小麥脫鎂葉綠酸加氧酶基因家族鑒定及其響應(yīng)衰老特征分析

閆榮岳 郝輝芳 晉秀娟 郭峰 許成杰 湯小莎 王曙光 范華 孫黛珍

摘 要：脫鎂葉綠酸a加氧酶（PaO）基因編碼葉綠素降解過(guò)程中的關(guān)鍵酶。為了解小麥（Triticum aestivum L.）TaPaOs基因家族特征及其在衰老過(guò)程中發(fā)揮的作用，本試驗(yàn)利用已發(fā)布的小麥及其他物種的全基因組信息對(duì)TaPaOs家族成員的基因特性進(jìn)行分析，并利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-RCR）技術(shù)初步分析其功能。結(jié)果表明：在小麥中共發(fā)現(xiàn)18個(gè)TaPaOs家族成員，分布在15條染色體上，其編碼蛋白均具有親水性，且大多數(shù)為不穩(wěn)定蛋白，亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)均位于葉綠體中；18個(gè)TaPaOs家族成員啟動(dòng)子區(qū)包含大量響應(yīng)元件，其中光響應(yīng)元件（G-Box）和ABA響應(yīng)元件（ABRE）最多。分析TaPaOs在不同組織中的表達(dá)模式發(fā)現(xiàn)，其家族成員表達(dá)模式為葉>莖>根，大多數(shù)家族成員在ABA誘導(dǎo)衰老、黑暗誘導(dǎo)衰老以及自然衰老時(shí)上調(diào)表達(dá)，尤其是TaPaO2、TaPaO5及TaPaO6，可作為小麥衰老研究的重點(diǎn)關(guān)注基因。這些研究結(jié)果為進(jìn)一步研究TaPaOs基因家族的功能奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：小麥；TaPaOs基因家族；葉綠素；表達(dá)模式分析；衰老

中圖分類(lèi)號(hào)：S512.1；Q78? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2023.01.007

Familial Identification of Wheat Pheophorbide a Oxygenase Gene and Its Characteristic Analysis in Response to Aging

YAN Rongyue， HAO Huifang， JIN Xiujuan， GUO Feng， XU Chengjie， TANG Xiaosha， WANG Shuguang， FAN Hua*， SUN Daizhen*

（College of Agriculture， Shanxi Agricultural University， Taigu 030801， China）

Abstract： Pheophorbide being a oxygenase gene （PaO） encoded a key enzyme in the process of chlorophyll degradation. In this study， in order to understand the characteristics of the TaPaOs gene family in wheat （Triticum aestivum L.） and the role it plays in the aging process， the published genome-wide information of wheat and other species was used to analyze the genetic features of the TaPaOs family， preliminarily identified their functions by real-time fluorescence quantitative （qRT-PCR） technology. The results showed that a total of 18 TaPaOs family members were found in wheat， distributed on 15 chromosomes. The encoded proteins were hydrophilic， most of which were unstable proteins， and their subcellular localization was predicted in chloroplasts. The promoter regions of the 18 family members contained a large number of response elements， among which the light response element （G-Box） and ABA response element （ABRE） were the most. The expression patterns of the TaPaOs gene family in different tissues were analyzed and found that leaves were the most， followed by stems and lowest roots. Most of the family members upregulated expression during ABA-induced aging， dark induced aging， and natural aging， especially TaPaO2， TaPaO5， and TaPaO6 would be used as the focus of wheat aging research， which laid the foundation for further study of the TaPaoOs gene family function in wheat.

Key words： wheat; TaPaOs gene family; chlorophyll; expression analysis; aging

（Acta Laser Biology Sinica， 2023， 32（1）： 043-054）

小麥（Triticum aestivum L.）是當(dāng)前我國(guó)人民的主要糧食作物之一，能夠提供人體所需要的多種養(yǎng)分，小麥的生產(chǎn)發(fā)展與我國(guó)糧食安全和社會(huì)穩(wěn)定有著直接關(guān)系［1］。衰老是在細(xì)胞、組織、器官或生物體水平上的一種年齡依賴(lài)性退化過(guò)程，伴隨著光合產(chǎn)物從葉片和莖稈向種子的遷移和積累，因此，衰老延緩將有利于提高光合速率、延長(zhǎng)光合作用的時(shí)間，增加種子中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的積累，對(duì)提高作物產(chǎn)量具有重要作用［2-4］。

