飼料不同賴氨酸水平對(duì)紅螯螯蝦幼蝦消化能力及抗氧化功能的影響

袁海延，李闊臣，劉洪健，張瑞雪，張肖肖，周井祥，王秋舉

(1.吉林省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，吉林 長(zhǎng)春 130012；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130118)

賴氨酸廣泛分布于動(dòng)物體內(nèi)，參與多種酶的代謝活動(dòng)，有很強(qiáng)的促生長(zhǎng)作用；參與機(jī)體蛋白質(zhì)合成過程，有一定的免疫調(diào)節(jié)功能。在常見植物蛋白源中，賴氨酸水平相對(duì)較低，這就要求動(dòng)物性蛋白原料添加不足時(shí)必須額外補(bǔ)充一定量的賴氨酸，才能滿足水產(chǎn)動(dòng)物對(duì)其需求。紅螯螯蝦別名澳洲淡水龍蝦、紅螯光殼螯蝦、四脊光殼螯蝦，具有生長(zhǎng)速度快、生長(zhǎng)周期短和適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)，在我國養(yǎng)殖發(fā)展?jié)摿Υ螅壳坝嘘P(guān)賴氨酸對(duì)紅螯螯蝦消化功能和抗氧化功能的研究尚未有所報(bào)道。本試驗(yàn)分析了飼料不同賴氨酸水平對(duì)紅螯螯蝦幼蝦的生長(zhǎng)性能、肝胰腺和腸道消化酶活性、肝胰腺和肌肉抗氧化酶活性的影響，研究紅螯螯蝦幼蝦對(duì)賴氨酸營養(yǎng)的適宜需求及飼料中的科學(xué)配比，為進(jìn)一步探討其優(yōu)質(zhì)飼料配方提供理論性基礎(chǔ)。

一、材料與方法

1.試驗(yàn)飼料

以味精蛋白、菜粕、葵花粕、花生粕為蛋白源，磷脂油為脂肪源，面粉和米糠為糖源，纖維素為填充物，配制蛋白質(zhì)水平約為25%、脂肪水平約為6%的配合飼料(表1)。飼料中賴氨酸鹽(純品賴氨酸水平為78.8%)的添加量(質(zhì)量比，下同)分別為1.3%、1.6%、1.9%、2.2%、2.5%，配制不同賴氨酸水平的5種等氮、等能配合飼料。其中各組飼料賴氨酸的實(shí)測(cè)值分別是1.15%、1.46%、1.75%、2.05%、2.27%，占飼料蛋白質(zhì)的4.60%、5.84%、7.00%、8.2%、9.08%。將試驗(yàn)飼料原料粉碎過60 目篩，按配方稱重，混合均勻，壓制成粒徑為1.5毫米，干燥后放入4℃冰箱備用。

表1 飼料配方及主要營養(yǎng)成分(風(fēng)干基礎(chǔ)) %

2.試驗(yàn)所用主要試劑

消化酶有淀粉酶、胃蛋白酶、脂肪酶，抗氧化酶有超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物為丙二醛(MDA)，測(cè)定用試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

3.試驗(yàn)方法

(1)飼養(yǎng)管理。試驗(yàn)選取初始體重為0.45克的紅螯螯蝦900 尾，隨機(jī)分為A、B、C、D、E 5 組，每組3 個(gè)重復(fù)，分別飼喂賴氨酸水平為1.15%、1.46%、1.75%、2.05%、2.27%的5種等氮、等能飼料。紅螯螯蝦蝦苗來自于吉林公主嶺市藍(lán)谷水產(chǎn)養(yǎng)殖農(nóng)民專業(yè)合作社，飼養(yǎng)試驗(yàn)在吉林公主嶺稻漁科技小院的試驗(yàn)養(yǎng)殖箱進(jìn)行(400 厘米×120 厘米×80 厘米)，飼養(yǎng)開始前預(yù)飼4 周，24 小時(shí)不間斷充氧，水體循環(huán)過濾。水溫在24～29℃，氨氮＜0.3 毫克/升，亞硝酸鹽＜0.05 毫克/升，溶氧5～10 毫克/升，pH 在7.0～7.5。預(yù)飼結(jié)束后，挑選個(gè)體健康、附肢健全且活躍靈敏的紅螯螯蝦幼蝦進(jìn)行養(yǎng)殖。試驗(yàn)時(shí)間為2022 年7 月8 日－9 月2 日，共8 周養(yǎng)殖試驗(yàn)。試驗(yàn)過程中投喂堅(jiān)持“四定”原則，分兩次飼喂(7:00、18:00)，日投飼量為蝦體重的3%～5%，其中早上飼喂量占日投飼量的30%、下午飼喂量占日投飼量的70%。每周換1次水，每次換水1/4～1/3，保證養(yǎng)殖水體水質(zhì)清新，每天記錄養(yǎng)殖箱中蝦的攝食情況，觀察蝦的活動(dòng)狀態(tài)。

