基于微衛(wèi)星標記的密點麻蜥遺傳結構分析

范譯心，申志坤，鄧文卓，李 鈾,2

（1.西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730124；2.西北民族大學生物醫(yī)學研究中心，甘肅省動物細胞技術創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州 730030）

密點麻蜥（Eremias multiocellata）屬蜥蜴科麻蜥屬，俗名馬蛇子，是變溫動物，主要以昆蟲為食[1]，在我國分布非常廣泛，是麻蜥屬中分布最廣的種類，遍及東北、西北以及華北等地區(qū)[2]。密點麻蜥是荒漠草原和半荒漠草原上最常見的卵胎生蜥蜴，是生態(tài)系統(tǒng)的消費者，能保證能量遵循食物鏈和食物網(wǎng)的逐級流動，從而確保能量的有效傳遞，對荒漠化科學草原的生態(tài)系統(tǒng)具有極其重要的意義，它的存在可以幫助人們更好地評估當前的生態(tài)環(huán)境[3-5]。同時，密點麻蜥捕食的昆蟲中害蟲數(shù)量明顯多于益蟲數(shù)量，是對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和人類生活有益的動物。近年來，由于自然環(huán)境的變化，密點麻蜥的生存環(huán)境也發(fā)生了較大變化，導致其數(shù)量日漸減少。因此，密點麻蜥被列入《國家保護的有益的或者有重要經(jīng)濟、科學研究價值的陸生野生動物名錄》，以此來保護它們的生存環(huán)境，維護其生存空間[6-7]。

微衛(wèi)星 DNA 是真核生物基因組重復序列中的主要組成部分，其單元長度介于1～6 bp 之間，形成簇狀結構，被稱為短串聯(lián)重復序列（short tandem repeats，STRs)）或簡單重復序列（simple sequence repeats，SSR）。每個微衛(wèi)星DNA 都由核心序列和側翼序列組成，其核心序列呈串聯(lián)重復排列，側翼DNA 序列位于核心序列的兩端，為保守的特異單拷貝序列，能使微衛(wèi)星特異地定位于染色體常染色質區(qū)的特定部位。因此，通過微衛(wèi)星DNA 標記能夠獲取大量的多態(tài)信息。經(jīng)過多年的發(fā)展，微衛(wèi)星DNA標記技術已成為一種非常有效的遺傳標記手段，被廣泛應用于遺傳多樣性評估、系統(tǒng)發(fā)育樹構建、群體遺傳結構和親緣關系分析等領域。同其他分子標記相比，微衛(wèi)星DNA 具有共顯性、操作簡便、可重復性好等特點，為研究動物系統(tǒng)進化關系提供了有力支持[8]。

該研究利用10 個微衛(wèi)星引物，對2 個地理種群的16 個密點麻蜥樣本進行遺傳結構分析，以期探索密點麻蜥種質資源的演化形成過程，定義重要進化單元，并為密點麻蜥的保護利用提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

供試樣本為從甘肅省張掖市高臺縣八壩村（GTBB）和寧夏回族自治區(qū)中衛(wèi)市甘塘鎮(zhèn)（GT）2個地區(qū)采集的16 只密點麻蜥，2 個地區(qū)各8 只，其中八壩村采集的樣品編號為M154～M161，甘塘鎮(zhèn)采集的樣品編號為M171～M178。用無水乙醇與生理鹽水按1 ∶1 的比例配成組織保存液保存樣本，置于-20℃冰柜保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因組DNA 的提取

將密點麻蜥樣本從組織保存液中取出，用高溫滅菌后的眼科剪取密點麻蜥的組織，用通用型基因組DNA 提取試劑盒提取樣品總DNA，并用1.4%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的完整性和濃度，將所提取的較高純度的DNA 原液置于-20℃冰柜保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物篩選及PCR 擴增

Chen 等[7]設計了 11 個密點麻蜥的微衛(wèi)星位點，由于位點 Emu115 在實驗過程中擴增結果不理想。因此該研究選用其他10 個位點進行PCR 擴增，分別為Emu49、Emu53、Emu55、Emu61、Emu65、Emu92、Emu93、Emu116、Emu131、Emu132。引物序列見表1，由湖南艾科瑞生物工程有限公司合成。

