.1（C-14），33.7（C-15），28.5（C-16），50.5（C-17），15.4（C-18），80.2（C-19），36.9（C-20），19.2（C-21），39.9（C-22），124.6（C-23），142.1（C-24），70.1（C-25），31.3（C-26），31.4（C-27），25.0（C-28），21.4（C-29），20.6（C-30）。以上波譜數(shù)據(jù)與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的一致，故鑒定其為23E-5β，19-epoxy-cucurbita-6，23-dien-3β，25-diol［20］。

化合物7：白色無(wú)定形粉末。1H-NMR（400 MHz，Pyridine-d5）δH：6.40（1H，dd，J=9.7，2.1 Hz，H-6），5.69（1H，dd，J= 9.7，3.3 Hz，H-7），5.62（1H，m，H-23），5.58（1H，br. s，H-24），3.23（3H，s，25-OCH3），1.49（3H，s，H-29），1.34（3H，s，H-26），1.34（3H，s，H-27），0.96（3H，d，J= 4.0 Hz，H-21），0.95（3H，s，H-28），0.87（3H，s，H-30），0.83（3H，s，H-18）。13C-NMR（100 MHz，Pyridine-d5）δC：19.5（C-1），28.0（C-2），75.2（C-3），38.1（C-4），85.1（C-5），133.5（C-6），133.0（C-7），45.3（C-8），51.4（C-9），41.1（C-10），22.4（C-11），30.5（C-12），45.7（C-13），48.7（C-14），33.8（C-15），28.1（C-16），50.8（C-17），15.0（C-18），182.3（C-19），36.7（C-20），19.2（C-21），40.2（C-22），128.7（C-23），138.1（C-24），75.3（C-25），26.5C-26），26.9（C-27），24.2（C-28），21.3（C-29），19.7（C-30），50.5（25-OCH3）。以上波譜數(shù)據(jù)與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的一致，故鑒定其為25-Omethylkaravilagein D［21］。

化合物8：白色無(wú)定形粉末。1H-NMR（400 MHz，Pyridine-d5）δH：6.25（1H，dd，J= 9.7，2.0 Hz，H-6），5.66（1H，m，H-7），5.64（1H，m，H-24），5.54（1H，m，H-23），3.23（6H，s，7-OCH3，25-OCH3），1.51（3H，s，H-29），1.35（6H，s，H-26，H-27），1.17（3H，s，H-28），0.99（3H，d，J= 5.5 Hz，H-21），0.94（3H，s，H-18），0.83（3H，s，H-30）。13C-NMR（100 MHz，Pyridine-d5）δC：22.0（C-1），30.2（C-2），76.0（C-3），42.3（C-4），148.1（C-5），121.4（C-6），76.1（C-7），46.2（C-8），50.6（C-9），37.1（C-10），23.0（C-11），29.7（C-12），46.3（C-13），48.3（C-14），35.4（C-15），28.0（C-16），50.6（C-17），15.4（C-18），207.6（C-19），36.7（C-20），19.3（C-21），40.1（C-22），128.8（C-23），138.1（C-24），75.2（C-25），26.5（C-26），26.9（C-27），27.7（C-28），26.6（C-29），18.6（C-30），56.3（7-OCH3），50.6（25-OCH3）。以上波譜數(shù)據(jù)與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的一致，故鑒定其為（23E）-3β-hydroxy-7β，25-dimethoxycucurbita-5，23-dien-19-al［22］。

化合物9：白色無(wú)定形粉末。1H-NMR（400 MHz，Pyridine-d5）δH：5.83（1H，d，J= 5.0 Hz，H-6），5.57（2H，m，H-23，H-24），3.50（1H，m，H-3），3.43（1H，d，J=5.8 Hz，H-7），3.33（3H，s，7-OCH3），1.29（6H，s，H-26，H-27），1.20（3H，s，H-29），1.03（3H，s，H-28），0.97（3H，s，H-19），0.91（3H，s，H-18），0.88 （3H，d，J=6.0 Hz，H-21），0.69（3H，s，H-30）。13C-NMR（100 MHz，Pyridine-d5）δC：22.2（C-1），29.6（C-2），76.5（C-3），42.4（C-4），148.5（C-5），120（C-6），78.0（C-7），49.3（C-8），34.8（C-9），39.8（C-10），33.3（C-11），30.8（C-12），46.7（C-13），48.7（C-14），35.4（C-15），28.3（C-16），50.1（C-17），16.0（C-18），30.6（C-19），37.1（C-20），19.4（C-21），40.0（C-22），124.7（C-23），142.1（C-24），70.1（C-25），31.3（C-26），31.3（C-27），28.8（C-28），26.7（C-29），18.5（C-30），56.6（7-OCH3）。以上波譜數(shù)據(jù)與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的一致，故鑒定其為karavilagenin B［18］。

