硅烷化銀涂層鈦植入物的抗菌改性研究*

趙 波,馬鳳倉,何代華,侯中中

(上海理工大學 材料與化學學院,上海 200093)

0 引言

鈦及其合金主要包括Ti6Al4V和TiNb,其具有良好的生物相容性、機械性能和耐腐蝕性能,有較強的臨床應用潛力[1-6]。生物相容性是指一種材料與細胞和組織保持和諧的能力。當一種生物相容性材料被植入體內(nèi)時,將不會產(chǎn)生炎癥和免疫問題,容易被身體接受。影響生物相容性的因素主要有:合成植入物與周圍組織的相互作用、材料留在體內(nèi)的時間、材料的類型、合成植入物的形狀和大小等[7-13]。

目前,大量研究集中于評估鈦與周圍細胞之間的相互作用上。在人造鈦被植入后,各類相互作用被觸發(fā),釋放出各種信號,導致細胞附著,附著的細胞可能是單核細胞、中性粒細胞和巨噬細胞。人工髖關節(jié)、膝關節(jié)和種植牙是微生物定植和生物膜形成的有利基質(zhì),在此處,宿主細胞和微生物競相占據(jù)植入物表面的更高部分,即所謂的“爭奪表面”。為了保證植入過程的成功并延長其有效壽命,提供預防生物膜形成的策略是至關重要的[14-18]。

與種植體相關的感染是最常見和最嚴重的術后并發(fā)癥之一,因此種植體材料的抗菌性能非常重要,有兩種方法可以解決這個問題:其一是通過加入非金屬材料對鈦表面進行修飾,如抗生素或具有抗菌性能的聚合物等;其二是通過加入抗菌金屬對鈦表面進行修飾。金屬納米顆粒現(xiàn)已被廣泛應用于材料科學、化學和醫(yī)學等領域。

Ag、Zn和Mg是優(yōu)秀的無機抗菌劑[19-24]。此外,Ag具有阻止人類免疫缺陷病毒(HIV)與宿主細胞結合的能力。納米銀比微米銀具有更大的表面積,因此其抗菌性能優(yōu)于微米銀。在金屬植入物上沉積納米銀層的技術有溶膠-凝膠、磁控濺射[25]和電沉積[26]等。此外,還可借助表面改性或預處理方法,在金屬基底上形成銀納米顆粒層。硅烷化是一種具有成本效益的工藝,在表面形成共價結合的硅烷單層,使頂部Ag層和底層基底之間形成接枝界面,這種方法可以顯著增加銀納米顆粒在表面的沉積數(shù)量[27-29]。

針對鈦植入物植入早期易被細菌感染的隱患,本文通過酸蝕和堿熱在鈦表面構建微納米網(wǎng)狀結構,通過硝酸銀和檸檬酸三鈉合成納米銀顆粒、硅烷改性納米銀液浸泡等步驟構建抗菌表面,并對鈦片表面的物理化學性能和抗菌性能進行研究,以期為鈦種植體的臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

鈦片(高純金屬材料研究所),APTES,NaOH,HF,丙酮,無水乙醇,無菌定性濾紙,PBS,CCK-8試劑盒,細菌培養(yǎng)板,硝酸銀,檸檬酸三鈉,pH試紙,硼氫化鈉,培養(yǎng)基(中國醫(yī)藥集團有限公司),大腸桿菌,金黃色葡萄球菌,成骨細胞(上海保藏生物技術中心總店),掃描電鏡(Zeiss Sigma 300),管式爐(南京博蘊通儀器科技有限公司),場發(fā)射環(huán)境掃描電子顯微鏡(TESCAN VEGA3),JC2000C1界面張力測量儀(上海中晨數(shù)字技術設備有限公司),Lambda 750 紫外/可見/近紅外光譜儀(Perkin Elmer)。

