448?nm藍(lán)光照射致ARPE-19細(xì)胞壞死性凋亡研究

馬瓊 徐天池 康宏向

摘 要：長期超風(fēng)險(xiǎn)限值藍(lán)光照射可能導(dǎo)致視網(wǎng)膜變性疾病，而視網(wǎng)膜色素上皮損傷是視網(wǎng)膜光損傷的關(guān)鍵來源。本研究探討了448 nm藍(lán)光對(duì)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的損傷作用及凋亡方式。25 mW/cm2藍(lán)光照射ARPE-19細(xì)胞3、6、9、12 h，照后即刻采用鈣黃綠素乙酰甲酯染色檢測(cè)細(xì)胞活性，并在照后24 h采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)壞死性凋亡相關(guān)基因表達(dá)，同時(shí)采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western blot）檢測(cè)壞死性凋亡和DNA損傷標(biāo)志蛋白表達(dá)。9 h和12 h照射組細(xì)胞形態(tài)發(fā)生顯著變化，表現(xiàn)為細(xì)胞腫脹、間隙增大、漂浮細(xì)胞增多、細(xì)胞碎片增加；藍(lán)光照射3～9 h后RIPK1、RIPK3 mRNA表達(dá)量較正常組出現(xiàn)明顯升高，且在照射9 h時(shí)達(dá)到最大值；藍(lán)光照射6～12 h后RIPK1、RIPK3、P-MLKL壞死性凋亡蛋白標(biāo)志物的表達(dá)量隨藍(lán)光照射時(shí)間增加而明顯升高，并在照射12 h時(shí)達(dá)到最高值；藍(lán)光照射3～12 h后DNA損傷標(biāo)志物γ-H2AX蛋白表達(dá)量明顯升高，并在照射12 h時(shí)達(dá)到最高值。藍(lán)光照射9 h壞死性凋亡相關(guān)基因表達(dá)量達(dá)到最大，照射12 h基因表達(dá)明顯下降但壞死性凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量累積到最大，這提示25 mW/cm2藍(lán)光照射9～12 h可誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞發(fā)生壞死性凋亡，并表明DNA損傷程度與細(xì)胞壞死性凋亡發(fā)生可能存在關(guān)聯(lián)。

關(guān)鍵詞：藍(lán)光；ARPE-19細(xì)胞；壞死性凋亡；DNA損傷；光化學(xué)損傷

中圖分類號(hào)：Q28? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2023.01.006

A Study on the Necroptosis of ARPE-19 Cells Induced by 448 nm Blue Light

MA Qiong1， XU Tianchi1， 2， KANG Hongxiang1*

（1. Institute of Radiation Medicine， Academy of Military Medical Sciences， Academy of Military Science， Beijing 100850， China; 2. College of Life Sciences， Hebei University， Baoding 071000， China）

Abstract： Long-term blue light exposure beyond the risk limit is an important factor that causes retinal degenerative diseases， and damage to the retinal pigment epithelium is the key source of retinal light damage. In this study， we investigated the damaging effects of 448 nm blue light on human retinal pigment epithelial （ARPE-19） cells and the mode of apoptosis. ARPE-19 cells were irradiated with 25 mW/cm2 blue light for 3， 6， 9 and 12 hours， and cell activity was detected immediately by Calcein AM staining 24 h after irradiation. RT-PCR was used to examine the expression of necrotic apoptosis related genes 24 hours after irradiation， and the Western blotting was used to examine the expression of necroptosis-related and DNA-damage related proteins. The cell morphology changed significantly in the 9-hour and 12-hour groups， the cells swelled， the intercellular space was enlarged， and a large number of cell fragments and non-adhesive cells were observed. Compared with the normal group， the expression levels of the necroptosis-related genes RIPK1 and RIPK3 were significantly higher 3～9 hours after blue light irradiation， and reached the maximum value at 9 h. The expression levels of necroptosis-related proteins RIPK1， RIPK3， P-MLKL markers significantly increased with the increase of irradiation time after 6～12 h blue light irradiation， and reached the highest value at 12 h. The expression level of DNA damage-related γ-H2AX protein increased significantly after 3～12 h blue light irradiation， and reached the highest value at 12 h. The expression of necroptosis-related genes reached the maximum after 9 hours of blue light irradiation， while the expression of necroptosis-related proteins reached the maximum after 12 hours irradiation. It was speculated that 25 mW/cm2 blue light irradiation for 12 h may cause the necroptosis in ARPE-19 cells， and the degree of DNA damage may be related to the occurrence of necroptosis.