(2)樣品收集。試驗(yàn)結(jié)束后停食24小時(shí)，將養(yǎng)殖蝦進(jìn)行稱重，用游標(biāo)卡尺測(cè)量殼長(zhǎng)、殼寬等生長(zhǎng)指標(biāo)。從每組中隨機(jī)選取10 尾紅螯螯蝦幼蝦置于冰盤中。蝦通過冰浴解剖的方式分離肝胰腺及腸道和肌肉組織，用于相關(guān)酶活的測(cè)定。

將試驗(yàn)蝦取出肝胰腺及肌肉樣品分別進(jìn)行稱重(精準(zhǔn)到0.001 克)用于計(jì)算出肉率和肝胰腺指數(shù)。所取組織均按照質(zhì)量體積比1∶9 的比例加入預(yù)冷過的濃度為0.9%的生理鹽水，置于10 毫升無酶離心管中，在冰水浴的條件下通過勻漿器10 秒，并重復(fù)至少3 次，每次間隔10 秒。組織勻漿后，使用4℃離心機(jī)以3 500轉(zhuǎn)/分轉(zhuǎn)速離心10分鐘，取上清液保存于4℃冰箱中用于酶活測(cè)定。

紅螯螯蝦幼蝦消化酶活性的測(cè)定：組織勻漿得到上清液后，分別對(duì)紅螯螯蝦幼蝦肝胰腺、腸道的組織蛋白、胃蛋白酶(比色法)、淀粉酶(淀粉－碘比色法)、脂肪酶(比色法)進(jìn)行活性測(cè)定，其中試劑盒均購于南京建成生物工程研究所，組織蛋白濃度采用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行測(cè)定。

抗氧化能力酶活性的測(cè)定：組織勻漿后得到的上清液分別測(cè)定肝胰腺和肌肉的SOD(羥胺法)、GSH- Px( 分 光 光 度 計(jì) 法)、 CAT( 可 見 光 法)、MDA(TBA法)的酶活力值。

二、結(jié)果與分析

1.飼料不同賴氨酸水平對(duì)紅螯螯蝦幼蝦生長(zhǎng)及飼料利用率的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，紅螯螯蝦幼蝦的終末體重、特定生長(zhǎng)率、增重率在賴氨酸水平為2.05%時(shí)達(dá)到最大值，組間有顯著差異(P＜0.05)；當(dāng)賴氨酸水平為2.27%時(shí)，上述指標(biāo)出現(xiàn)下降。飼料不同賴氨酸水平對(duì)出肉率、肝胰腺指數(shù)、成活率以及飼料系數(shù)的影響差異不顯著(P＞0.05)。

2.飼料不同賴氨酸水平對(duì)紅螯螯蝦幼蝦消化酶活性的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，紅螯螯蝦幼蝦肝胰腺蛋白質(zhì)酶和脂肪酶活性在飼料賴氨酸水平為2.05%時(shí)最高，各組間酶活性有顯著差異(P＜0.05)。隨著賴氨酸水平的不斷提高，紅螯螯蝦幼蝦腸道淀粉酶活性差異不顯著(P＞0.05)；其中E 組的淀粉酶活性高于其他各組，與脂肪酶和蛋白質(zhì)酶先升高、后下降的結(jié)果有所不同。