1.2 涂層制備方法

采用Ⅰ級商用純鈦圓片,直徑10 mm,厚1 mm;使用SiC金剛砂機械研磨紙張砂礫達到2 000目,然后用1 μm金剛石膏拋光,以獲得鏡面般的表面光潔度。隨后,將圓片放在丙酮、乙醇和蒸餾水介質(zhì)中進行10 min的超聲清洗。對該樣品進行兩步表面改性,具體步驟如下:

a.在室溫下,先將預處理后的樣品放入1.5% HF中蝕刻10 min,再將樣品浸泡在60 ℃、5 mol/L NaOH溶液中水浴處理24 h,用去離子水沖洗,并在干氮氣流下干燥;在600 ℃下保溫1 h,制備出表面具有微納米結構的鈦片。

b.經(jīng)化學蝕刻后的鈦片在5%的3-氨基丙基-三乙氧基硅烷(APTES)溶液中以乙醇為溶劑分別硅烷化2、4、6 h。硅烷化樣品在乙醇溶液中超聲清洗,然后用蒸餾水沖洗,在氮氣氣流中干燥。同時將鈦片分成6組:機械拋光組(NT)、噴砂酸蝕組(AT)、堿熱組(OH)、酸蝕堿熱硅烷化2 h組(OHJ2)、酸蝕堿熱硅烷化4 h組(OHJ4)和酸蝕堿熱硅烷化6 h組(OHJ6)。

1.3 含AgNPs層的沉積

為了制備含AgNPs層的沉積電解質(zhì),在100 mL去離子水中加入0.12 mmol/L AgNO3和檸檬酸三鈉。電解液制備在300 r/min的磁攪拌速率下進行。當?shù)玫骄鶆虻膽腋∫簳r,將0.3 mmol/L NaBH4加入配制好的溶液中;然后將經(jīng)過預處理的樣品浸入終液中3 h,使其表面形成含Ag層。最后,用清水沖洗Ag涂層基材,并在室溫下的氮氣氣流中干燥。

1.4 抗菌實驗

選用大腸桿菌和金黃色葡萄球菌進行材料抗菌實驗。將硅烷化處理2、4、6 h載銀鈦片分為3組,各靜置在PBS溶液中24 h,同時配制若干無菌定性濾紙盤(直徑6 mm),留出空白對照組,然后將其余組浸泡在已經(jīng)靜置24 h的鈦片PBS溶液中15 min,重復3次,最后將濾紙盤用高壓蒸汽鍋滅菌,干燥。用6 g蛋白胨、3 g酵母提取物、6 g NaCl、16 g瓊脂和600 mL蒸餾水制備液體培養(yǎng)基。用6 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)液體培養(yǎng)基pH為7.2～7.4,然后置于高壓蒸汽滅菌鍋中,在120 ℃下滅菌30 min,取出冷卻,得到固體培養(yǎng)基并將兩種菌種均勻涂覆在培養(yǎng)基上,然后將不同處理組的濾紙盤分別粘貼到固體培養(yǎng)基上,再將每個培養(yǎng)基放置在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育24 h,觀察抑菌圈的生長情況。

1.5 細胞培養(yǎng)

將每毫升密度為1×106的成骨細胞加入添加了10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素抗生素溶液的培養(yǎng)基中, 在95%的空氣及5%的CO2濕潤培養(yǎng)箱中于37 ℃下培養(yǎng)48 h,使用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)溶液,從培養(yǎng)基中除去未附著的細胞。每2 d更換一次培養(yǎng)基,培養(yǎng)5 d,再用MTT法檢測細胞增殖狀況。醫(yī)用植入材料植入人體后需要具備良好的生物相容性和骨結合能力,故對植入材料表面成骨細胞黏附增殖情況進行初步分析,以判定植入物材料是否具備良好的生物活性。細胞增殖指數(shù)(ICP)的計算公式為

(1)

2 結果與討論

2.1 表面形貌

經(jīng)機械拋光和噴砂酸蝕以及酸蝕堿熱后的3種鈦片表面掃描形貌見圖1。由圖1可知,在圖1(a)中經(jīng)機械拋光的鈦片表面是一個光滑的平面,圖1(b)中經(jīng)噴砂酸蝕后的鈦片表面形成了許多微米級的小凹坑,且部分凹坑有連接成網(wǎng)狀的趨勢,在圖1(c)中經(jīng)酸蝕堿熱處理的鈦片表面形成了均勻分布的海綿狀三維立體網(wǎng)狀結構,這種網(wǎng)狀結構能極大提升鈦片的生物活性及骨結合能力,且經(jīng)過酸蝕堿熱后的鈦片,氧含量會比未經(jīng)過堿熱處理后的鈦片高,可以增強鈦片表面的粗糙度和潤濕性。粗糙的表面增大了表面積和能量,從而提供了更多的非均相成核位點,能促進AgNPs層的沉積。