葉綠素（chlorophyll，Chl）是地球上最豐富的色素，是植物進(jìn)行光合作用必需的物質(zhì)基礎(chǔ)［5］。葉綠素的降解與衰老息息相關(guān)，隨著葉綠素降解的加快，植物衰老也加快，反之亦然。研究表明，高等植物的葉綠素降解有兩條途徑：一是葉綠素a（chlorophyll a，Chl a）在葉綠素酶（chlorophyllase，CLH）作用下脫植基形成脫植基葉綠素a（chlorophyllide a，Chlide a），然后脫鎂形成脫鎂葉綠酸a（pheophorbide，Pheide a）［6］；二是Chl a在脫鎂螯合酶作用下形成脫鎂葉綠素a（pheophytin a，Phein a），再在脫鎂葉綠素酶（pheophytinase，PPH）作用下經(jīng)脫植基形成Pheide a。隨后，脫鎂葉綠酸a加氧酶（pheophorbide a oxygenase，PaO）特異性切割Pheide a的卟啉環(huán)，氧化產(chǎn)生紅色葉綠素分解產(chǎn)物［7］。其中PaO是葉綠素降解途徑中的關(guān)鍵酶，是一種非血紅素鐵型單加氧酶，具有一個(gè)保守的Rieske鐵硫中心、單核鐵結(jié)合位點(diǎn)以及PaO結(jié)構(gòu)域（cd03480）［8-9］。1997年，PaO基因首先在玉米（Zea mays L.）中被鑒定為致死葉斑點(diǎn)（lethal leaf spot 1，Lls1）基因［10］；在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中PaO被稱(chēng)為加快細(xì)胞死亡（accelerated cell death 1，ACD1）基因［11］。前人研究表明，PaO的表達(dá)是由植物的自然衰老和環(huán)境脅迫誘導(dǎo)的：在西蘭花（Brassica oleracea L.）采后衰老過(guò)程中發(fā)現(xiàn)BoPaO表達(dá)顯著增加，并與葉綠素降解相關(guān)［12］；在油菜（Brassica napus L.）衰老過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)PaO蛋白活性降低，會(huì)延遲葉綠素的降解［13］；外源噴施脫落酸（abscisic acid，ABA）誘導(dǎo)衰老可以增強(qiáng)水稻（Oryza sativa L.）葉片中PaO的表達(dá)［14］；ABA處理可以使大麥（Hordeum vulgare L.）葉片中的葉綠素迅速喪失，PaO活性增加［15］；在黑暗誘導(dǎo)衰老期間，水稻OsPaO沉默后，延遲葉綠素降解［16］，而擬南芥中AtPaO過(guò)表達(dá)的葉片在黑暗處理4 d后降低了葉片中葉綠素的含量［17］。以上研究均表明，PaO相關(guān)基因可能通過(guò)葉綠素降解途徑參與葉片衰老的過(guò)程。

目前，小麥TaPaO已經(jīng)被克?。?］，但TaPaOs家族成員的基因特性分析及功能未見(jiàn)報(bào)道。鑒于此，本研究利用生物信息學(xué)的手段確定TaPaOs家族成員，并分析其染色體（chromosome，chr）位置、蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位、基因結(jié)構(gòu)、保守基序和順式作用元件等，預(yù)測(cè)并驗(yàn)證其在不同組織中及不同衰老階段的表達(dá)情況，為后續(xù)進(jìn)一步研究TaPaOs家族成員的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理

小麥品種Fielder作為供試材料，分別進(jìn)行室內(nèi)水培以及大田試驗(yàn)。

室內(nèi)水培：挑選無(wú)病蟲(chóng)害且顆粒飽滿(mǎn)的種子，用10%次氯酸鈉消毒10 min，然后用蒸餾水沖洗5次后進(jìn)行種子吸脹處理，放入人工氣候培養(yǎng)箱（光照10 000 lx 14 h/黑暗0 lx 10 h，溫度25℃/15℃，濕度60%）中過(guò)夜培養(yǎng)，之后挑選露白的種子放入育苗盤(pán)中培養(yǎng)，培養(yǎng)3 d后轉(zhuǎn)入黑色水培盒中培養(yǎng)，待長(zhǎng)至兩葉一心期，取9株幼苗的根、莖、葉做TaPaOs家族成員在不同組織中的表達(dá)分析，剩余幼苗分兩組進(jìn)行不同處理，其中一組進(jìn)行50 ?mol/L的ABA處理，并于處理后0、1、3、6、12、24、48、72 h取幼苗葉片；另一組進(jìn)行黑暗處理，并于處理后0、0.5（12 h）、1、3、5、7 d取幼苗葉片。兩個(gè)處理均設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)各3株，儲(chǔ)存于–80℃?zhèn)溆?，用于ABA誘導(dǎo)衰老以及黑暗誘導(dǎo)衰老時(shí)TaPaOs家族成員的表達(dá)分析。

大田試驗(yàn)：于2022年3月11日，將小麥種植于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院農(nóng)作站小麥試驗(yàn)田（37.42°N，112.58°E）中，點(diǎn)播，行長(zhǎng)2 m，行距10 cm，并于花后7、10、13、16、19、22、25、28 d每個(gè)時(shí)期均取3片主莖旗葉，用于自然衰老條件下TaPaOs家族成員的表達(dá)分析。

1.2 基因組序列的獲取

從Ensembl Plants［18］（http：//plants.ensembl.org/info/data/ftp/index.html）數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取中國(guó)春小麥、烏拉爾圖小麥（Triticum urartu Thumanjan ex Gandilyan）、節(jié)節(jié)麥（Aegilops tauschii Coss.）、水稻、玉米及擬南芥的基因組數(shù)據(jù)、總蛋白序列、CDS序列以及GFF3文件。

1.3 TaPaOs基因家族成員鑒定

從Pfam［19］（http：//pfam-legacy.xfam.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)中下載PaO結(jié)構(gòu)域（PF08417）和Rieske 2Fe-2S（PF00355）結(jié)構(gòu)域的HMM模型，通過(guò)TBtools中的Simple HMM Search，篩選小麥總蛋白序列中含Rieske_RO_Alpha_PaO（cd03480）結(jié)構(gòu)域的基因；從NCBI（https： //www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)中下載玉米和擬南芥PaO的蛋白序列，利用小麥多組學(xué)數(shù)據(jù)平臺(tái)WheatOmics的Blastp［20］（http：//wheatomics.sdau.edu.cn/blast/blast.html）工具篩選TaPaOs家族的候選基因。然后，將上述兩種方法獲取的家族成員取交集，進(jìn)而確定為T(mén)aPaOs家族成員，最后，利用NCBI中保守域數(shù)據(jù)庫(kù)［21］ （https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）檢查是否含有Rieske_RO_Alpha_PaO結(jié)構(gòu)域，剔除冗余基因，最終獲得小麥TaPaOs家族成員。使用TBtools［22］中的Fasta Extract（Recommended）提取TaPaOs家族成員氨基酸（amino acid，aa）序列，使用同樣的方法篩選烏拉爾圖小麥、節(jié)節(jié)麥、玉米、水稻和擬南芥的PaO家族成員。