化合物10：白色無(wú)定形粉末。1H-NMR（400 MHz，Pyridine-d5）δH：6.33（1H，dd，J= 9.7，2.1 Hz，H-6），5.57（2H，m，H-23，H-24），5.50（1H，dd，J= 9.7，3.7 Hz，H-7），4.57（1H，s，H-19），3.38（3H，s，19-OCH3），1.56（3H，s，H-26），1.56（3H，s，H-27），0.97（3H，d，J=6.0 Hz，H-21），1.41，0.91，0.83，0.80（各3H，s，CH3-29，28，18，30）。13C-NMR（100 MHz，Pyridine-d5）δC：17.5（C-1），28.2（C-2），76.7（C-3），37.9（C-4），85.7（C-5），134.0（C-6），130.9（C-7），50.2（C-8），49.7（C-9），38.6（C-10），22.3（C-11），31.3（C-12），45.7（C-13），48.6（C-14），34.0（C-15），28.4（C-16），50.7（C-17），15.5（C-18），115.3（C-19），37.9（C-20），19.2（C-21），39.9（C-22），124.6（C-23），142.1（C-24），70.1（C-25），31.0（C-26），31.0（C-27），24.8（C-28），21.0（C-29），20.5（C-30），57.6（19-OCH3）。以上波譜數(shù)據(jù)與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的一致，故鑒定其為（19S，23E）-5β，19-epoxy-19-methoxycucurbita-6，23-dien-3β，25-diol［23］。

2.3 化合物體外抗肝纖維化活性的篩選

用 MTT 法測(cè)定單體化合物1～7 對(duì)t-HSC/Cl-6細(xì)胞增殖的抑制作用，選用水飛薊素作為陽(yáng)性對(duì)照藥，將化合物配制成濃度為0、10、30、60、100 μmol·L-1的溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大鼠肝纖維化細(xì)胞t-HSC/Cl-6 細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后接種于96 微孔板上，于37 ℃下恒溫培養(yǎng)12 h 后，除去培養(yǎng)液，每孔加入不同濃度藥物10 μL，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% 的CO2下恒溫培養(yǎng)48 h 后，加入質(zhì)量濃度為5 mg·mL-1的MTT 溶液10 μL，在37 ℃下恒溫培養(yǎng)4 h 后，小心吸棄孔內(nèi)上清液，每微孔加入DMSO 100 μL，輕微振搖后放置15 min，使甲瓚結(jié)晶能夠充分被DMSO 溶解。將96 微孔板置于酶標(biāo)儀上，在490 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的吸光度（A）值。并計(jì)算IC50值，結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明，化合物1 和化合物2 對(duì)t-HSC/Cl-6 細(xì)胞具有一定的抑制活性（IC50＜ 30.0 μmol·L-1）。

表1 化合物1～7 對(duì)t-HSC/Cl-6 細(xì)胞48 h 的IC50值 （±s，n = 3）Tab.1 IC50 values in 48 hours of the compounds 1-7 on t-HSC/Cl-6 cells （±s，n = 3）

表1 化合物1～7 對(duì)t-HSC/Cl-6 細(xì)胞48 h 的IC50值 （±s，n = 3）Tab.1 IC50 values in 48 hours of the compounds 1-7 on t-HSC/Cl-6 cells （±s，n = 3）

化合物1234 IC50/（μmol·L-1）25.9 ± 2.6 26.2 ± 2.8 79.5 ± 4.4 31.2 ± 2.0化合物567 silymarin IC50/（μmol·L-1）38.8 ± 5.7 137.1 ± 6.4 130.2 ± 5.4 195.5 ± 22.6

3 討論

本文對(duì)苦瓜未成熟果實(shí)酸水解后的化學(xué)成分及其抗肝纖維化活性進(jìn)行了研究，得到了10 個(gè)葫蘆烷型三萜皂苷元，化合物1 和化合物2 為首次從該植物中分離得到。活性篩選發(fā)現(xiàn)化合物1 和化合物2 對(duì)t-HSC/Cl-6 細(xì)胞有明顯的增殖抑制活性，其余化合物也對(duì)t-HSC/Cl-6 細(xì)胞有不同程度的增殖抑制活性。就目前報(bào)道的從苦瓜中得到的葫蘆烷型化合物而言，根據(jù)其母核結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，可分為兩大類：第一類的主要特征是C-5 與C-19 位由一個(gè)氧連接形成呋喃環(huán)，且C-6 和C-7 之間形成雙鍵，再根據(jù)C-3、C-7 和C-19 位上的氧化程度加以區(qū)分；第二類的主要特征是C-5 和C-6 之間形成雙鍵，再根據(jù)C-19 位上的氧化程度不同加以區(qū)分。母核結(jié)構(gòu)不同，構(gòu)效關(guān)系也不同，比如化合物1～3、5～7，屬于第一類母核結(jié)構(gòu)的化合物，分析結(jié)構(gòu)與活性發(fā)現(xiàn)在該母核結(jié)構(gòu)中，側(cè)鏈有2 個(gè)雙鍵形成共軛結(jié)構(gòu)化合物的活性要優(yōu)于側(cè)鏈僅有1 個(gè)雙鍵的化合物，表明共軛結(jié)構(gòu)能夠增強(qiáng)葫蘆烷型化合物對(duì)t-HSC/Cl-6 細(xì)胞的增殖抑制活性。對(duì)構(gòu)效關(guān)系更深入地研究將擴(kuò)大葫蘆烷型化合物的結(jié)構(gòu)多樣性，未來(lái)會(huì)進(jìn)一步探討。