表1 密點麻蜥微衛(wèi)星標記的引物信息

PCR 的反應體系（12 μL）：5×buffer（無Mg2+）2.4 μL，Immolase DNA 聚 合 酶0.06 μL，10 μmol/L上游熒光標記引物tag F（Fam、Ned、Vic、Pet）0.09μL，10 μmol/L 下游熒光標記引物tag R 0.09 μL，0.4μmol/L Primers（特異性引物）2.4 μL，合適濃度DNA 模板2 μL，無菌水補足12 μL。PCR 擴增程序：95℃預變性10 min；一階段92℃變性60 s，50℃退火90 s，72℃60 s，5 個循環(huán)；二階段92℃變性30 s，63℃退火90s，72℃延展60 s，20 個循環(huán)；三階段92℃變性15 s，54℃退火30s，72℃延伸30 s，40個循環(huán)；72℃延伸30 min[8]。用1.4%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物，交由蘇州金唯智生物科技有限公司進行毛細管電泳測序分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用GeneMarker 軟件對原始AB1 文件進行基因分型，分別將不同編號的2 條序列的波峰拼接得到比較完整序列的波峰圖，刪去錯峰后保存其序列，所有數(shù)據(jù)采用 PopGen 32 和GenAlex V6.5 軟件處理[9]，計算其等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、無偏預期雜合度（uHe）、香農(nóng)信息指數(shù)（I）、近交系數(shù)（Fis）、分化系數(shù)（Fst）和基因流（Nm）等指標，并進行方差分析（AMOVA）。用Cervus3.0 軟件計算各位點的多態(tài)信息含量（PIC）[10]。

2 結果與分析

2.1 PCR 擴增結果分析

用10 對微衛(wèi)星引物對2 個地區(qū)的16 只密點麻蜥DNA 進行擴增，獲得長度在200～300 bp 之間的目的條帶，采用凝膠電泳檢測，目的條帶大小一致、亮度清晰（圖1），符合預期，可進行后續(xù)的多態(tài)性分析。

圖1 部分密點麻蜥樣品的微衛(wèi)星引物PCR 擴增結果

2.2 遺傳多樣性分析

由表2 可知，在16 只密點麻蜥中，10 對微衛(wèi)星引物的Ne 值為0～0.619，Ho 值為0～0.619，He 值為0.309～ 0.737，uHe 值 為0.327～ 0.798，F(xiàn)is 值 為-0.002～1.000，其中只有Emu61 的Fis 為負值，其余9 個位點都為正值，平均值為0.525。Fst 軟件計算出的多態(tài)信息含量（PIC）在0.387～0.828 范圍內，平均PIC值為0.703，其中只有Emu132 的PIC 值小于0.5，為0.387。由表3 可知，GT 群體的有效等位基因數(shù)（Ne）大于GTBB 群體的，分別為4.745 和1.697。GTBB 和GT 群體的觀測雜合度（Ho）均值分別為0.253 和0.344，期望雜合度（He）分別為0.352 和0.765。GT 群體的I 值為1.669 ＞1，GTBB 群體的I值為0.540 ＜1。

表2 16 只密點麻蜥樣品中10 個微衛(wèi)星位點的遺傳多樣性

表3 兩個群體遺傳變異結果

由表4 可知，10 個微衛(wèi)星位點在GTBB 群體上的等位基因數(shù)（Na）為 1.000～3.000；GT 群體的等位基因數(shù)為 4.000～9.000。GTBB 的平均I 值小于 1，說明該群體遺傳變異程度較低；GT 的平均I 值大于1，說明該群體遺傳變異程度較高。GTBB 的密點麻蜥種群平均He 值為0.353，GT 的密點麻蜥種群平均He 值為0.797。GTBB 的密點麻蜥種群平均Ho 值為0.253，GTBB 的密點麻蜥種群平均Ho 值為0.561。