1.4 染色體定位圖繪制

通過(guò)小麥基因組GFF注釋文件，獲得TaPaOs家族基因的位置信息，并使用TBtools繪制TaPaOs家族成員的染色體定位圖。

1.5 TaPaOs家族蛋白的理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及亞細(xì)胞定位

通過(guò)Expasy［23］（https：//web.expasy.org/protparam/）在線(xiàn)軟件獲得TaPaOs蛋白的氨基酸數(shù)、相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、不穩(wěn)定指數(shù)、脂肪指數(shù)、親水性（grand average of hydropathicity，GRAVY）；使用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）在線(xiàn)網(wǎng)站預(yù)測(cè)TaPaOs蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)；通過(guò)PlantmPLoc［24］ （http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/cgi-bin/PlantmPLoc.cgi）在線(xiàn)軟件對(duì)TaPaOs蛋白序列進(jìn)行亞細(xì)胞定位。

1.6 TaPaOs的系統(tǒng)進(jìn)化分析

通過(guò)MEGA 7.0［25］將篩選到的TaPaOs蛋白序列與節(jié)節(jié)麥、烏拉爾圖小麥、水稻、玉米及擬南芥的PaO家族蛋白序列進(jìn)行多重序列比較，并采用鄰接法（neighbor joining，NJ），設(shè)置Bootstrap重復(fù)數(shù)為1 000，構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，分析小麥與麥類(lèi)作物烏拉爾圖小麥、節(jié)節(jié)麥；禾本科作物的玉米、水稻以及擬南芥之間的同源進(jìn)化關(guān)系，使用iTOL［26］（https：//itol. embl. de/login. cgi）在線(xiàn)工具美化進(jìn)化樹(shù)。將進(jìn)化樹(shù)上位于小麥A、B、D亞基因組上并聚集在同一進(jìn)化分支末端的基因定義為種內(nèi)同源等位基因；節(jié)節(jié)麥、烏拉爾圖小麥、玉米、水稻以及擬南芥的PaO基因與小麥基因在同一分支上聚合，定義為種間直系同源基因?qū)Γ?7］。

1.7 TaPaOs的基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析

使用TBtools分析TaPaOs的基因結(jié)構(gòu)，通過(guò)MEME［28］（https：//meme-suite. org/）在線(xiàn)軟件分析保守基序（motifs），并使用TBtools對(duì)結(jié)果可視化作圖。

1.8 TaPaOs的順式作用元件分析

使用TBtools軟件從小麥基因組文件中提取TaPaOs起始密碼子ATG上游2 000 bp序列，通過(guò)PlantCARE［29］（https：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtool s/plantcare/html/）在線(xiàn)軟件分析家族成員的順式作用元件，并利用TBtools繪圖。

1.9 TaPaOs的表達(dá)分析

在WheatOmics中下載并整理TaPaOs在不同組織中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，包括根、莖、葉［30］，以及在小麥抽穗期、花后0、15、25、30 d［31］的表達(dá)情況，使用TBtools軟件繪制表達(dá)熱圖。

用Trizol法（Takara）提取不同處理下的小麥葉片RNA，并用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara）合成cDNA，使用WheatOmics的PrimerServer（http：//wheatomics.sdau.edu.cn/PrimerServer/）在線(xiàn)軟件設(shè)計(jì)小麥擴(kuò)增引物（表1），采用qRT-PCR法分析其表達(dá)量。用2-ΔΔCt法計(jì)算各個(gè)基因在不同處理的不同時(shí)期下的相對(duì)表達(dá)量，以Actin為內(nèi)參，設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 TaPaOs家族成員鑒定、蛋白質(zhì)理化性質(zhì)及其二級(jí)結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)及進(jìn)化分析

在小麥基因組中共找到18個(gè)TaPaOs，根據(jù)其在染色體上的位置以及進(jìn)化樹(shù)分類(lèi)，將其分別命名為T(mén)aPaO1-A～TaPaO6-D，分布在小麥的3A、3B、3D、4A、4B、4D、5A、5B、5D、6A、6B、6D、7A、7B、7D染色體上（圖1）；根據(jù)TaPaOs家族成員在4個(gè)亞家族的位置及其在ABD亞基因組中的同源關(guān)系將其分為（TaPaO1～TaPaO6）（表2、圖2）；其家族成員大多有3個(gè)拷貝，TaPaO3有2個(gè)拷貝，TaPaO6有4個(gè)拷貝。

TaPaOs編碼的氨基酸數(shù)介于470（TaPaO2-D）～571 aa（TaPaO6-A）之間，其平均值為527.94 aa；相對(duì)分子質(zhì)量為52 866.92（TaPaO2-D）～63 745.33 Da（TaPaO6-A），平均值為59 085.01 Da；等電點(diǎn)（isoelectric point，pI）在6.70（TaPaO3-A）～9.53（TaPaO6-B-1）之間，平均值為8.28，除TaPaO1-B、TaPaO2-D、TaPaO3-A的pI值低于7.00外，其余15個(gè)蛋白的pI值均高于7.00，為堿性蛋白質(zhì)；不穩(wěn)定系數(shù)值在36.96（TaPaO1-D）～59.47（TaPaO4-A），平均值為48.77，說(shuō)明TaPaOs家族蛋白大部分為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)，但TaPaOs中TaPaO1-A、TaPaO1-B、TaPaO1-D、TaPaO2-D不穩(wěn)定指數(shù)均低于40，為穩(wěn)定蛋白質(zhì)；脂肪族指數(shù)分布在72.00（TaPaO2-D）～83.82（TaPaO1-A），其平均值為79.32；親水性分布在-0.368（TaPaO2-D）～-0.184（TaPaO6-B-2），其平均值為-0.263，均為親水性蛋白質(zhì)（表2）。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TaPaOs家族蛋白均包含α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲4種二級(jí)結(jié)構(gòu)，其中無(wú)規(guī)則卷曲含量均最高，α-螺旋次之，β-轉(zhuǎn)角最少（表2）。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，所有TaPaOs均定位于葉綠體（chloroplast）（表2）。