圖1 掃描電鏡下經(jīng)酸堿處理和機械處理后鈦片的表面形貌Fig.1 Surface morphology of the titanium sheet after acid-alkali treatment and mechanical treatment under scanning electron microscope

2.2 表面潤濕性能

改性后鈦片的親水性和粗糙度是影響材料生物學特性的關鍵參數(shù)。網(wǎng)狀表面的產(chǎn)生提高了材料的粗糙度和親水性,且此時細菌細胞壁的剛性結構不夠靈活,無法適應多孔網(wǎng)狀表面[30-31],可以有效防止細菌附著在材料上。圖2是改性后鈦表面的親水性變化。根據(jù)接觸角測量結果,經(jīng)機械拋光后的鈦片接觸角超過90°,是非親水性表面,不利于細胞黏附。經(jīng)噴砂酸蝕后的鈦片開始具有親水性,表面微孔結構使接觸角有一定程度的減小。經(jīng)酸蝕堿熱處理后的多孔網(wǎng)狀結構使接觸角顯著減小,呈現(xiàn)出極親水的狀態(tài),有利于細胞黏附。而在進一步硅烷化處理后,鈦表面形成了具有共價結合的硅烷單層,導致了各組水接觸角均有不同程度的增大。

圖2 鈦表面經(jīng)機械拋光(NT)、噴砂酸蝕(AT)、酸蝕堿熱(OH)處理后硅烷化2、4、6 h的表面潤濕性變化Fig 2 Surface wettability changes of titanium surface after mechanical polishing (NT),sand blasting and acid etching (AT),acid etching and alkali heat (OH) treatment for 2,4 and 6 hours of silanization

2.3 表面硅烷化

3-氨基丙基-三乙氧基硅烷(APTES)表面硅烷化是一種用烷氧基硅烷分子使表面功能化的過程。在預處理后的鈦表面形成共價結合的硅烷單層,從而使沉積的Ag層和底層鈦基底之間形成接枝界面。此外,APTES溶劑可以提高Si的含量和增加分散質(zhì)量。圖3是鈦預處理后硅烷化表面的EDS元素映射顯微圖。由圖3可知,隨著硅烷化時間的增加,鈦表面上Si含量升高,同時Si元素在整個表面分布更加均勻。由此推斷出,硅烷化過程中改變硅烷化時間可以顯著影響Si的含量,而Si是基板與金屬氧化物之間的附著劑,相對應的沉積銀納米粒子也會增加。

圖3 硅烷化2、4、6 h后鈦片表面的EDS元素映射顯微圖Fig.3 EDS elemental mapping micrographs of the surface of the titanium sheet after silanization for 2,4 and 6 hours

2.4 銀納米粒子合成

在由硝酸銀、檸檬酸三鈉和硼氫化鈉組成的電解液中,可以在蝕刻的硅烷鈦片上形成含AgNPs的層,反應式如下:

3AgNO3+C6H5O7Na3→3Ag+C6H5O7+3NaNO3,

(2)

2AgNO3+2NaBH4→2Ag+H2+B2H6+2NaNO3。

(3)

式(2)是從鹽中減少銀,式(3)是在銀核周圍形成一層銀,以限制納米顆粒的形狀和大小?？梢酝ㄟ^改變還原劑和蓋層劑的濃度來控制沉積顆粒的成核和生長速率。圖4是制備的銀納米粒子的紫外-可見光譜圖。由圖4可知,AgNPs的最大吸收波長為420 nm,這與文獻[32]中的結論一致。

圖4 銀納米粒子的紫外-可見光譜圖Fig.4 UV-Vis spectrum of silver nanoparticles

此外,將硅烷化不同時間的鈦片浸入相同濃度的納米銀液中3 h。圖5是硅烷化改性2、6 h沉積銀納米顆粒之后的鈦片表面掃描形貌。由圖5可知,硅烷化6 h的鈦片相比于2 h的鈦片,沉積的AgNPs更多。

