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    一種白蠟樹(shù)真菌病害的分離與鑒定

    2024-01-26 03:58:26覃瑩菲李成剛譚新球
    湖南農(nóng)業(yè)科學(xué) 2023年12期
    關(guān)鍵詞:白蠟樹(shù)病葉鏈格

    覃瑩菲,張 鑫,陳 岳,李成剛,譚新球

    (1.湖南大學(xué)研究生院隆平分院,湖南 長(zhǎng)沙 410125;2.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,湖南 長(zhǎng)沙 410125)

    白蠟樹(shù)(Fraxinus chinensisRoxb)為木犀科梣屬大型落葉喬木[1],在我國(guó)共有27 種。白蠟樹(shù)高15~20 m,樹(shù)皮呈灰褐色,頂生的小葉與側(cè)生的小葉等大或稍大,羽狀復(fù)葉長(zhǎng)15~25 cm,葉柄長(zhǎng)4~6 cm。白蠟樹(shù)耐旱,萌發(fā)能力強(qiáng),生長(zhǎng)迅速,樹(shù)形優(yōu)美,材理通直,還有較強(qiáng)的耐鹽性,常種植于鹽堿地以改良環(huán)境,具有較好的綠化及生態(tài)價(jià)值[2]。白蠟樹(shù)在我國(guó)種植歷史悠久、分布甚廣,其植株生長(zhǎng)迅速,枝條柔韌可供編制各種用具,樹(shù)皮還具有較高的藥用價(jià)值[3],相關(guān)產(chǎn)業(yè)具有一定規(guī)模。

    近年來(lái),白蠟樹(shù)病蟲(chóng)害問(wèn)題日益嚴(yán)重,在樹(shù)苗期和成熟期對(duì)白蠟樹(shù)造成嚴(yán)重危害,阻礙白蠟樹(shù)生長(zhǎng)發(fā)育及相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展。研究報(bào)道,由立枯絲核菌引起的立枯病是白蠟樹(shù)苗期的主要病害,主要危害地下根部和莖基部,導(dǎo)致白蠟樹(shù)出現(xiàn)不規(guī)則褐色凹陷的病斑,嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致幼苗死亡[4]。白蠟褐斑病主要危害葉片,病斑為灰褐色,表面分布深褐色霉點(diǎn),會(huì)造成葉片脫落或變形,嚴(yán)重時(shí)會(huì)使植株死亡[5]。流膠病也會(huì)影響白蠟樹(shù)的生長(zhǎng),其發(fā)生與氣候、栽培管理水平、土壤土質(zhì)等有相關(guān)性,真菌侵染或者病蟲(chóng)侵入都會(huì)導(dǎo)致流膠病,具體癥狀為白蠟枝干流出黃色膠狀物質(zhì),最終導(dǎo)致樹(shù)體衰弱、枯竭[6]。白蠟枯梢病由白蠟鞘孢菌所致,病部出現(xiàn)潰瘍或壞死,且木質(zhì)部褪綠明顯,當(dāng)病斑擴(kuò)展環(huán)繞枝條,就會(huì)產(chǎn)生枯梢[7]。按昆蟲(chóng)類(lèi)別劃分,為害白蠟樹(shù)的常見(jiàn)害蟲(chóng)有蟬蛾目瘦蛾科害蟲(chóng),鱗翅目、膜翅目、半翅目、鞘翅目等害蟲(chóng)。白蠟樹(shù)從春天長(zhǎng)葉到秋冬落葉,均受害蟲(chóng)侵?jǐn)_[8]。白蠟窄吉丁初孵幼蟲(chóng)會(huì)從白蠟樹(shù)韌皮部啃食至木質(zhì)部,導(dǎo)致樹(shù)皮開(kāi)裂、脫落[9]。白蠟梢距甲成蟲(chóng)啃食樹(shù)苗葉柄,使得葉片萎縮,幼苗不能正常生長(zhǎng)[10]??傊喾N病蟲(chóng)害導(dǎo)致白蠟樹(shù)生長(zhǎng)發(fā)育緩慢,外觀受損嚴(yán)重甚至死亡,不利于環(huán)境美化和經(jīng)濟(jì)效益提高。因此,鑒定白蠟樹(shù)病蟲(chóng)害的對(duì)白蠟樹(shù)的生長(zhǎng)及相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。

