明膠@左旋聚乳酸核殼結(jié)構(gòu)納米纖維的制備與性能

成錫婷, 辜鵬程, 胡輝, 董宇涵, 姜強, 范佳, 楊旋, 白燕*

(1.重慶醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，重慶 400016；2.重慶醫(yī)科大學(xué) 實驗教學(xué)中心，重慶 400016)

靜電紡絲技術(shù)是制備納米纖維最有效和最簡單的方法之一，所制備的材料具有比表面積大和尺寸可控性強的特點[1-4]，而同軸靜電紡絲是在靜電紡絲的基礎(chǔ)上發(fā)展而來[5]，實現(xiàn)了納米纖維由實心的單一組分結(jié)構(gòu)向多流體、多層次復(fù)雜結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變，解決了傳統(tǒng)靜電紡絲均一混合體系的局限性，提高了纖維材料的性能[6]。通過靜電紡絲技術(shù)制備的納米纖維膜不僅具有高孔隙率、高比表面積、良好生物相容性和機械力學(xué)性能等特點，而且可以模擬人體各類組織和器官的細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)[7]，具備理想的骨支架的基本特性[8]，另外，同軸靜電紡絲作為藥物遞送系統(tǒng)，可以保護藥物或蛋白質(zhì)的活性[9]，因此被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥、組織工程等領(lǐng)域。

可用于靜電紡絲的高分子材料種類很多，主要分為天然高分子和合成高分子材料。左旋聚乳酸(Poly(L-lactic acid)，PLLA)作為一種合成高分子材料，已被美國食品和藥物管理局(Food and drug admimstration，F(xiàn)DA)批準用于臨床[10]。作為一種具有良好生物相容性和生物降解性的靜電紡絲原料，聚乳酸被廣泛應(yīng)用于組織工程領(lǐng)域[11-15]。而明膠(Gelatin，GEL)來源于膠原，是一種天然生物高分子材料，具有生物相容性好、成本低等優(yōu)點[16]。Xu 等[17]將PLLA 和卵磷脂溶解在二氯甲烷中并充分混合，通過靜電紡絲技術(shù)制造纖維支架，結(jié)果表明，與純 PLLA 相比，通過將卵磷脂引入聚合物中，電紡 PLLA/卵磷脂纖維支架顯示出更好的親水性和生物相容性。Junka 等[18]將來自成骨細胞和內(nèi)皮細胞的細胞衍生脫細胞細胞外基 質(zhì)(Decellularized extracellular matrix，dECM)摻入聚己內(nèi)酯(PCL)溶液中，制備具有成骨和血管線索的靜電紡絲雙層納米纖維支架。Porrelli 等[19]采用靜電紡絲工藝獲得均勻且無缺陷的PCL 纖維膜，并用具有生物活性的乳糖改性殼聚糖(CTL)涂層進行了功能化。Miguez 等[20]通過靜電紡絲技術(shù)制備了明膠和磷酸鈣納米纖維支架，結(jié)果表明，明膠/磷酸鈣支架具有納米纖維結(jié)構(gòu)，且在模擬體液中表現(xiàn)出良好的生物活性。LYU 等[21]將羥基磷灰石(HA)摻入聚乳酸(PLLA)中，采用靜電紡絲的方法制備了排列的納米纖維膜，結(jié)果表明，含有羥基磷灰石的靜電紡絲PLLA-HA 納米纖維膜可以更好地誘導(dǎo)大鼠第4 代骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)的骨形成。目前有諸多文獻報道了用于組織工程領(lǐng)域的支架構(gòu)建方法，大多是采用傳統(tǒng)的共混靜電紡絲法制備，采用同軸靜電紡絲技術(shù)制備核殼結(jié)構(gòu)的納米纖維膜支架少有報道。

因此，本文利用同軸靜電紡絲技術(shù)，制備了以PLLA 為殼層、GEL 為核層的納米纖維膜，通過力學(xué)測試和接觸角測試對其性能進行表征，通過掃描電子顯微鏡(SEM)分析了電紡工藝參數(shù)對其形貌和結(jié)構(gòu)的影響。本工作可為纖維膜進一步應(yīng)用于藥物控釋系統(tǒng)及生物醫(yī)用領(lǐng)域奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 原材料