Key words： blue light; ARPE-19 cells; necroptosis; DNA damage; photochemical damage

（Acta Laser Biology Sinica， 2023， 32（1）： 036-042）

隨著LED光源在人們?nèi)粘Ｉ钪械膹V泛應(yīng)用和使用功率的快速提高，其對(duì)人體可能帶來的潛在危害越來越受到人們的關(guān)注［1-3］。LED光源中波長400～480 nm藍(lán)光對(duì)人眼損傷最為嚴(yán)重［4-5］。藍(lán)光對(duì)眼部組織的光損傷可引起干眼癥、白內(nèi)障、年齡相關(guān)性黃斑變性等疾?。?］。近幾年來，國內(nèi)外大量文獻(xiàn)表明，藍(lán)光長期暴露后會(huì)引起視網(wǎng)膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）細(xì)胞或感光細(xì)胞損傷，損傷形式主要以光化學(xué)損傷為主，嚴(yán)重時(shí)引起細(xì)胞凋亡或死亡［7-10］。而近幾年新發(fā)現(xiàn)的壞死性凋亡方式是否參與藍(lán)光誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞死亡尚不清楚。RPE細(xì)胞經(jīng)4.5 mW/cm2藍(lán)光照射6 h后細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著性變化，主要表現(xiàn)為細(xì)胞器腫脹、胞漿減少、線粒體空泡樣改變及腫脹、細(xì)胞核內(nèi)異染色質(zhì)減少固縮、常染色質(zhì)分散［11］，這些細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化與壞死性凋亡極其相似。壞死性凋亡信號(hào)調(diào)控機(jī)制復(fù)雜且精密，其中腫瘤壞死因子受體參與的信號(hào)通路研究較為清晰［12］。為了預(yù)防視網(wǎng)膜退行性疾病的產(chǎn)生及減輕或消除視網(wǎng)膜光損傷相關(guān)的視覺功能障礙，有必要闡明藍(lán)光照射后RPE細(xì)胞具體的程序性死亡方式及相關(guān)機(jī)制。本研究通過448 nm藍(lán)光照射人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞ARPE-19，采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）和蛋白免疫印跡法（Western blot）對(duì)壞死性凋亡標(biāo)志物受體相互作用蛋白激酶1（receptor-interacting protein kinase 1，RIPK1）、受體相互作用蛋白激酶3（receptor-interacting protein kinase 3，RIPK3）、底物混合譜系激酶樣蛋白（mixed lineage kinase domain-like protein，MLKL）表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，以探討藍(lán)光照射是否會(huì)誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞發(fā)生壞死性凋亡。另外，本研究還通過檢測(cè)DNA損傷標(biāo)志物蛋白γ-H2AX表達(dá)量變化來分析藍(lán)光照射是否會(huì)引起細(xì)胞DNA損傷，并初步探索其與細(xì)胞壞死性凋亡的關(guān)系，最終為深入研究視網(wǎng)膜藍(lán)光損傷和疾病防治提供新思路和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 ARPE-19細(xì)胞培養(yǎng)

人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞株（ARPE-19細(xì)胞）購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫官網(wǎng)，使用含10% 胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的DMEM/F12培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 主要試劑與耗材