為了更加清晰直觀(guān)地預(yù)測(cè)TaPaOs家族成員的分化情況以及其與節(jié)節(jié)麥、烏拉爾圖小麥、水稻、玉米及擬南芥之間的同源關(guān)系，通過(guò)MEGA 7.0將41個(gè)PaO蛋白序列采用NJ構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)（圖2），結(jié)果表明：18個(gè)小麥TaPaOs與5個(gè)節(jié)節(jié)麥、3個(gè)烏拉爾圖小麥、6個(gè)水稻、5個(gè)玉米及4個(gè)擬南芥PaO可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ共4個(gè)亞家族；其中，亞家族Ⅰ成員最多，含小麥TaPaO3（-A、-D）、TaPaO4（-A、-B、-D）、TaPaO6（-A、-B-1、-B-2、-D）；亞家族Ⅱ中包括TaPaO2（-A、-B、-D）；亞家族Ⅲ中包括TaPaO1（-A、-B、-D）；亞家族Ⅳ中包括TaPaO5（-A、 -B、-D）。每個(gè)亞家族中均含有節(jié)節(jié)麥、烏拉爾圖小麥、水稻、玉米及擬南芥的PaO家族蛋白，小麥PaO蛋白與麥類(lèi)作物節(jié)節(jié)麥、烏拉爾圖小麥親緣關(guān)系最近，其次是禾本科作物玉米和水稻，與擬南芥親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

2.2 TaPaOs的保守基序分析及基因結(jié)構(gòu)分析

通過(guò)MEME數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)TaPaOs的20個(gè)保守基序motif 1～motif 20（簡(jiǎn)稱(chēng)M1～M20）分析（圖3）發(fā)現(xiàn)，M1、M2、M3、M5、M6、M10、M13、M15、M19為家族成員的共有motifs，除此之外，亞家族Ⅰ還均含有M7、M8、M9、M11、M20，亞家族Ⅱ還均含有M4、M7、M8、M9、M17、M20，亞家族Ⅲ還均含有M4、M12、M14、M17、M18，亞家族Ⅳ均含有M4、M14、M17。亞家族Ⅱ和亞家族Ⅲ成員間所有motifs種類(lèi)及分布均相同，亞家族Ⅳ成員間所有motifs種類(lèi)相同。

對(duì)TaPaOs的基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)（圖3），TaPaOs家族中含有3～9個(gè)外顯子結(jié)構(gòu)，亞家族Ⅰ的外顯子在5～7個(gè)之間，亞家族Ⅱ均有7個(gè)外顯子，亞家族Ⅲ均有9個(gè)外顯子，亞家族Ⅳ均有3個(gè)外顯子。亞家族Ⅰ中除TaPaO3-D、TaPaO4-B、TaPaO4-D、TaPaO6-B-1不含非編碼區(qū)（untranslated regions，UTR）外，其余成員均具有完整的UTR；亞家族Ⅱ、亞家族Ⅲ、亞家族Ⅳ的所有成員均具有完整的UTR。亞家族Ⅱ、亞家族Ⅲ、亞家族Ⅳ成員基因結(jié)構(gòu)相對(duì)保守，進(jìn)一步說(shuō)明該家族在進(jìn)化上具有保守性。

2.3 TaPaOs的順式作用元件分析

通過(guò)在線(xiàn)軟件（PlantCARE）分析TaPaOs起始密碼子上游2 000 bp序列，進(jìn)而推測(cè)影響基因表達(dá)的可能因素及基因可能參與的調(diào)控途徑。結(jié)果表明（圖4），在TaPaOs起始密碼子上游2 000 bp共發(fā)現(xiàn)50種響應(yīng)元件，包括19種光響應(yīng)元件、10種激素響應(yīng)元件、6種逆境脅迫以及15種與生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)的其他響應(yīng)元件。除生長(zhǎng)發(fā)育所必需的核心啟動(dòng)元件TATA-box和CAAT-box外，光響應(yīng)元件最多，可能是由于葉綠素是光合作用中捕獲光的主要成分。光響應(yīng)元件中G-box響應(yīng)元件共105個(gè)，占47.51%，除TaPaO2-B外其他成員均有該響應(yīng)元件，還有AAAC-motif、ACA-motif、ACE、ATCT-motif、AE-box、Box 4、Box II、CAG-motif、chs-Unit 1 m1、GA-motif、GATA-motif、G-box、GT1-motif、GTGGC-motif、I-box、MRE、Sp1、TCCC-motif、TCT-motif等光響應(yīng)元件。254個(gè)激素響應(yīng)元件中包括39.76%的ABRE（脫落酸響應(yīng)元件）、24.02%的TGACG-motif（茉莉酸甲酯響應(yīng)元件）和24.02%的CGTCA-motif（茉莉酸甲酯響應(yīng)元件），除TaPaO2-D外均包含ABRE，所有成員均含有TGACG-motif和CGTCA-motif，除此之外，還有生長(zhǎng)素（TGA-element、AuxRE和AuxRR-core）、赤霉素（GARE-motif、TATC-box和P-box）、水楊酸TCA-element等響應(yīng)元件。78個(gè)脅迫響應(yīng)元件涉及厭氧誘導(dǎo)、缺氧特異性誘導(dǎo)、低溫、干旱、防御和壓力以及傷口響應(yīng)元件（ARE、GC-motif、LTR、MBS、TC-rich repeats、WUN-motif）等。以上結(jié)果表明，TaPaOs在參與光響應(yīng)、激素響應(yīng)及各類(lèi)非生物脅迫途徑中發(fā)揮著重要作用。