左旋聚乳酸(相對分子質(zhì)量Mw=270 000，濟南岱罡生物)；明膠(Type A，Bloom 300，Sigma-Aldrich)；二氯甲烷(重慶萬盛川東化工)；三氟乙醇(Trifluoroethanol，TFE)(上海麥克林公司)；細胞增殖/毒性試劑盒(Cell Counting Kit-8，CCK-8)(APEXBIO)。

1.2 靜電紡絲納米纖維膜的制備

1.2.1 靜電紡絲溶液的配制

GEL 溶液的配制：使用分析電子天平(LS220A SCS，上海天美天平儀器有限公司)稱取一定質(zhì)量的明膠，將TFE 和去離子水(Deionized water，DW)按體積比1∶2 進行混合作為溶劑，常溫下攪拌至完全溶解，配制成15%(w/v)的明膠紡絲溶液，備用。

PLLA 溶液的配制：稱取一定質(zhì)量的PLLA，將TFE 和二氯甲烷(Dichloromethane，DCM)按體積比1∶1 進行混合作為溶劑，常溫下攪拌至完全溶解，配制成8%(w/v)的PLLA 紡絲溶液，備用。

1.2.2 納米纖維膜的制備

在同軸靜電紡絲過程中，殼層與核層流體各自的流速、外加電壓等是制備核殼纖維的關(guān)鍵因素。根據(jù)前期研究[22-24]，本實驗在制備GEL@PLLA核殼納米纖維的工作基礎(chǔ)上，采用單因素控制變量法研究工藝參數(shù)對纖維形貌的影響，以紡絲溶液推進速度比、電壓和接收距離作為變量。其具體參數(shù)設(shè)計如表1 所示。

表1 明膠(GEL)@左旋聚乳酸(PLLA)靜電紡絲工藝參數(shù)Table 1 Electrospinning process parameters of gelatin(GEL)@poly(L-lactic acid) (PLLA)

純GEL 纖維膜的制備：將明膠紡絲液注入10 mL 一次性注射器中，選用9#針頭，調(diào)節(jié)流速0.003 mm/s，接收距離15 cm，正電壓17 kV，負電壓0.5 kV，控制溫度在(25±5)℃，濕度在(45±5)%，使用臺式電紡設(shè)備(FM1101，北京富友馬有限公司)完成紡絲。將收集到鋁箔紙上的纖維膜放入25℃真空干燥箱中干燥，備用。

純PLLA 纖維膜的制備：將PLLA 紡絲液注入10 mL 一次性注射器中，選用9#針頭，調(diào)節(jié)流速0.003 mm/s，接收距離15 cm，正電壓17 kV，負電壓0.5 kV，控制溫度在(25±5)℃，濕度在(45±5)%，完成紡絲。將收集到鋁箔紙上的纖維膜放入25℃真空干燥箱中干燥，備用。

GEL@PLLA 核殼纖維膜的制備：將GEL 紡絲液注入內(nèi)層10 mL 的注射器里，PLLA 紡絲液注入外層10 mL 的注射器里，選用同軸紡絲噴頭(內(nèi)針頭為23 G，外針頭為17 G)，噴頭接正電壓，接收板接負電壓。紡絲條件為：正電壓15～17 kV，負電壓0.5 kV，噴頭與接收板之間的距離為10～20 cm，內(nèi)層流速為0.0005 mm/s，外層流速分別為0.0015 mm/s、0.0020 mm/s 和0.0025 mm/s，核 層溶液質(zhì)量濃度為15%，殼層溶液質(zhì)量濃度為8%?？刂茰囟仍?25±5)℃，濕度在(45±5)%，完成紡絲。將收集到鋁箔紙上的纖維膜放入25℃真空干燥箱中干燥，備用。