本試驗(yàn)需要的主要試劑和耗材，如表1所示。

1.3 藍(lán)光照射裝置

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱加入定制的藍(lán)光照射裝置，如圖1所示，LED藍(lán)光光源放置在培養(yǎng)箱下層，LED尺寸為14 cm×11 cm，峰值波長為448 nm，半峰全寬為18 nm，使用移動(dòng)電源供電，上下移動(dòng)透明鋼化玻璃板以固定藍(lán)光照射細(xì)胞的垂直距離，細(xì)胞培養(yǎng)板放置在光源中心正上方，藍(lán)光從下向上照射細(xì)胞，并在培養(yǎng)箱四周放置無菌冰袋以確保培養(yǎng)箱內(nèi)溫度穩(wěn)定在37℃左右。

1.4 藍(lán)光照射細(xì)胞方法

ARPE-19細(xì)胞接種于10 cm培養(yǎng)皿中，細(xì)胞密度為每毫升106個(gè)，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育12 h，待細(xì)胞生長狀態(tài)良好后，將細(xì)胞培養(yǎng)板放置于藍(lán)光照射裝置中進(jìn)行藍(lán)光照射，采用功率計(jì)控制細(xì)胞培養(yǎng)板處功率，根據(jù)細(xì)胞板面積設(shè)定藍(lán)光照射強(qiáng)度為25 mW/cm2，且按藍(lán)光照射時(shí)間不同分為5組，分別為0、3、6、9和12 h組，其中0 h組為正常組（未進(jìn)行藍(lán)光照射）。

1.5 活細(xì)胞染色檢測(cè)細(xì)胞活性

無色的鈣黃綠素乙酰甲酯進(jìn)入細(xì)胞后可以被活細(xì)胞內(nèi)的酯酶斷裂成發(fā)出強(qiáng)綠色熒光的鈣黃綠素，用于活細(xì)胞檢測(cè)，且該染色試劑的毒性很低，基本不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損傷。藍(lán)光照射3、6、9和12 h后，即刻吸去培養(yǎng)基，在正常組和照射各組中各加入200 μL配制好的鈣黃綠素乙酰甲酯工作液，細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育20 min，PBS緩沖液洗凈未進(jìn)入細(xì)胞的染色試劑，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光染色情況，活細(xì)胞有綠色熒光，死細(xì)胞則無。

1.6 RT-PCR檢測(cè)壞死性凋亡相關(guān)基因表達(dá)水平

ARPE-19細(xì)胞經(jīng)25 mW/cm2藍(lán)光照射3、6、9和12 h后再培養(yǎng)24 h，在冰盒中使用細(xì)胞刮刀快速收集正常組和照射各組培養(yǎng)皿上的貼壁細(xì)胞，同時(shí)將培養(yǎng)基中漂浮細(xì)胞一并收集于預(yù)冷的PBS緩沖液中；提取細(xì)胞RNA，使用超微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度，使OD260 nm/OD280 nm值為1.8～2.0，–80℃保存。

引物設(shè)計(jì)：參考引物庫檢索核苷酸序列，并委托生工生物工程有限公司合成引物，信息見表2。

cDNA反轉(zhuǎn)錄：在冰盒上建立反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系（總體積為20 μL），如表3所示。渦旋混勻，PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增得到cDNA模板，反應(yīng)溫度為37℃反應(yīng)15 min、85℃反應(yīng)5 s，4℃暫時(shí)保存。

PCR：建立PCR反應(yīng)體系（總體積為25 μL），如表4所示。按如下程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增。1）預(yù)變性：95℃、30 s；2）PCR反應(yīng)：39個(gè)循環(huán)（95℃、5 s；60℃、30 s；72℃、10 min） ；3） 溶解曲線：65～95℃，每0.5℃讀板一次并停5 s。采用??Ct法進(jìn)行相對(duì)定量分析：公式F=2–??Ct，其中?Ct=Ct（目的基因）–Ct（管家基因），??Ct＝?Ct光照組–?Ct對(duì)照組。