2.5 抗菌活性

生物膜的形成以及微生物在植入物表面的定植,是決定植入過程成功和持久性的主要因素。本研究采用接觸殺滅策略清除附著在種植體表面的細菌,該方法是基于抗菌劑(包括AgNPs)在植入物表面的固定化,通過阻礙生物膜的形成來提供長期的抗菌活性,不需要輸送抗菌藥物。當AgNPs涂層的Ti暴露于細菌菌株中時,特定部分的AgNPs將被釋放出來,與現(xiàn)有的細菌接觸從而達到殺菌效果。

植入物表面的銀納米顆粒用來殺滅已經(jīng)到達植入物表面的細菌,在這樣的系統(tǒng)中可獲得長期高效的抗菌性能。在圖6中可以觀察到濾紙盤的抑菌圈直徑,發(fā)現(xiàn)銀納米顆粒對金黃色葡萄球菌的抗菌性略高于大腸桿菌。這可能是銀納米顆粒對革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌的活性差異所致,歸因于其表面特征,尤其是外細胞膜。而且大腸桿菌的外表面相對于金黃色葡萄球菌更柔軟,導致兩種細菌與接觸顆粒的相互作用方式存在很大差異。

圖6 空白對照組和硅烷化處理2、4、6 h載銀改性后的濾紙盤組孵育24 h的抑菌圈大小Fig.6 Size of bacteriostatic zone of blank control group and the silver-modified filter paper disc group incubated for 24 h after silanization for 2, 4, and 6 h

不同硅烷化時間處理下的載銀鈦片對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈大小有細微不同。從圖6中可以看出,銀納米顆粒在硅烷化鈦表面的沉積改善了鈦基底的抗菌特性,AgNPs的加入提高了鈦樣品的抑菌性能,這是由于在測試介質(zhì)中樣品表面釋放了Ag+,抗菌活性直接取決于介質(zhì)中Ag+的濃度。釋放的離子可以通過破壞細菌DNA復制、耗散質(zhì)子動力、增強膜透性、產(chǎn)生過量自由基破壞細菌功能等多種方式殺滅現(xiàn)有細菌。

但隨著硅烷化時間的增加,樣品對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抗菌效果降低,其原因可能是延長硅烷化時間使鈦片表面硅烷單層增多,與AgNPs共價連接更加牢固,抑制了更高濃度的負載銀納米顆粒的釋放,從而導致抑菌效果降低。

2.6 細胞增殖情況

生物相容性材料具有與宿主組織保持和諧的能力,同時對周圍細胞和組織的功能不會產(chǎn)生不良影響。為了評估負載AgNPs是否會對細胞造成不利影響,將樣品放在含有成骨細胞的細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d。表1列出了MTT檢測結果。由表1可知,OHJ2組鈦片具有最大的細胞密度。由于硅烷化處理后的鈦片表面具有硅烷單層,且硅烷單層本身具有良好的生物活性,經(jīng)硅烷單層包覆的載銀鈦片也具有一定的生物活性。樣品OHJ6的細胞密度最小,一般情況下,硅烷化時間越長,細胞密度越小。這是由于Ti表面Ag+濃度較高,長時間硅烷化產(chǎn)生了更強的鍵合,這可能會導致毒性。

表1 MTT分析結果Table 1 Results of 1MTT analysis

3 結論

本文研究了預處理鈦片表面蝕刻、硅烷化時間對Ag涂層鈦植入物的形態(tài)特征、抗菌活性和生物相容性的影響,得到以下主要結論:

a.鈦金屬作為一種惰性材料植入體內(nèi),其與骨結合只是一種機械鎖和,不能像生物材料那樣與骨產(chǎn)生生物體相互作用,對機體愈合無明顯促進作用;而經(jīng)預處理后,鈦片表面產(chǎn)生了三維立體網(wǎng)狀結構,表面更粗糙,親水性更好,更有利于與骨結合。

b.隨著硅烷化時間的增加,鈦片表面沉積的Si含量更高,分布更均勻,提高了對基材的附著力,形成了更均勻的硅烷單層,沉積了更多的金屬顆粒。

c.硅烷化2 h的Ag涂層鈦片表現(xiàn)出了最大的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌圈,同時細胞密度最大。隨著硅烷化時間的增加,硅烷單層與AgNPs產(chǎn)生了更強的鍵合,使其更加穩(wěn)定,抑制了更高濃度的負載納米顆粒的釋放,影響其抗菌性。同時隨著硅烷化時間的增加,鈦表面沉積了更多的AgNPs,影響了細胞活性,使細胞密度減小。