1.3 納米纖維膜的表征

1.3.1 纖維表面形貌分析

取干燥保存的纖維膜，分別剪成5 mm×5 mm大小，噴金后，在 15 kV 電壓下，用臺式場發(fā)射掃描電鏡(Phenom Pharos G1)觀察纖維膜表面形態(tài)。用圖像處理軟件ImageJ 在SEM 圖像上隨機測量 100 根纖維直徑，統(tǒng)計其平均直徑及直徑分布。

1.3.2 核殼纖維結(jié)構(gòu)分析

將0.01 g 羅丹明B 加入10 mL 紡絲殼溶液中，另外將0.01 g 熒光素鈉加入10 mL 紡絲核溶液中，制備電紡核殼纖維，并使用激光共聚焦顯微鏡(TCS SP8 SR，LEICA)觀察染色結(jié)果。

1.3.3 傅里葉紅外光譜分析

將干燥的纖維膜粉碎，在紅外光譜儀上掃描16 次，分辨率4 cm-1，測定范圍為400～4 000 cm-1，使用Origin 軟件作圖分析。

1.3.4 纖維的力學(xué)性能

用力學(xué)拉伸儀(UniVert，CellScale)測定GEL纖維膜、PLLA 纖維膜和GEL@PLLA 纖維膜的拉伸強度和斷裂伸長率。將3 種膜分別切成30 mm×10 mm 長條，拉伸速度設(shè)為3 mm/min，每個樣品分別平行測試3 個樣條取平均值。

1.3.5 纖維的親水性能

通過接觸角分析儀(Dtaphysics OCA50，德國)分別對GEL 纖維膜、PLLA纖維膜和GEL@PLLA纖維膜進行表面接觸角測量。將10 μL 蒸餾水緩慢滴到纖維膜上，記錄并測量其接觸角值，每組樣品分別測3 次取平均值。

1.4 納米纖維膜的細胞相容性測定

1.4.1 細胞培養(yǎng)

將纖維膜剪裁成正方形片(直徑10 mm)，經(jīng)75%酒精浸潤3 h，然后紫外滅菌6 h 后，置于24孔細胞培養(yǎng)板的孔內(nèi)加入培養(yǎng)基浸泡過夜。取凍存的第4 代骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)復(fù)蘇，待增殖狀態(tài)良好時，將細胞濃度調(diào)整至2.5×104cell/mL，按每孔200 μL 接種于纖維膜上，在5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，中途每隔1～2 天換1 次培養(yǎng)基。培養(yǎng)72 h 后加入2.5%戊二醛固定樣品24 h，磷酸緩沖液沖洗3 遍，每次10 min，梯度酒精(25%、50%、75%、95%、100%)脫水3 遍，每次10 min，叔丁醇脫醇3 遍，每次10 min。取出纖維膜后冷凍干燥24 h，噴金60 s，最后使用SEM 觀察細胞在纖維膜上的黏附情況。

1.4.2 細胞增殖

將纖維膜分別與生長狀態(tài)良好的第4 代小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞共培養(yǎng)，以細胞直接接種在孔板中作為對照組(即Control 組)，不含細胞的孔作為空白對照組(即Blank 組)，共培養(yǎng)1、4、7 天，后向每個纖維膜上滴加200 μL 含有10% CCK-8 的未完全培養(yǎng)基，避光孵育90 min，使用酶標儀(iMark14071，美國Bio-Rad)測定各樣品于450 nm處吸光度(OD)值，計算細胞相對增殖率(RGR)。