2.4 TaPaOs的時(shí)空表達(dá)模式分析

在WheatOmics中下載并整理分析TaPaOs的時(shí)空表達(dá)模式。結(jié)果表明（圖5），TaPaO3（-A、-D）、TaPaO5-D和TaPaO6-B-2在莖中表達(dá)量最高，TaPaO6-B-1在莖葉中幾乎不表達(dá)，其余13個(gè)家族成員在葉中表達(dá)最高，TaPaOs在根中均表達(dá)量最低。TaPaO3（-A、-D）、TaPaO6-B-1在小麥抽穗期以及花后0、15、25、30 d各個(gè)時(shí)期表達(dá)量都很低，TaPaO1（-A、-B、-D）在抽穗期以及花后0、5、15、25 d的表達(dá)量較高，在花后30 d表達(dá)量較低，TaPaO2（-A、-B、-D）、TaPaO5（-A、-B、-D）、TaPaO6（-A、-B-1、-D）在花后25、30 d的表達(dá)最高，是在抽穗期以及花后0、5、15 d的表達(dá)量的二倍以上，TaPaO3（-A、-D）、TaPaO6-B-1在各時(shí)期幾乎不表達(dá)，TaPaO4（-A、-B、-D）在各時(shí)期均有表達(dá)。

2.5 不同組織及脅迫處理下TaPaOs的表達(dá)特性

根據(jù)TaPaOs序列設(shè)計(jì)qRT-PCR引物（表1），分析TaPaOs（TaPaO1～TaPaO6）分別在幼苗根、莖、葉中的相對(duì)表達(dá)量（圖6），結(jié)果表明，TaPaOs在根中幾乎都不表達(dá)，表達(dá)模式可總結(jié)為：葉>莖>根，總體上與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)果一致。

為了分析TaPaOs在衰老過(guò)程中的表達(dá)模式，利用qRT-PCR分析TaPaOs（TaPaO1～TaPaO6）分別在ABA誘導(dǎo)衰老、黑暗誘導(dǎo)衰老以及自然衰老過(guò)程中的相對(duì)表達(dá)量（圖7），結(jié)果表明，在三種處理下，TaPaOs表現(xiàn)出不同的衰老表達(dá)模式。在ABA誘導(dǎo)衰老過(guò)程中的表達(dá)模式略有差異，TaPaO1在處理24 h表達(dá)量最高，TaPaO3、TaPaO6在處理6 h表達(dá)量最高，TaPaO2、TaPaO5在處理48 h表達(dá)量最高，TaPaO4在處理后幾乎不表達(dá)；在黑暗誘導(dǎo)衰老過(guò)程中，TaPaOs整體呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，可能由于在后期小麥適應(yīng)了黑暗處理，導(dǎo)致表達(dá)降低，其中，TaPaO1、TaPaO3在黑暗處理12 h時(shí)表達(dá)量最高，TaPaO2、TaPaO4、TaPaO5、TaPaO6在黑暗處理3 d時(shí)表達(dá)量最高；在自然衰老時(shí)，各成員表達(dá)不一致，TaPaO1在花后16 d時(shí)，表達(dá)量達(dá)最高，TaPaO2、TaPaO5、TaPaO6在后期表達(dá)量較高，在花后22 d時(shí)表達(dá)最高，TaPaO3、TaPaO4在整個(gè)時(shí)期中均處于低水平的表達(dá)。

3 討論

PaO是葉綠素分解代謝途徑中的關(guān)鍵酶，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中具有重要作用。六倍體小麥在進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生了兩次多倍體化現(xiàn)象［32］，引起基因組中大規(guī)模基因的丟失和大量重復(fù)基因的產(chǎn)生［33］。本研究利用生物信息學(xué)方法在小麥全基因組中發(fā)現(xiàn)18個(gè)TaPaOs，分別分布于小麥的15條染色體上，其中發(fā)現(xiàn)TaPaO3缺少B基因組的同源基因，TaPaO6的B染色體有2個(gè)同源基因（TaPaO6-B-1和TaPaO6-B-2），推測(cè)其在小麥進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生了基因丟失和復(fù)制事件。前人研究表明，擬南芥［17］和黃瓜（Cucumis sativus L.）［34］PaO蛋白均定位于葉綠體中，與本研究亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果一致，葉綠體中的類(lèi)囊體膜是植物進(jìn)行光合作用光化學(xué)反應(yīng)的場(chǎng)所［35］，所以，TaPaOs可能與小麥葉片的光合作用有關(guān)。通過(guò)保守基序和基因結(jié)構(gòu)分析基因家族具有重要意義［36］，研究分析發(fā)現(xiàn)，TaPaOs家族基因分為4個(gè)亞家族，同一亞家族的外顯子數(shù)量基本相同，保守基序相同或相似，說(shuō)明TaPaOs在進(jìn)化上保守，可能具有類(lèi)似的功能。

