皮膚黑色素瘤中的表達及其與臨床預后的相關性分析

聶剛 亓俊華

摘 要：探討皮膚黑色素瘤（SKCM）中上皮膜蛋白3（EMP3）基因的表達及其與臨床預后的相關性。通過GEPIA數據庫分析EMP3在SKCM組織與正常組織中的表達水平。通過UALCAN、TIMER和GEPIA數據庫分析EMP3表達水平與SKCM患者預后的關系。通過TIMER數據庫分析SKCM中EMP3表達與免疫浸潤細胞水平、免疫浸潤細胞標記物的相關性。結果顯示，EMP3在SKCM組織中的表達水平明顯高于正常組織。EMP3的表達水平與原發(fā)性SKCM患者的總生存率無明顯相關性，但是EMP3高表達與轉移性SKCM患者較低的總生存率顯著相關。B細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、中性粒細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞的免疫浸潤水平與原發(fā)性SKCM患者的預后無明顯相關性，但是B細胞、CD8+T細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞的低免疫浸潤水平與轉移性SKCM患者較低的總生存率顯著相關。轉移性SKCM中EMP3高表達與CD8+T細胞、巨噬細胞和中性粒細胞的低免疫浸潤水平及CD8+T細胞、巨噬細胞大部分標記物的低表達顯著相關。本研究表明，轉移性SKCM中EMP3的表達與免疫細胞浸潤及臨床預后相關，為轉移性SKCM的診治及預后評估提供了一定的理論基礎。

關鍵詞：皮膚黑色素瘤；上皮膜蛋白3；免疫浸潤；臨床預后

中圖分類號：R318? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2023.01.010

The Expression of EMP3 in Skin Cutaneous Melanoma and Its Correlation with Clinical Prognosis

NIE Ganga， QI Junhuab*

（The Seventh Affiliated Hospital， Sun Yat-sen University a. Department of Dermatology; b. Department of Clinical Medical Laboratory， Shenzhen 518107， China）

Abstract： The purpose of this study is to investigate the expression of epithelial membrane protein-3 （EMP3） in skin cutaneous melanoma （SKCM） and its correlation with clinical prognosis. The expression of EMP3 in SKCM and normal tissues was analyzed using GEPIA database. UALCAN database， TIMER database and GEPIA database were used to analyze the relationship between the expression of EMP3 and the prognosis of SKCM patients. The correlations between the expression of EMP3 and immune infiltration cells level and related markers of immune infiltration cells in SKCM were analyzed using TIMER database. The results showed that the expression of EMP3 in SKCM was significantly higher than that in normal tissues. The expression of EMP3 was not related to the overall survival rate of primary SKCM patients， whereas the high expression of EMP3 was significantly related to the lower overall survival rate of metastatic SKCM patients. The infiltration levels of B cells， CD4+T cells， CD8+T cells， neutrophils， macrophages， and dendritic cells were not associated with the prognosis of patients with primary SKCM， whereas the low infiltration levels of B cells， CD8+T cells， neutrophils， and dendritic cells were significantly associated with lower overall survival rate of patients with metastatic SKCM. The high expression of EMP3 in metastatic SKCM was significantly correlated with the lower infiltration levels of CD8+T cells， macrophages and neutrophils， and the lower expression of most markers of CD8+T cells and macrophages. This study suggests that the expression of EMP3 in metastatic SKCM is related to immune infiltration and clinical prognosis， which provides a theoretical basis for the diagnosis， treatment and prognosis evaluation of metastatic SKCM.