2 結(jié)果與分析

2.1 電紡工藝參數(shù)對GEL@PLLA核殼納米纖維膜形貌的影響

2.1.1 紡絲推進流速比的影響

圖1 為紡絲電壓為17 kV、收集距離為15 cm時，不同核層與殼層溶液推進速度下GEL@PLLA納米纖維SEM 圖像和直徑分布圖。可以看出，固定核層溶液推進速度，通過改變殼層溶液推進速度進行同軸靜電紡絲都能獲得了形貌均勻良好的纖維。從纖維直徑分布圖可見，隨著殼層溶液推進速度的增加，GEL@PLLA 納米纖維的平均直徑逐漸增加。崔志香等[25]采用同軸靜電紡絲技術(shù)制備聚己內(nèi)酯(PCL)-聚乳酸(PLA)芯-殼結(jié)構(gòu)復(fù)合纖維時也發(fā)現(xiàn)這一結(jié)果，并解釋為是由于殼層溶液推進速度的增加，使在單位時間內(nèi)電場需要牽伸的溶液量明顯增加，單位體積上溶液射流受到的牽伸力減小，纖維分化能力降低，進而導(dǎo)致纖維直徑增加。此外，從本課題組前期的實驗研究來看[26]，推注速度決定著纖維的直徑大小，在一定范圍內(nèi)，纖維的直徑隨著注射泵推注速度的增大而增大。從本文的掃描電鏡結(jié)果來看，與S3 相比，S2 和S1 纖維直徑分布更加均勻，結(jié)果表明，紡絲推進速度比為1∶3～1∶4 時，靜電紡絲紡出的纖維形態(tài)最優(yōu)。

圖1 不同核殼溶液推進速度比下GEL@PLLA 核殼纖維的SEM 圖像和直徑分布圖：((a1), (a2)) 1 :3；((b1), (b2)) 1 :4；((c1), (c2)) 1 :5Fig.1 SEM images and diameter distribution of GEL@PLLA core-shell fibers under different propulsion velocity ratios of core shell solutions:((a1), (a2)) 1 :3; ((b1), (b2)) 1 :4; ((c1), (c2)) 1 :5

2.1.2 紡絲電壓的影響

電壓作為靜電紡絲過程的驅(qū)動力，在紡絲過程中起著重要的作用。在確定最佳核層與殼層溶液推進速度比的基礎(chǔ)上，探究不同電壓對靜電紡絲纖維膜形貌的影響。圖2 是核層與殼層溶液推進速度比為1∶4，收集距離為15 cm，紡絲電壓分別為19 kV、17 kV 和15 kV 下核殼纖維的SEM圖像和直徑分布圖。從圖2(a1)～2(c1)可以看出，在上述3 種紡絲電壓下都得到了表面形態(tài)良好的復(fù)合纖維，但隨著電壓的增加，復(fù)合纖維平均直徑減小，并產(chǎn)生許多直徑較小的超細纖維，根據(jù)文獻[27]報道，由于隨著紡絲電壓的升高，電場強度增強，導(dǎo)致庫侖力對射流的拉伸效應(yīng)增強，纖維的分化能力提高，從而導(dǎo)致纖維直徑減小。從前期研究者的報道來看，施加的電壓到達一定的界限后會對纖維產(chǎn)生負面作用，過高的電壓會使纖維直徑成倍減少，降低其物理性能[28]。因此，制備靜電紡絲的最佳電壓條件范圍為15～17 kV。

圖2 不同電壓下GEL@PLLA 核殼纖維的SEM 圖像和直徑分布圖：((a1), (a2)) 19 kV；((b1), (b2)) 17 kV；((c1), (c2)) 15 kVFig.2 SEM images and diameter distribution of GEL@PLLA core-shell fibers under different voltages:((a1), (a2)) 19 kV; ((b1), (b2)) 17 kV; ((c1), (c2)) 15 kV

2.1.3 接收距離的影響

圖3 是核殼溶液推進速度比為1∶4，紡絲電壓為17 kV，收集距離分別為10 cm、15 cm 和20 cm條件下所得的復(fù)合纖維SEM 圖像和直徑分布圖?？煽闯?，隨著接收距離的增大，纖維直徑先減小后增大。杜馨禹等[29]研究發(fā)現(xiàn)，隨著收集距離逐漸增大，纖維平均直徑減小，不勻率降低，當收集距離增大到20 cm 時，纖維的平均直徑反而增大到339.5 nm。此結(jié)果與本文一致。這是由于接收距離是10 cm 時，距離太近，使溶劑揮發(fā)不充分，形成了熔合纖維。并且射流在紡絲過程中因拉伸時間較短而不能得到充分拉伸，纖維直徑較粗。增加收集距離到15 cm 時，纖維黏連明顯減少，射流的拉伸程度逐漸加大，纖維直徑逐漸減小。當收集距離增大到20 cm 時，纖維的平均直徑反而增大到302.8 nm，前期研究發(fā)現(xiàn)[30]，收集距離超過臨界值后，隨著收集距離的增加，電場強度減弱，紡絲液射流受到的拉伸作用減弱，纖維直徑變粗。因此，結(jié)果表明當接收距離大于15 cm 時，可以得到形貌較好的纖維。