PaO在不同植物中具有明顯的組織特異性，其在花、種子及葉片發(fā)育中具有重要作用。例如：擬南芥AtPaO在花和角果中的表達(dá)高于其他組織［11］；油菜BnPaO2在整個(gè)種子發(fā)育過(guò)程中均表達(dá)，BnPaO1在種子發(fā)育早期表達(dá)［13］；水稻OsPaO在葉片中表達(dá)水平最高［16］；辣椒（Capsicum annuum L.）CaPaO［37］在所有組織中均有表達(dá)，葉片中的表達(dá)水平高于其他組織。本研究采用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)合qRT-PCR方法，同樣發(fā)現(xiàn)TaPaOs家族成員主要在葉中表達(dá)，在根中表達(dá)量較低。不同物種間組織的差異表達(dá)表明物種在進(jìn)化過(guò)程中功能發(fā)生分化。

基因啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件決定了該基因的誘導(dǎo)表達(dá)模式［38］。本研究通過(guò)對(duì)TaPaOs起始密碼子上游2 000 bp的順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)：除核心啟動(dòng)元件外，ABA響應(yīng)元件（ABRE）以及光響應(yīng)元件（G-Box）含量最高，說(shuō)明TaPaOs可能受這些元件的調(diào)控。有研究表明，外源噴施ABA及黑暗誘導(dǎo)會(huì)引起PaO表達(dá)，PaO表達(dá)的增加與葉綠素降解有關(guān)［39］，即PaO可能在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控衰老。例如：外源施加ABA誘導(dǎo)衰老增加了擬南芥AtPaO［40］、水稻OsPaO［16］及辣椒CaPaO［37］的表達(dá)；在黑暗誘導(dǎo)的衰老和自然衰老過(guò)程中，水稻OsPaO［11］以及大豆［Glycine max （Linn.） Merr.］GmLlsl［41］隨著衰老表達(dá)上調(diào)；在西蘭花采后衰老過(guò)程中BoPaO的表達(dá)增加［12］；在擬南芥整個(gè)生育期AtPaO表達(dá)逐漸升高，并在8周即自然衰老時(shí)達(dá)到最高峰［11］。本研究通過(guò)qRT-PCR分析也表明，TaPaOs響應(yīng)ABA誘導(dǎo)衰老、黑暗誘導(dǎo)衰老以及自然衰老。前人研究發(fā)現(xiàn)：擬南芥AtACD1主要編碼PaO，是葉綠素分解代謝途徑中的關(guān)鍵酶［11］；AtTic55編碼蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中具有調(diào)節(jié)光合作用或氧化還原相關(guān)功能的前體蛋白，使葉綠體正常行使光合功能，并通過(guò)間接調(diào)節(jié)下游SAGs表達(dá)在擬南芥黑暗誘導(dǎo)的衰老中起作用［42-44］；從葉綠體中分離的52 kD蛋白PTC52為原葉綠素a氧化酶，負(fù)向調(diào)控葉綠素的生物合成［45］。本研究發(fā)現(xiàn)，在3種衰老過(guò)程中TaPaO2、TaPaO5及TaPaO6的表達(dá)量最高，且分別與擬南芥AT3G44880（AtACD1）、AT2G24820（AtTic55）、At4G25650（AtPTC52）在同一亞家族，所以小麥TaPaOs基因家族中TaPaO2、TaPaO5及TaPaO6可能在葉綠素分解代謝中扮演著重要角色。

綜上所述，本研究利用生物信息學(xué)方法在小麥中鑒定到18個(gè)基因家族成員，其編碼蛋白大多數(shù)為不穩(wěn)定蛋白，均具有親水性，亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)均位于葉綠體中；表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)，TaPaOs在不同組織中的表達(dá)模式主要為葉>莖>根；TaPaO2、TaPaO5及TaPaO6在ABA誘導(dǎo)衰老、黑暗誘導(dǎo)衰老以及自然衰老時(shí)表達(dá)量高于其他基因，表明這3個(gè)基因在小麥衰老過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，為衰老研究重點(diǎn)關(guān)注基因。

參考文獻(xiàn)（References）：

［1］ 張浩. 關(guān)于中國(guó)小麥生產(chǎn)成本現(xiàn)狀分析與展望［J］. 農(nóng)業(yè)與技術(shù)， 2021， 41（23）： 139-143.

ZHANG Hao. Analysis and prospect of wheat production cost in China［J］. Agriculture and Technology， 2021， 41（23）： 139-143.

［2］ 馬娜. 小麥脫鎂葉綠酸a加氧酶基因 （TaPaO）的克隆及表達(dá)分析［D］. 泰安： 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2012.

MA Na. Cloning and expression analysis of wheat pheophorbide a oxygenase gene TaPaO ［D］. Taian： Shandong Agricultural University， 2012.

［3］ XIE Q， LIANG Y， ZHANG J， et al. Involvement of a putative bipartite transit peptide in targeting rice pheophorbide a oxygenase into chloroplasts for chlorophyll degradation during leaf senescence［J］. Journal of Genetics and Genomics， 2016， 43（3）： 145-154.

［4］ 王丹， 李升東， 馮波， 等. 不同耕作方式對(duì)小麥光合性能和產(chǎn)量形成的影響［J］. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2019， 51（10）： 35-39.

WANG Dan， LI Shengdong， FENG Bo， et al. Effects of different tillage methods on photosynthetic performance and yield formation of wheat［J］. Shandong Agricultural Sciences， 2019， 51（10）： 35-39.

［5］ H?rtensteiner S. Update on the biochemistry of chlorophyll breakdown［J］. Plant Molecular Biology， 2013， 82（6）： 505-517.