Key words： SKCM; EMP3; immune infiltration; clinical prognosis

（Acta Laser Biology Sinica， 2023， 32（1）： 069-075）

皮膚黑色素瘤（skin cutaneous melanoma，SKCM）是一種進展迅速、預后差的惡性腫瘤，已成為世界范圍內主要的公共衛(wèi)生問題之一。SKCM容易發(fā)生遠處轉移，是導致患者預后不良的一個重要因素［1］。據報道，轉移性SKCM的中位生存期小于6個月，5年生存率小于5%［2］。因此，尋找早期預后標記物以實現對SKCM的早期預防和治療對于SKCM患者的預后尤為重要。

上皮膜蛋白3（epithelial membrane protein-3，EMP3）屬于外周髓鞘蛋白22（peripheral myelin protein22，PMP22）家族。人類EMP3基因位于染色體19q13.3上，其編碼的EMP3蛋白是一種163個氨基酸的四跨膜蛋白（～18 kD）［3-5］。EMP3蛋白的主要功能與調節(jié)細胞增殖、分化、激活caspase凋亡通路以及細胞間的相互作用相關［6］。EMP3作為抑癌基因在一些惡性腫瘤的研究中有報道，包括食管癌、膽囊癌、神經母細胞瘤等［7-9］。然而，在乳腺癌和肝細胞癌中EMP3也被證明發(fā)揮致癌基因的作用［6， 10］。EMP3在SKCM中的作用尚未有報道，其對腫瘤免疫微環(huán)境影響的研究也較少。本研究旨在通過多個生物信息學數據庫分析EMP3的表達與SKCM患者預后的關系及其對SKCM免疫微環(huán)境的影響，為SKCM的發(fā)病機制、治療及預后評價提供新思路。

1 材料與方法

1.1 GEPIA數據庫分析

GEPIA（Gene Expression Profiling Interactive Analysis）是一個網絡服務器（http：//gepia.cancer-pku.cn/index.html），包含來自癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）和基因型-組織表達（Genotype-Tissue Expression，GTEx）項目的9 736個腫瘤和8 587個正常樣本的RNA測序表達數據，可用于差異分析、患者生存分析和相關性分析［11］。本研究通過GEPIA數據庫分析EMP3在SKCM組織和正常組織中的表達差異以及EMP3表達水平與SKCM患者累計生存率的相關性。

1.2 UALCAN數據庫分析

UALCAN（The University of ALabama at Birmingham Cancer Data Analysis Portal）數據庫（http：//ualcan.path.uab.edu/）是一個提供基因表達量和生存分析的數據庫，用于癌癥轉錄組數據的分析［12］。本研究利用UALCAN數據庫分析進一步驗證EMP3表達水平與SKCM患者累計生存率的相關性。

1.3 TIMER數據庫分析

TIMER（Tumor Immune Estimation Resource）數據庫（https：//cistrome.shinyapps.io/timer/）是一個專為系統(tǒng)分析不同癌癥類型中免疫細胞浸潤而設計的數據庫。該數據庫包括來自TCGA的32種癌癥類型的10 897個樣本，以評估6種免疫細胞（B細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、中性粒細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞）浸潤的豐度［13］。本研究通過TIMER數據庫首先驗證EMP3表達水平與SKCM患者累計生存率的相關性，然后分析不同免疫細胞浸潤水平與SKCM患者累計生存率的相關性，最后分析SKCM組織中EMP3表達水平與不同免疫細胞浸潤水平及免疫浸潤細胞標記物的相關性。

1.4 統(tǒng)計學方法

所有數據來自各在線數據庫，應用系統(tǒng)默認的統(tǒng)計學方法分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。采用Spermans相關性檢驗進行EMP3表達與免疫浸潤細胞表面標記物之間的相關性分析。

2 結果與分析

2.1 SKCM組織中EMP3的表達分析

通過GEPIA數據庫分析SKCM組織（461個樣本）和正常組織（558個樣本）中EMP3的表達差異（圖1a），結果顯示，EMP3在SKCM組織中的表達水平顯著高于正常組織（P<0.05）。進一步比較不同臨床分期的SKCM患者EMP3的表達水平（圖1b），結果顯示，EMP3表達水平與SKCM患者的臨床分期無明顯相關性（P=0.245）。