    鏈格孢屬(Alternariaspp.)真菌寄主廣泛,可為害糧食作物、蔬菜、花卉、數(shù)木等多種經(jīng)濟(jì)作物,導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失,鏈格孢菌(Alternaria alternata)廣泛分布在糧食、飼料、土壤和腐爛有機(jī)物質(zhì)中,部分致病的鏈格孢菌對(duì)其寄主植物具有致病毒素,從而侵染寄主植物[11]。如柑橘鏈格孢褐斑病主要危害橘、柚、橙等,引起落葉落果和枯梢,帶病斑果實(shí)難以銷(xiāo)售[12]。鏈格孢侵染枸杞后,會(huì)產(chǎn)生典型黑霉病癥狀,病斑周?chē)仕疂n狀,中部產(chǎn)生白色菌絲,果實(shí)漸漸軟化、變黑,失去經(jīng)濟(jì)價(jià)值[13]。羅光明等[14]通過(guò)轉(zhuǎn)錄組技術(shù)研究了梔子接種鏈格孢菌后在基因轉(zhuǎn)錄上的差異,分析了關(guān)鍵通路和關(guān)鍵基因,有助于探明鏈格孢菌與植物的互作機(jī)制。文中探明對(duì)白蠟樹(shù)葉片的致病菌進(jìn)行了形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定,以期為白蠟樹(shù)病害防治提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    1.1.1 供試菌種 供菌種鑒定的白蠟樹(shù)病葉實(shí)體于2022 年7 月28 日采摘于懷化市芷江縣楊家坪鎮(zhèn)。

    1.1.2 培養(yǎng)基 PDA 培養(yǎng)基:200 g 馬鈴薯切成小塊,沸水煮30~40 min,取紗布過(guò)濾,冷卻至室溫,加入葡萄糖20 g,加ddH2O 定容至1 L,分裝至200 mL 錐形瓶(配置固體培養(yǎng)基每瓶加入瓊脂3 g),121℃,滅菌20 min,冷卻后放置4℃?zhèn)溆谩?/p>

    1.1.3 主要試劑 T5 Direct PCR Kit 購(gòu)買(mǎi)自Tsingke Biotechnology 生物有限公司。引物采用真菌通用引物ITS1、ITS4,由Tsingke Biotechnology 生物有限公司合成,引物序列為ITS1:5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3';ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 菌種分離 內(nèi)生菌的分離參考袁珊珊等[15]方法進(jìn)行了細(xì)微的調(diào)整。將采集的病葉在超凈臺(tái)內(nèi)用1% NaClO 浸泡1 min,隨后轉(zhuǎn)入75% 乙醇中浸泡1 min,用手術(shù)刀片輕輕切割病斑,用接種針小心取出中間病葉,最終獲得2 mm×2 mm 含有病菌的病葉,小心接種在PDA 平板培養(yǎng)皿中,每個(gè)培養(yǎng)皿接種一個(gè)菌塊,重復(fù)5 次,放置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每日觀察菌株生長(zhǎng)情況2 次。該菌株編號(hào)Z3727-10。

    1.2.2 菌絲DNA 提取及檢測(cè) 當(dāng)菌絲生長(zhǎng)至直徑為3 cm 時(shí),取邊緣菌絲,在超凈臺(tái)切割成1 mm×1 mm菌絲塊接種至PDA 液體培養(yǎng)基中,28℃,200 r/min培養(yǎng),每天觀察菌絲生長(zhǎng)情況,待菌絲長(zhǎng)至合適大小,用濾膜過(guò)濾培養(yǎng)基,保留菌絲球,利用CTAB 法進(jìn)行基因組DNA 提取,將提取的DNA 置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?,? μL 提取的DNA 經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),使用Syngene G:BOX 凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。

    1.2.3 PCR 擴(kuò)增及其序列鑒定 以提取的基因組DNA 為模板,應(yīng)用真菌通用引物ITS1和ITS4進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,PCR 擴(kuò)增體系為2×T5 Direct PCR Mix 12.5 μL,上游引物1 μL,下游引物1 μL,DNA 樣品0.5μL,加ddH2O 定容至25 μL;PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?8℃預(yù)變性3 min;98℃變性10 s,55℃退火10 s,72℃延伸30 s,共計(jì)30 個(gè)循環(huán);最后72℃延伸5 min, 4℃保持。PCR 結(jié)束后取10 μL PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,并將產(chǎn)物送至北京擎科生物科技股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果登錄NCBI 進(jìn)行Blast 比對(duì)鑒定。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 菌種形態(tài)特征