［6］ H?rtensteiner S. Chlorophyll degradation during senescence［J］. Annual Review of Plant Biology， 2006， 57（1）： 55-77.

［7］ Schelbert S， Aubry S， Burla B， et al. Pheophytin pheophorbide hydrolase （pheophytinase） is involved in chlorophyll breakdown during leaf senescence in Arabidopsis［J］. The Plant Cell， 2009， 21（3）： 767-785.

［8］ Tang C， Wang X， Duan X， et al. Functions of the lethal leaf-spot 1 gene in wheat cell death and disease tolerance to Puccinia striiformis［J］. Journal of Experimental Botany， 2013， 64（10）： 2955-2969.

［9］ Reinbothe S， Bartsch S， Rossig C， et al. A protochlorophyllide （pchlide） a oxygenase for plant viability［J］. Frontiers in Plant Science， 2019， 10： 593.

［10］ Gray J， Close P S， Briggs S P， et al. A novel suppressor of cell death in plants encoded by the Lls1 gene of maize［J］. Cell， 1997， 89（1）： 25-31.

［11］ Pruzinská A， Tanner G， Anders I， et al. Chlorophyll breakdown： pheophorbide a oxygenase is a Rieske-type iron-sulfur protein， encoded by the accelerated cell death 1 gene［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences， 2003， 100（25）： 15259-15264.

［12］ Gomez-Lobato M E， Civello P M， Martínez G A. Effects of ethylene， cytokinin and physical treatments on BoPaO gene expression of harvested broccoli［J］. Journal of the Science of Food and Agriculture， 2012， 92（1）： 151-158.

［13］ Chung D W， Pruzinská A， H?rtensteiner S， et al. The role of pheophorbide a oxygenase expression and activity in the canola green seed problem［J］. Plant Physiology， 2006， 142（1）： 88-97.

［14］ Jiang H， L M， Liang N， et al. Molecular cloning and function analysis of the stay green gene in rice［J］. The Plant Journal， 2007， 52（2）： 197-209.

［15］ Rodoni S， Schellenberg M， Matile P. Chlorophyll breakdown in senescing barley leaves as correlated with phaeophorbidea oxygenase activity［J］. Journal of Plant Physiology， 1998， 152（2/3）： 139-144.

［16］ Tang Y， Li M， Chen Y， et al. Knockdown of OsPaO and OsRCCR1 cause different plant death phenotypes in rice［J］. Journal of Plant Physiology， 2011， 168（16）： 1952-1959.

［17］ Sakuraba Y， Schelbert S， Park S Y. STAY-GREEN and chlorophyll catabolic enzymes interact at light-harvesting complex II for chlorophyll detoxification during leaf senescence in Arabidopsis［J］. The Plant Cell， 2012， 24（2）： 507-518.

［18］ Yates A D， Allen J， Amode R M， et al. Ensembl genomes 2022： an expanding genome resource for non-vertebrates［J］. Nucleic Acids Research， 2022， 50（D1）： D996-D1003.

［19］ Mistry J， Chuguransky S， Williams L， et al. Pfam： the protein families database in 2021［J］. Nucleic Acids Research， 2021， 49（D1）： D412-D419.

［20］ International Wheat Genome Sequencing Consortium （IWGSC）. Shifting the limits in wheat research and breeding using a fully annotated reference genome［J］. Science， 2018， 361（6403）： eaar7191.

［21］ Lu S， Wang J， Chitsaz F， et al. CDD/SPARCLE： the conserved domain database in 2020［J］. Nucleic Acids Research， 2020， 48（D1）： D265-D268.

［22］ Chen C， Chen H， Zhang Y， et al. TBtools： an integrative toolkit developed for interactive analyses of big biological data［J］. Molecular Plant， 2020， 13（8）： 1194-1202.

［23］ Gasteiger E， Hoogland C， Gattiker A， et al. Protein identification and analysis tools on the ExPASy server［J］. The Proteomics Protocols Handbook， 2005： 571-607.

［24］ Chou K C， Shen H B. Plant-mPLoc： a top-down strategy to augment the power for predicting plant protein subcellular localization［J］. PLoS One， 2010， 5（6）： e11335.

［25］ Kumar S， Stecher G， Tamura K. MEGA7： molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets［J］. Molecular Biology and Evolution， 2016， 33（7）： 1870-1874.

［26］ Letunic I， Bork P. Interactive tree of life （iTOL） v5： an online tool for phylogenetic tree display and annotation［J］. Nucleic Acids Research， 2021， 49（W1）： W293-W296.

［27］ Koonin E V. Orthologs， paralogs， and evolutionary genomics［J］. Annual Review of Genetics， 2005， 39（1）： 309-338.

［28］ Bailey T L， Elkan C. Fitting a mixture model by expectation maximization to discover motifs in biopolymers［J］. Proceedings of the Second International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology， 1994， 2（1）： 28-36.

［29］ Lescot M， Déhais P， Thijs G， et al. PlantCARE， a database of plant cis-acting regulatory elements and a portal to tools for in silico analysis of promoter sequences［J］. Nucleic Acids Research， 2002， 30（1）： 325-327.

［30］ International Wheat Genome Sequencing Consortium （IWGSC）. A chromosome-based draft sequence of the hexaploid bread wheat （Triticum aestivum） genome［J］. Science， 2014， 345（6194）： 1251788.

［31］ Gregersen P L， Holm P B. Transcriptome analysis of senescence in the flag leaf of wheat （Triticum aestivum L.）［J］. Plant Biotechnology Journal， 2007， 5（1）： 192-206.