1.7 Western blot印跡法檢測(cè)壞死性凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平

ARPE-19細(xì)胞經(jīng)25 mW/cm2藍(lán)光照射3、6、9和12 h后再培養(yǎng)24 h，正常組和照射各組使用預(yù)冷PBS收集細(xì)胞，加入150 μL 放射免疫沉淀法（radio immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液（含1%蛋白酶和磷酸酶抑制劑），提取細(xì)胞總蛋白并制備蛋白樣品，二辛可寧酸測(cè)定法（bicinchoninic acid assay，BCA）測(cè)定細(xì)胞蛋白濃度；上樣與電泳：蛋白樣品直接上樣到十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）加樣孔，恒壓條件下80 V電泳30 min，待蛋白預(yù)染marker條帶基本分離，電壓調(diào)為120 V，繼續(xù)電泳約60 min，待溴酚藍(lán)接近膠底端附近即電泳結(jié)束；轉(zhuǎn)膜：采用聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF），使用Bio-Rad標(biāo)準(zhǔn)濕式轉(zhuǎn)膜裝置，轉(zhuǎn)膜電流為300～400 mA，轉(zhuǎn)膜時(shí)間為30～60 min；封閉：轉(zhuǎn)膜完成后，三乙醇胺緩沖鹽水溶液-吐溫緩沖液（Tris buffered saline with Tween 20，TBST）清洗２次，每次5 min，加入快速封閉液并充分覆蓋全膜，置搖床上緩慢搖動(dòng)，室溫封閉5 min； 一抗孵育：分別加入RIPK1、RIPK3、P-MLKL、MLKL和γ-H2AX一抗抗體（按照體積比為1：1 000的比例稀釋），置搖床上緩慢搖動(dòng)，4℃孵育過夜，TBST漂洗3次；二抗孵育：加入二抗（辣根酶標(biāo)記山羊抗兔lgG），置搖床上緩慢搖動(dòng)，室溫孵育2 h，TBST漂洗3次；顯影：使用顯影定影試劑盒進(jìn)行蛋白顯影；定量分析：使用Image J 軟件定量分析目的蛋白條帶的積分吸光度（integrated absorbance，IA），目的蛋白相對(duì)表達(dá)量為IA（待測(cè)蛋白）/IA（內(nèi)參）比值，試驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算平均值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s），采用雙尾t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 藍(lán)光照射后ARPE-19細(xì)胞的活性變化

ARPE-19細(xì)胞經(jīng)25mW/cm2藍(lán)光照射3～12 h，細(xì)胞染色結(jié)果如圖2所示：未照射組細(xì)胞貼壁良好，基本為綠色熒光的活細(xì)胞；3 h和6 h照射組細(xì)胞形態(tài)開始變模糊，而且6 h組開始出現(xiàn)細(xì)胞空隙，存在部分未染色死細(xì)胞；9 h和12 h照射組細(xì)胞形態(tài)發(fā)生顯著變化，細(xì)胞腫脹，細(xì)胞間隙增大，漂浮細(xì)胞數(shù)量顯著增多，細(xì)胞碎片增加，并觀察到大量未染色死細(xì)胞。前期15 mW/cm2藍(lán)光照射ARPE-19細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果顯示，照射3～12 h后再培養(yǎng)24 h，各照射組細(xì)胞形態(tài)基本恢復(fù)到正常水平，且各組之間未見明顯差異；然而25 mW/cm2藍(lán)光照射3～12 h，各組細(xì)胞形態(tài)差異明顯，故25 mW/cm2可作為后續(xù)藍(lán)光細(xì)胞光損傷模型的輻照劑量。

2.2 藍(lán)光照射對(duì)ARPE-19細(xì)胞壞死性凋亡標(biāo)志物mRNA表達(dá)的影響

ARPE-19細(xì)胞經(jīng)25 mW/cm2藍(lán)光照射3～12 h，RT-PCR檢測(cè)壞死性凋亡相關(guān)基因表達(dá)水平結(jié)果如圖3所示：1）未照射組RIPK1、RIPK3 mRNA均低表達(dá)，Ct值分別為35.49和38.50，并將兩者表達(dá)量歸一化處理，即表達(dá)量為1；