    采集的葉片病斑如圖1 所示,病斑呈黑色,圓形,表面光滑,病斑中心扁平。菌種分離生長(zhǎng)形態(tài)如圖2 所示,分離的菌絲在生長(zhǎng)速度上并無(wú)明顯差異,菌絲長(zhǎng)勢(shì)和菌絲濃密程度差異不大,菌絲光滑,有光澤,正面呈白色向四周蔓延生長(zhǎng),背面有前期黃色物質(zhì)析出,后期呈現(xiàn)黑色,菌絲分布茂密,菌落呈半透明狀,無(wú)水滴析出。

    圖1 白蠟樹(shù)病葉

    圖2 白蠟樹(shù)病葉分離的病菌菌絲形態(tài)

    2.2 菌絲DNA 提取及PCR 擴(kuò)增

    利用CTAB 法提取Z3727-10 菌絲總DNA 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),結(jié)果顯示,DNA 條帶清晰明亮,無(wú)拖尾現(xiàn)象,檢測(cè)結(jié)果表明DNA 提取效果良好,基因組DNA 完整,可以用作后續(xù)PCR 試驗(yàn)。以DNA 為模板,利用真菌鑒定通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增并對(duì)結(jié)果進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),結(jié)果(圖3)顯示目的產(chǎn)物條帶大小與預(yù)期結(jié)果相同。

    圖3 ITS-PCR 凝膠電泳檢測(cè)

    2.3 序列比對(duì)

    對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序,結(jié)果顯示,PCR 產(chǎn)物長(zhǎng)度為585 bp,且為單峰,表明菌種分離純化成功,無(wú)其他雜菌污染,獲得單一菌種。將目的基因序列在NCBI 中進(jìn)行比對(duì),結(jié)果(圖4)表明,與待鑒定菌種相似性最高的菌株為Alternaria alternata,query cover 為100%,per.ident 為100%,最終確定病原菌為Alternaria alternata(黑斑病菌)。并對(duì)菌種鑒定結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析,結(jié)果如圖5 所示,從圖5中可以看出,Z3727-10 屬于鏈格孢屬(Alternala)。

    圖4 序列比對(duì)結(jié)果

    圖5 菌種系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹(shù)

    3 討 論

    鑒定白蠟樹(shù)病害的病源菌有助于采取有效措施防治白蠟樹(shù)病害,對(duì)白蠟樹(shù)的生長(zhǎng)發(fā)育及相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。將病原菌進(jìn)行分離后培養(yǎng),觀察菌絲形態(tài),測(cè)定生長(zhǎng)速率難以準(zhǔn)確判定病原菌種類(lèi),目前多采用ITS等分子鑒定手段對(duì)菌種進(jìn)行鑒定,國(guó)際核酸庫(kù)信息資源不斷豐富,將ITS序列與GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast 比對(duì),序列相似性≥99%,即可以鑒定為相同種[16],通過(guò)對(duì)白蠟樹(shù)病害菌種的形態(tài)觀察及基因庫(kù)比對(duì),最終確定病原菌為Alternaria alternata(黑斑病菌)。

    黑斑病菌對(duì)多種植物如棗樹(shù)、蘋(píng)果梨、金刺梨等均可造成危害。研究報(bào)道,黑斑病入侵棗樹(shù)后,一般在果實(shí)白熟期開(kāi)始顯現(xiàn)癥狀,且病斑多在果實(shí)頂端或果實(shí)臍部,對(duì)果實(shí)口感造成影響,嚴(yán)重時(shí)造成果實(shí)腐爛,減產(chǎn)40%[17]。黑斑病菌經(jīng)果皮入侵,但在果實(shí)采摘時(shí)無(wú)性狀,貯藏時(shí)發(fā)病率可高達(dá)37%[18]。研究表明,80%多菌靈可濕性粉劑、75%百菌清可濕性粉劑、70% 甲基硫菌靈可濕性粉劑可在室內(nèi)有效抑制黑斑病菌[19]。因此,鑒定白蠟樹(shù)病菌,并及時(shí)采取有效防治措施,對(duì)保護(hù)白蠟樹(shù)與減少經(jīng)濟(jì)損失具有重要意義。

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