圖3 不同接收距離下GEL@PLLA 核殼纖維的SEM 圖像和直徑分布：((a1), (a2)) 10 cm；((b1), (b2))15 cm；((c1), (c2)) 20 cmFig.3 SEM images and diameter distribution of GEL@PLLA core-shell fibers under different reception distances:((a1), (a2)) 10 cm; ((b1), (b2)) 15 cm; ((c1), (c2)) 20 cm

2.2 激光共聚焦分析

將羅丹明B 添加到核層溶液中，熒光素鈉添加到殼層溶液中進行同軸電紡，利用激光共聚焦顯微鏡成像原理，對含有熒光物質(zhì)的核殼結(jié)構(gòu)納米纖維膜進行激光共聚焦顯微鏡(LSCM)測試，結(jié)果如圖4 所示。可以看出，熒光素鈉染料聚集在纖維的核中，而羅丹明染料均勻分布在殼中，內(nèi)層纖維成功被外層纖維包裹，由此說明，GEL@PLLA 納米纖維膜形成了良好的核殼結(jié)構(gòu)。

圖5 GEL@PLLA 核殼纖維傅里葉紅外圖譜Fig.5 Fourier transform infrared spectroscopy of GEL@PLLA core-shell fibers

2.3 傅里葉紅外光譜分析

圖5 為GEL@PLLA 核殼纖維傅里葉紅外圖譜?？芍?，PLLA 的分子式為H-[OCH(CH3)CO]n-H。含有O-C、C=O、C-H 這些基團。純PLLA 在1 759 cm-1、1 184 cm-1、1 087 cm-1處有強吸收峰，它們分別為C=O 伸縮振動峰、C-O-C 伸縮振動吸收峰和C-O 反對稱伸縮振動吸收峰，1 454 cm-1是-CH3彎曲振動吸收峰。

純GEL 在3 419 cm-1有明顯的吸收峰，這是屬于明膠中-OH 的特征峰。還有多個明膠中酰胺鍵對應(yīng)的特征吸收峰，其中酰胺Ⅰ帶對應(yīng)峰位位于1 659 cm-1處，而1 543 cm-1、1 454 cm-1附近則分別代表了酰胺Ⅱ帶與酰胺Ⅲ帶的吸收峰。在PLLA 與GEL 通過同軸靜電紡絲后，其主要的峰值出現(xiàn)在1770 cm-1、1 030 cm-1、566 cm-1，表現(xiàn)出PLLA 和GEL 的特征峰，并未發(fā)生較明顯的偏移，說明沒有改變GEL@PLLA 纖維膜原有的官能團及其結(jié)構(gòu)，說明兩種聚合物之間的結(jié)合屬于物理結(jié)合，并沒有發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。

2.4 力學(xué)性能測試

納米纖維膜的力學(xué)性能相關(guān)參數(shù)如圖6 和表2 所示，干燥狀態(tài)下，GEL 纖維膜的抗拉性能最低，在拉伸作用下很快斷裂。PLLA 纖維膜在同樣的拉伸作用條件下表現(xiàn)出更好的力學(xué)性能，拉伸強度為2.28 MPa，斷裂伸長率為9.22%。而GEL@PLLA 核殼纖維膜的拉伸強度相比較純GEL纖維膜有所提高，為1.81 MPa，并且斷裂伸長率是3 組中最大的，為18.29%，說明相較于其他兩種膜，同軸電紡膜具有更好的柔軟性能和彈性。

圖6 GEL@PLLA 納米纖維膜的應(yīng)力-應(yīng)變曲線Fig.6 Stress-strain curves of GEL@PLLA nanofiber membrane

表2 纖維的斷裂伸長率和拉伸強度對比Table 2 Comparison of elongation at break and tensile strength of fibers