2.2 EMP3表達與SKCM患者總生存率的相關性分析

通過GEPIA數據庫分析EMP3的表達水平與SKCM患者總生存率的相關性（圖2a）。結果顯示，EMP3高表達與SKCM患者較低的總生存率顯著相關（P=0.013）。這種相關性在UALCAN數據庫（圖2b）及TIMER數據庫（圖2c）中得到驗證（相應P值分別為0.001、0.020）。進一步將SKCM分為原發(fā)性SKCM和轉移性SKCM兩個亞組，通過TIMER數據庫進行亞組分析（圖2d、2e）。結果顯示，EMP3表達水平與原發(fā)性SKCM患者的總生存率無顯著相關性（P=0.441），但是EMP3高表達與轉移性SKCM患者較低的總生存率顯著相關（P=0.035）。

2.3 SKCM中免疫浸潤細胞水平與患者總體

生存率的相關性分析

通過TIMER數據庫分析SKCM中B細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、中性粒細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞的免疫浸潤水平與患者預后的相關性，結果顯示，B細胞、CD8+T細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞的低免疫浸潤水平與SKCM患者的較低的總生存率顯著相關（P＜0.001）（圖3a）。亞組分析顯示，B細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、中性粒細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞的免疫浸潤水平與原發(fā)性SKCM患者的預后無明顯相關性（相應P值分別為0.905、0.697、0.922、0.435、0.621、0.173）（圖3b），但是B細胞、CD8+T細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞的低免疫浸潤水平與轉移性SKCM患者較低的總生存率顯著相關（相應P值分別為0.001、＜0.001、＜0.001、＜0.001）（圖3c）。

2.4 轉移性SKCM中EMP3與免疫浸潤細胞水平的相關性分析

由于前面的分析結果提示，原發(fā)性SKCM中EMP3表達水平及免疫浸潤細胞水平與患者預后無顯著相關性，因此，接下來只對轉移性SKCM中EMP3與免疫浸潤細胞水平的相關性進行分析（圖4）。結果顯示，轉移性SKCM中EMP3的高表達與CD8+T細胞、巨噬細胞和中性粒細胞的低免疫浸潤水平顯著相關（相應P值分別為6.53e-04，1.63e-03，6.98e-05），與B細胞、CD4+T細胞和樹突狀細胞免疫浸潤水平無明顯相關性（相應P值分別為5.92e-02，8.62e-01，2.88e-01）。此外，進一步分析了EMP3表達水平與CD8+T細胞、巨噬細胞和中性粒細胞表面標記物之間的相關性，并通過腫瘤純度進行了校正（表1）。結果顯示，在轉移性SKCM中EMP3高表達與CD8+T細胞標記物（CD8A、CD8B）、M1型巨噬細胞標記物（PTGS2）及M2型巨噬細胞標記物（CD163、VSIG4、MS4A4A）的低表達顯著相關（相應P值分別為0.013、＜0.001、0.001、＜0.001、0.001、0.017），但是與中性粒細胞標記物（CD66b、CD11b、CCR7）無明顯相關性（相應P值分別為0.062、0.071、0.110）。

3 討論

EMP3作為抑癌基因在多種惡性腫瘤的研究中被報道。有研究表明，EMP3在神經母細胞瘤中通過轉錄抑制發(fā)揮腫瘤抑制的作用，并通過EMP3的過表達和敲除試驗得到了證實［8］。Ma等［7］報道，EMP3通過干擾MAPK/ERK通路抑制膽囊癌的進展，其低表達與膽囊癌預后不良密切相關。Fumoto等［9］報道，過表達EMP3可抑制食管癌細胞系克隆形成，抑制食管癌細胞系增殖，促進食管癌細胞系凋亡，并且低表達EMP3的食管癌患者術后復發(fā)率更高。然而，EMP3在其他幾種惡性腫瘤中也被證明發(fā)揮致癌基因的作用，特別是乳腺癌和肝細胞癌［6， 10， 14］。關于EMP3在SKCM中的作用尚未有報道。本研究首次探討SKCM中EMP3的表達及其與臨床預后和免疫浸潤的相關性。