不同賴氨酸水平對(duì)紅螯螯蝦幼蝦腸道消化酶活性的影響：蛋白質(zhì)酶和脂肪酶活性在賴氨酸水平為2.05%時(shí)達(dá)到最大值，各組間有顯著差異(P＜0.05)。隨著賴氨酸水平的不斷提升，紅螯螯蝦幼蝦腸道淀粉酶活性差異不顯著(P＞0.05)。

3.飼料不同賴氨酸水平對(duì)紅螯螯蝦幼蝦抗氧化酶活性的影響

不同賴氨酸水平對(duì)紅螯螯蝦幼蝦肝胰腺抗氧化酶活性的影響：SOD、CAT 以及GSH-Px 的活性均隨著飼料賴氨酸水平的提高而上升，在賴氨酸水平達(dá)最適濃度后變?yōu)橄陆第厔?shì)，D組酶活性均顯著高于其他各組(P＜0.05)。MDA 含量與飼料賴氨酸水平成負(fù)相關(guān)，C 組MDA 含量低于其他各組，有顯著性差異(P＜0.05)。

不同賴氨酸水平對(duì)紅螯螯蝦幼蝦肌肉抗氧化酶活性的影響：SOD、CAT 的活性均隨著飼料賴氨酸水平的提高而上升，在賴氨酸水平達(dá)到最適水平后改為下降趨勢(shì)，D組酶活性顯著高于其他各組(P＜0.05)。GSH-Px 活性、MDA 含量與飼料賴氨酸水平成負(fù)相關(guān)，差異不顯著(P＞0.05)。

三、討論

1.飼料不同賴氨酸水平對(duì)紅螯螯蝦幼蝦生長(zhǎng)及飼料利用率的影響

在蝦、蟹的生長(zhǎng)與發(fā)育過程中，賴氨酸作為第一限制性氨基酸，發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。許多研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)飼料中賴氨酸不足時(shí)，蝦、蟹對(duì)飼料的利用率會(huì)下降，從而導(dǎo)致生長(zhǎng)發(fā)育緩慢。隨著飼料中賴氨酸水平的升高，蝦、蟹對(duì)飼料的利用率會(huì)逐漸提高，生長(zhǎng)發(fā)育變快。但當(dāng)飼料中賴氨酸水平過高時(shí)，同樣不利于蝦、蟹的生長(zhǎng)發(fā)育，說明賴氨酸對(duì)蝦、蟹的生長(zhǎng)發(fā)育、飼料利用等具有重要影響。邱紅等(2015)通過在黃顙魚幼魚飼料中添加賴氨酸進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明適量的賴氨酸能促進(jìn)其生長(zhǎng)發(fā)育、提高飼料利用率，且最適賴氨酸添加水平為2.61%。張瑩等(2022)的研究表明，飼料中添加適量的賴氨酸能促進(jìn)幼鱖魚的生長(zhǎng)發(fā)育，而賴氨酸缺乏或過多會(huì)使幼鱖魚生長(zhǎng)變慢，飼料利用率下降。在本試驗(yàn)中，當(dāng)紅螯螯蝦飼料中賴氨酸水平為2.05%時(shí)，特定生長(zhǎng)率、增重率達(dá)到最大值，此時(shí)飼料系數(shù)最低，飼料利用率最高；當(dāng)賴氨酸水平超過2.05%時(shí)，特定生長(zhǎng)率、增重率下降，飼料系數(shù)上升，飼料利用率降低。這與上述研究趨勢(shì)相同，表明當(dāng)飼料中賴氨酸缺乏時(shí)，會(huì)使蛋白質(zhì)利用率下降，致使氨基酸平衡被打破，進(jìn)而影響紅螯螯蝦的生長(zhǎng)發(fā)育以及飼料利用率；當(dāng)飼料中賴氨酸過量時(shí)，會(huì)導(dǎo)致氨基酸不平衡，阻礙對(duì)其他氨基酸的吸收利用，進(jìn)而影響紅螯螯蝦幼蝦的生長(zhǎng)發(fā)育和對(duì)飼料的消化與吸收。此外，賴氨酸的缺乏或過量也會(huì)使飼料的適口性下降，影響紅螯螯蝦幼蝦對(duì)飼料的攝食，進(jìn)而攝食量下降，對(duì)飼料的吸收利用率降低，從而導(dǎo)致紅螯螯蝦的生長(zhǎng)發(fā)育緩慢。