2）與未照射組比較，藍(lán)光照射3～9 h后細(xì)胞內(nèi)RIPK1 mRNA表達(dá)量明顯升高（P<0.05或P<0.001），且9 h照射組達(dá)到最大值，而藍(lán)光照射12 h后RIPK1 mRNA表達(dá)量出現(xiàn)明顯下降（P<0.001）；3）藍(lán)光照射3～12 h后細(xì)胞內(nèi)RIPK3 mRNA表達(dá)量先增加后降低，但均明顯高于未照射組，且9 h照射組達(dá)到最大值（P<0.05或P<0.001）。

2.3 藍(lán)光照射對(duì)ARPE-19細(xì)胞壞死性凋亡標(biāo)志物蛋白表達(dá)的影響

ARPE-19細(xì)胞經(jīng)25 mW/cm2藍(lán)光照射6～12 h，Western blot印跡檢測(cè)細(xì)胞壞死性凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平結(jié)果如圖4所示。藍(lán)光照射6、9 和12 h后細(xì)胞內(nèi)壞死性凋亡相關(guān)的RIPK1、RIPK3和P-MLKL蛋白相對(duì)表達(dá)量均隨著照射時(shí)間增加而增大，且均明顯高于未照射組水平（P<0.001）；同時(shí)，各照射組MLKL蛋白相對(duì)表達(dá)量出現(xiàn)升高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上結(jié)果表明，藍(lán)光照射可誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞發(fā)生壞死性凋亡。

2.4 藍(lán)光照射對(duì)ARPE-19細(xì)胞DNA損傷標(biāo)記物γ-H2AX蛋白表達(dá)的影響

ARPE-19細(xì)胞經(jīng)25 mW/cm2藍(lán)光照射3～12 h，Western blot印跡檢測(cè)DNA損傷相關(guān)蛋白表達(dá)水平結(jié)果如圖5所示。藍(lán)光照射3～12 h后細(xì)胞內(nèi)γ-H2AX蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著升高（P<0.01），均明顯高于未照射組水平，且12 h照射組γ-H2AX蛋白相對(duì)表達(dá)量達(dá)到844.40±71.77，約為正常組的4倍。以上結(jié)果表明，藍(lán)光可誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞發(fā)生DNA損傷。

3 討論

RIPK1、RIPK3和MLKL是細(xì)胞產(chǎn)生壞死性凋亡的主要標(biāo)志物，其作用的主要過程是腫瘤壞死因子α（tumour necrosis factor-α，TNF-α）與腫瘤壞死因子受體1（tumor necrosis factor receptor 1，TNFR1）結(jié)合后，TNFR1募集TNFR1相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（TNF receptor 1-associated death domain protein，TRADD）、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2（tumor necrosis factor receptor related factor 2，TRAF2）和Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（Fas-associated death domain protein，F(xiàn)ADD）并形成復(fù)合物，隨后RIPK1從細(xì)胞膜上解離出來進(jìn)而轉(zhuǎn)變?yōu)榇偎劳龅鞍祝?3］。然后，根據(jù)外刺激條件不同，RIPK1調(diào)控下游相關(guān)信號(hào)路徑，引發(fā)細(xì)胞兩種凋亡方式，即凋亡或壞死性凋亡。若RIPK1募集pro-Caspase-8并使其活化，則發(fā)生細(xì)胞凋亡［14］；若胞內(nèi)Caspase-8被抑制，則招募RIPK3形成RIPK1-RIPK3復(fù)合體，復(fù)合體隨后募集MLKL并使其磷酸化為P-MLKL，最終引發(fā)壞死性凋亡［15］。MLKL蛋白磷酸化后引起細(xì)胞鈣離子內(nèi)流，磷脂酰絲氨酸從膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到膜表面，最終導(dǎo)致質(zhì)膜的完整性喪失，細(xì)胞死亡［16-17］。在形態(tài)學(xué)上，壞死性凋亡主要表現(xiàn)為胞膜穿孔，滲透壓升高導(dǎo)致細(xì)胞變圓和線粒體腫脹，核染色質(zhì)缺失，細(xì)胞膜發(fā)生爆炸式破裂。試驗(yàn)中觀察到藍(lán)光照射后細(xì)胞變圓、腫脹等與壞死性凋亡相類似的形態(tài)學(xué)變化。本試驗(yàn)結(jié)果表明：ARPE-19細(xì)胞經(jīng)25 mW/cm2藍(lán)光照射6～12 h后RIPK1、RIPK3、P-MLKL蛋白標(biāo)志物的表達(dá)量隨藍(lán)光照射時(shí)間增加而明顯升高，并在照射12 h時(shí)達(dá)到最高值；同時(shí)，RT-PCR的試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，藍(lán)光照射3～9 h后RIPK1、RIPK3 mRNA表達(dá)量出現(xiàn)明顯升高，且在照射9 h時(shí)達(dá)到最大值，但在照射12 h時(shí)表達(dá)量出現(xiàn)下降。以上結(jié)果表明，藍(lán)光照射9 h時(shí)壞死性凋亡相關(guān)基因表達(dá)量達(dá)到最大，而照射12 h時(shí)基因表達(dá)明顯下降而壞死性凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量累積到最大，提示25mW/cm2藍(lán)光照射9～12 h可能誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞發(fā)生壞死性凋亡。