通過GEPIA數據庫我們發(fā)現，EMP3在SKCM組織中的表達顯著高于正常組織，但是EMP3的表達水平與SKCM患者臨床分期無明顯相關性。此外，UALCAN、TIMER和GEPIA三個數據庫的分析結果一致顯示，EMP3高表達與SKCM患者的較低的總生存率顯著相關。通過TIMER數據庫進一步進行亞組分析，結果顯示，EMP3表達水平與原發(fā)性SKCM患者的總生存率無顯著相關性，但是EMP3高表達與轉移性SKCM患者的較低的總生存率顯著相關。這提示，EMP3在SKCM中可能發(fā)揮致癌基因的作用。EMP3的表達水平對轉移性SKCM患者預后評估具有一定的臨床價值。

腫瘤免疫微環(huán)境在腫瘤發(fā)生、進展中具有重要作用。既往研究表明，免疫浸潤參與了黑色素瘤的進展［15］。本研究探討了B細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、中性粒細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞的免疫浸潤水平與SKCM患者總生存率的相關性。結果顯示，B細胞、CD8+T細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞的低免疫浸潤水平與SKCM患者的較低的總生存率顯著相關。亞組分析顯示，B細胞、 CD4+T細胞、CD8+T細胞、中性粒細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞免疫浸潤水平與原發(fā)性SKCM患者的總生存率無明顯相關性，但是B細胞、CD8+T細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞的低免疫浸潤水平與轉移性SKCM患者較低的總生存率顯著相關。

本研究顯示，轉移性SKCM中EMP3與CD8+T細胞、巨噬細胞和中性粒細胞的免疫浸潤水平顯著相關，并且與CD8+T細胞表面標記物及巨噬細胞大部分標記物的表達顯著相關，但是與中性粒細胞標記物無明顯相關性。這提示，轉移性SKCM中EMP3主要影響CD8+T細胞和巨噬細胞的免疫浸潤水平。CD8+T細胞在腫瘤微環(huán)境或腫瘤周圍組織中均表現出抗黑色素瘤的能力［16］，在清除腫瘤細胞中起著重要作用。CD8+T細胞可以通過釋放顆粒酶和穿孔素攻擊黑色素瘤細胞，從而導致細胞凋亡和新抗原在腫瘤床上的擴散［17-18］。本研究結果顯示，在轉移性SKCM中EMP3的高表達與CD8+T細胞的低免疫浸潤水平顯著相關，并且與CD8+T細胞表面標記物（CD8A、CD8B）的低表達顯著相關。這說明轉移性SKCM中EMP3可能通過下調 CD8+T細胞的免疫浸潤水平導致患者不良的預后。巨噬細胞可極化為多種亞群。經典激活的促炎型巨噬細胞（M1型）和替代激活的抑炎型巨噬細胞（M2型）是巨噬細胞的兩個主要亞群［19］，前者具有增強免疫和抗腫瘤的作用，后者主要發(fā)揮促進腫瘤生長、侵襲和轉移的作用［20-21］。我們發(fā)現，在轉移性SKCM中，EMP3表達水平與巨噬細胞的免疫浸潤水平顯著負相關。進一步探索EMP3表達與腫瘤純度調整后的免疫浸潤細胞基因標記物的相關性分析發(fā)現，EMP3表達與M1型巨噬細胞標記物（PTGS2）及M2型巨噬細胞標記物（CD163、VSIG4、MS4A4A）呈負相關。這說明在轉移性SKCM中EMP3可能分別通過下調M1型巨噬細胞和M2型巨噬細胞的免疫浸潤水平發(fā)揮抑癌和致癌的雙重作用。

綜上所述，本研究初步表明轉移性SKCM中EMP3的高表達與患者不良的臨床預后相關，可能與其降低SKCM免疫微環(huán)境中免疫浸潤細胞水平相關，特別是CD8+T細胞的免疫浸潤水平。值得注意的是，本研究基于公共數據庫進行挖掘，存在一定的局限性，如樣本量較小、未在基因表達的蛋白水平進行驗證等。因此，本研究結果仍有待于進一步的研究證實。

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收稿日期：2022-10-24; 修回日期：2022-11-28。

作者簡介：聶剛，主治醫(yī)師，主要從事皮膚腫瘤的基礎與臨床研究。

* 通信作者：亓俊華，主管技師，主要從事皮膚腫瘤的基礎與臨床研究。E-mail： qijh3@mail.sysu.edu.cn。