［32］ 王艷珍. 普通小麥-十倍體長(zhǎng)穗偃麥草衍生后代的分子細(xì)胞遺傳學(xué)研究及特異標(biāo)記開(kāi)發(fā)［D］. 楊凌： 西北農(nóng)林科技大學(xué)， 2021.

WANG Yanzhen. Molecular cytogenetic studies on wheat-Thinopyrum ponticum derivatives and development of specificmarkers［D］. Yangling： Northwest A&F University， 2021.

［33］ 孫桑蓉. 麥類(lèi)作物基因組結(jié)構(gòu)解析與多倍化過(guò)程重構(gòu)［D］. 唐山： 華北理工大學(xué)， 2017.

SUN Sangrong. Comparative genomics analysis of wheat genome structure and reconstruction of chromosome repatterning after polyploidizations［D］. Tangshan： North China University of Science and Technology， 2017.

［34］ 程奕秋， 劉偉康， 陳廣玲， 等. 黃瓜葉綠素降解關(guān)鍵酶基因CsPAO的克隆與分析［J］. 西北植物學(xué)報(bào)， 2021， 41（10）： 1635-1642.

CHENG Yiqiu， LIU Weikang， CHEN Guangling， et al. Cloning and analysis of chlorophyll degradation key enzyme gene （CsPAO） in Cucumber sativus L.［J］. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica， 2021， 41（10）： 1635-1642.

［35］ 鄭潔， 胡美君， 郭延平. 光質(zhì)對(duì)植物光合作用的調(diào)控及其機(jī)理［J］. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)， 2008， 19（7）： 1619-1624.

ZHENG Jie， HU Meijun， GUO Yanping. Regulation of photosynthesis by light quality and its mechanism in plants ［J］. Chinese Journal of Applied Ecology， 2008， 19（7）： 1619-1624.

［36］ 楊成蘭， 祁存英， 馬銀花， 等. 青稞GPAT基因家族全基因鑒定及表達(dá)分析［J］. 植物生理學(xué)報(bào)， 2022， 58（10）： 2006-2016.

YANG Chenglan， QI Cunying， MA Yinhua， et al. Identification and expression analysis of GPAT gene family in hulless barley［J］. Plant Physiology Journal， 2022， 58（10）： 2006-2016.

［37］ Xiao H J， Liu K K， Li D W， et al. Cloning and characterization of the pepper CaPAO gene for defense responses to salt-induced leaf senescence［J］. BMC Biotechnology， 2015， 15（1）： 1-12.

［38］ 王海波， 郭俊云. 小桐子低溫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子JcDnaJ20p的克隆及煙草轉(zhuǎn)化功能鑒定［J］. 生物技術(shù)通報(bào)， 2021， 37（2）： 24-31.

WANG Haibo， GUO Junyun. Molecular cloning of cold-induced JcDnaJ20p promoter from jatropha curcas and its functional identification in transgenic Tobacco［J］. Biotechnology Bulletin， 2021， 37（2）： 24-31.

［39］ Pruzinská A， Tanner G， Aubry S， et al. Chlorophyll breakdown in senescent Arabidopsis leaves. Characterization of chlorophyll catabolites and of chlorophyll catabolic enzymes involved in the degreening reaction［J］. Plant Physiology， 2005， 139（1）： 52-63.

［40］ Yang J， Worley E， Udvardi M. A NAP-AAO3 regulatory module promotes chlorophyll degradation via ABA biosynthesis in Arabidopsis leaves［J］. The Plant Cell， 2014， 26（12）： 4862-4874.

［41］ 李鵬麗， 馬媛媛， 李小平， 等. 大豆GmLlsl基因的克隆及表達(dá)調(diào)控分析［J］. 科學(xué)通報(bào)， 2006， 9（53）： 1034-1041.

LI Pengli， MA Yuanyuan， LI Xiaoping， et al. Cloning and expression regulation analysis of soybean GmLlsl gene［J］. Chinese Science Bulletin， 2006， 9（53）： 1034-1041.

［42］ 王琪， 李云洲， 須文， 等. 葉綠體TOC-TIC蛋白復(fù)合體轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制研究進(jìn)展［J］. 園藝學(xué)報(bào)， 2021， 48（4）： 689-704.

WANG Qi， LI Yunzhou， XU Wen， et al. Research advance of protein transport mechanism of TOC-TIC complexes in plant chloroplast［J］. Acta Horticultural Sinica， 2021， 48（4）： 689-704.

［43］ Hauenstein M， Christ B， Das A， et al. A role for TIC55 as a hydroxylase of phyllobilins， the products of chlorophyll breakdown during plant senescence［J］. The Plant Cell， 2016， 28（10）： 2510-2527.

［44］ Chou M L， Liao W Y， Wei W C， et al. The direct involvement of dark-induced Tic55 protein in chlorophyll catabolism and its indirect role in the MYB108-NAC signaling pathway during leaf senescence in Arabidopsis thaliana［J］. International Journal of Molecular Sciences， 2018， 19（7）： 1854.

［45］ Bartsch S， Monnet J， Selbach K， et al. Three thioredoxin targets in the inner envelope membrane of chloroplasts function in protein import and chlorophyll metabolism［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences， 2008， 105（12）： 4933-4938.

收稿日期：2022-10-26；修回日期：2022-12-10。

基金項(xiàng)目：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)術(shù)恢復(fù)科研專(zhuān)項(xiàng)項(xiàng)目（2020xshf02）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31671607）。

作者簡(jiǎn)介：閆榮岳，碩士研究生。

* 通信作者：范華，副教授，主要從事小麥遺傳育種的研究，E-mail： jeanafan@163.com；

孫黛珍，教授，主要從事小麥遺傳育種的研究，E-mail： sdz64@126.com。