2.5 接觸角測試

生物材料表面親疏水性對細胞黏附具有調(diào)控作用，合適的親疏水性對材料表面蛋白的吸附、細胞的黏附及組織響應(yīng)很重要[31]。圖7 中純GEL膜的親水性較好，接觸角為77.3°，純PLLA 膜表現(xiàn)出強的疏水性，接觸角為141.0°，而GEL@PLLA核殼結(jié)構(gòu)納米纖維膜的接觸角為126.7°，介于兩種純的納米纖維膜之間，親水性有所改善，但PLLA 作為殼層材料，核殼纖維膜整體仍然呈現(xiàn)疏水性。分析核殼納米纖維膜接觸角減小的原因可能是存在部分核層的材料明膠沒有被殼層包覆完全，直接暴露在纖維表面。

圖7 納米纖維膜接觸角結(jié)果：(a) GEL 膜；(b) GEL@PLLA 膜；(c) PLLA 膜；(d)納米纖維膜接觸角量化結(jié)果Fig.7 Contact angle results of nanofiber membrane:(a) GEL membrane; (b) GEL@PLLA membrane; (c) PLLA membrane;(d) Quantitative results of contact angle of nanofiber membrane

2.6 纖維膜的細胞相容性

2.6.1 細胞黏附

圖8 是骨髓間充質(zhì)干細胞在GEL@PLLA 核殼納米纖維膜上培養(yǎng)3 天的掃描電鏡結(jié)果。SEM 圖像非常清晰地顯示了細胞在納米纖維膜的形態(tài)。可以看到培養(yǎng)于核殼納米纖維膜的BMSC 形態(tài)細長，樹突明顯。另外，從更高的放大倍數(shù)觀察，可以看到BMSC 胞體基本附著在納米纖維膜表面，但會輕微地嵌入到纖維膜中。

圖8 不同放大倍數(shù)下第4 代骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)在納米纖維膜上的形態(tài)Fig.8 Morphology of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) on nanofiber membrane at different magnifications

2.6.2 細胞增殖

圖9 是3 組納米纖維膜接種骨髓間充質(zhì)干細胞1、4、7 天后的CCK-8 結(jié)果。由圖可見，3 組纖維膜的細胞在7 天內(nèi)，細胞的OD 值都逐漸增加。這一結(jié)果表明，骨髓間充質(zhì)干細胞可以在3種靜電紡絲膜上穩(wěn)定增殖，3 種材料均沒有明顯的細胞毒性。結(jié)合纖維膜上細胞的形態(tài)和CCK-8細胞增殖結(jié)果分析，本文制備的核殼結(jié)構(gòu)GEL@PLLA 納米纖維膜具有良好的生物相容性。

圖9 純GEL 膜、純PLLA 膜和GEL@PLLA 膜的細胞增殖/毒性試劑盒(CCK-8)檢測結(jié)果Fig.9 Cell counting kit-8 (CCK-8) detection results of pure GEL membrane, pure PLLA membrane and GEL@PLLA membrane

3 結(jié) 論

通過同軸靜電紡絲技術(shù)成功制備了明膠(GEL)@左旋聚乳酸(PLLA)核殼納米纖維，探索了同軸靜電紡絲工藝參數(shù)對核殼纖維表面形態(tài)的影響及核殼纖維膜的性能。得出以下結(jié)論：

(1) 隨著殼層溶液推進速度的增加，纖維直徑逐漸增加。隨靜電紡絲電壓的升高，纖維直徑會逐漸減小。而收集距離在一定范圍會使纖維直徑減小，但超過臨界范圍，纖維直徑反而會增大；

(2) 在核層與殼層溶液推進速度比為1∶3～1∶4、外加電壓15～17 kV、接收距離15～20 cm 范圍內(nèi)制備的纖維相貌較好；

(3) 當紡絲電壓為17 kV、推進速度比為1∶4及收集距離為15 cm 條件下，得到的納米纖維膜具有優(yōu)異的力學(xué)性能，細胞在膜上生長良好，有明顯偽足，生物相容性好。表明此方法構(gòu)建的核殼納米纖維膜有望作為一種新型的生物醫(yī)用組織工程支架材料。