DNA雙鏈斷裂被認(rèn)為是電離輻射致細(xì)胞殺傷、染色體變異及細(xì)胞癌變或死亡最嚴(yán)重的損傷之一。細(xì)胞對(duì)DNA雙鏈斷裂最開始的修復(fù)途徑之一就是產(chǎn)生γ-H2AX，然后γ-H2AX與細(xì)胞修復(fù)相關(guān)因子結(jié)合，對(duì)DNA雙鏈斷裂進(jìn)行修復(fù)［18］。曹忠琦［19］在研究黍子過氧化物酶（proso millet peroxidase，PmPOD）對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞DNA損傷和壞死性凋亡機(jī)制中發(fā)現(xiàn)，黍子過氧化物酶、壞死性凋亡抑制劑和抗氧化劑共同處理可以有效抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的壞死性凋亡，但卻不能抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞DNA雙鏈斷裂，并證實(shí)了DNA雙鏈斷裂是細(xì)胞產(chǎn)生壞死性凋亡的前提條件。本試驗(yàn)通過檢測(cè)藍(lán)光照射后DNA損傷標(biāo)記物γ-H2AX蛋白表達(dá)量來觀察藍(lán)光照射后ARPE-19細(xì)胞DNA損傷情況，結(jié)果表明，藍(lán)光照射3～12 h后細(xì)胞內(nèi)γ-H2AX蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯升高，且在照射12 h后達(dá)到最大，提示25 mW/cm2藍(lán)光照射可誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞發(fā)生DNA損傷。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，藍(lán)光照射12 h后細(xì)胞壞死性凋亡、DNA損傷標(biāo)記物蛋白表達(dá)量都達(dá)到最大值，因此推測(cè)DNA損傷程度與細(xì)胞壞死性凋亡發(fā)生可能存在關(guān)聯(lián)，然而兩者相互關(guān)系及其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。因此，藍(lán)光對(duì)ARPE-19細(xì)胞損傷結(jié)果有助于闡明藍(lán)光對(duì)眼睛的潛在安全危害，為藍(lán)光安全應(yīng)用提供基礎(chǔ)，并為藍(lán)光誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜變性疾病提供潛在的治療靶點(diǎn)。

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收稿日期：2022-11-30；修回日期：2023-01-05。

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81901907）。

作者簡介：馬瓊，實(shí)驗(yàn)師，主要從事激光生物學(xué)研究。

* 通信作者：康宏向，副研究員，主要從事激光生物學(xué)研究。E-mail： khx007@163.com。