2.飼料不同賴氨酸水平對(duì)紅螯螯蝦幼蝦消化功能的影響

為了更好地消化、吸收和利用營養(yǎng)物質(zhì)，蝦、蟹對(duì)于攝食的不同營養(yǎng)物質(zhì)會(huì)分泌不同的消化酶，且各種消化酶的分泌量不同，這體現(xiàn)出蝦、蟹對(duì)飼料組成的明顯適應(yīng)性(潘魯青等，2006)。張微微等(2013)對(duì)于賴氨酸對(duì)克氏原螯蝦消化功能的影響進(jìn)行研究，結(jié)果表明當(dāng)飼料賴氨酸水平為1.22%時(shí)，腸道蛋白質(zhì)酶活性最高；賴氨酸水平高于1.22%時(shí)，酶活性下降。在本試驗(yàn)中，腸道和肝胰腺中脂肪酶、淀粉酶、胃蛋白質(zhì)酶的活性在飼料賴氨酸水平為2.05%時(shí)最高，賴氨酸水平高于2.05%時(shí)，酶活性下降?；谝陨辖Y(jié)果，說明在蝦飼料中添加適量的賴氨酸可以有效提高肝胰腺和腸道中的消化酶活性，從而提高蝦的消化功能。但當(dāng)蝦飼料中賴氨酸過量時(shí)，消化酶活性則會(huì)下降，原因可能是當(dāng)蝦攝入賴氨酸過量時(shí)，導(dǎo)致機(jī)體氨基酸失衡，為了維持體內(nèi)氨基酸平衡，抑制了肝胰腺和腸道中消化酶的活性。

3.飼料不同賴氨酸水平對(duì)紅螯螯蝦幼蝦抗氧化能力的影響

生物在受到外界脅迫時(shí)，可促使機(jī)體細(xì)胞內(nèi)線粒體、胞質(zhì)的酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)反應(yīng)，還原產(chǎn)生活性氧等，若不及時(shí)清除會(huì)造成生物體活性氧損傷(蔣琦辰等，2013)。因此，生物體內(nèi)的超氧化物歧化酶、過氧化氫酶及谷胱甘肽過氧化物酶等通過催化抗氧化劑清除活性氧等，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。其中，SOD 在清除活性氧反應(yīng)過程中首先發(fā)揮作用，將超氧陰離子自由基快速歧化為過氧化氫和分子氧。桂聰?shù)?2022)通過對(duì)低蛋白質(zhì)水平飼料中添加蛋氨酸和賴氨酸進(jìn)行大口黑鱸抗氧化性能的研究，結(jié)果表明在低蛋白質(zhì)水平飼料中添加賴氨酸，能夠有效降低大口黑鱸在機(jī)體脂質(zhì)氧化過程中所受的損傷。在本試驗(yàn)中，當(dāng)飼料賴氨酸水平為1.75%～2.05%時(shí)，SOD、CAT 以及GSH-Px 的活性顯著高于其他各組。此外，肝胰腺中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA 含量以1.75%組為最低，肌肉中MDA 含量以2.05%組為最低。基于以上研究，表明飼料中添加適量的賴氨酸能提高紅螯螯蝦抗氧化能力，減少脂質(zhì)氧化過程對(duì)機(jī)體造成的損傷。這與桂聰?shù)?2022)的研究結(jié)果一致，證實(shí)了賴氨酸在提高機(jī)體抗氧化能力方面有重要作用。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，紅螯螯蝦飼料中賴氨酸水平為1.75%～2.05%時(shí)明顯提高了紅螯螯蝦幼蝦的生長(zhǎng)發(fā)育、飼料利用率，賴氨酸水平為2.05%時(shí)消化功能最佳，賴氨酸水平為1.75%～2.05%時(shí)抗氧化能力明顯提高。綜上，紅螯螯蝦幼蝦飼料中賴氨酸水平宜控制在1.75%～2.05%。