表4 2 個密點麻蜥群體中10 個微衛(wèi)星位點的遺傳多樣性分析

2.3 微衛(wèi)星標記的遺傳分化

為了能夠更全面了解遺傳距離與地理距離的相關性，根據(jù)試驗結果繪制了基于 Nei's 地理距離與遺傳距離之間的相關分析，結果如圖2 所示，密點麻蜥的地理距離與遺傳距離為正相關，P=0.010 ＜0.05，說明遺傳距離與地理距離顯著正相關，即：密點麻蜥的遺傳結構隨遺傳距離和地理距離的變化而變化。

圖2 基于Nei's 遺傳距離與地理距離之間相關性檢驗

AMOVA 分析結果（表5）顯示，2 個種群間的遺傳變異占29%，種群內個體間遺傳變異占71%，表明變異大部分存在于種群內，種群間遺傳分化較小。種群內的遺傳變異占總體變異相對較大，密點麻蜥種群之間的基因交流相對較少，整體的遺傳變異絕大部分來自于個體間。

表5 密點麻蜥種群遺傳變異的分子方差分析（AMOVA）

3 討 論

3.1 密點麻蜥種群的遺傳多樣性

狹義的遺傳多樣性主要是指生物種內基因的變化，包括種內顯著不同的種群之間以及同一種群內的遺傳變異，是在一定時空范圍內生物遺傳變異的結果，是生物多樣性的基礎核心，其研究多從染色體、蛋白質和核酸3 個層面應用多種技術分析生物遺傳物質的變化情況。不同的地理分布、生活環(huán)境、食性以及生存地域優(yōu)勢物種，都會對某一特定物種的遺傳多樣性產(chǎn)生影響，構成影響遺傳多樣性的外部因素[6]。香農(nóng)指數(shù)（I）是衡量物種多樣性的重要指標，其值越高，表明群體的遺傳變異程度越顯著，反之則越不顯著[11]。GTBB 的I 平均值小于1，說明其遺傳變異程度較低；GT 的I 平均值大于1，說明其遺傳變異程度較高。衡量群體遺傳變異的另一個重要參數(shù)就是基因雜合度，一般期望雜合度（He）越高說明群體的遺傳變異越大。研究結果表明，GTBB的He 平均為0.353，說明其遺傳變異較??；GT 的He 平均為0.797，說明其遺傳變異相對較大。觀測雜合度（Ho）越接近期望雜合度，說明群體受外來因素影響越小，處于遺傳平衡狀態(tài)[12]。GTBB 的Ho平均為0.253， He 平均為0.353，2 個數(shù)值較為接近，說明此群體受外來因素影響較小，處于遺傳平衡狀態(tài)；GT 的Ho 與He 相差也較小 （0.236），說明群體受外來因素影響較小，處于遺傳平衡狀態(tài)。

Ho 和He 還可用來評估遺傳多樣性，也就是群體內部多樣性的水平，若Ho 低于He，則可能意味著遺傳多樣性較低，而這可能導致密點麻蜥的健康問題；反之，如果Ho 高于He，則可能意味著群體內部存在較高的遺傳多樣性，更有利于密點麻蜥的健康，讓群體更好地遺傳優(yōu)良基因。研究結果表明，GTBB 和GT 這2 個密點麻蜥種群的Ho 平均值都小于He，遺傳多樣性較低，有害基因突變會逐漸累積，危害種群整體健康狀況，另外加上人類活動或自然災害的影響，物種瀕危風險大增，因此，對2 地區(qū)密點麻蜥的保護迫在眉睫。

PIC 值用于衡量動物的種群多態(tài)性水平。根據(jù)其信息含量可分為高水平 （PIC ＞0.5）、中水平（0.5 ≥PIC ＞0.25）和低水平（PIC ≤0.25）。該研究中2 個密點麻蜥群體的10 個微衛(wèi)星位點的平均多態(tài)信息含量的值為0.387～0.828，除Emu132 外，其他位點的PIC 都大于0.5，表明這些位點信息含量為高水平，具有高度多態(tài)性；只有Emu132 的PIC 值為0.387，小于0.5，表明Emu132 這個位點的多態(tài)性低，是低度水平多樣性；其中Emu65 提供的遺傳信息最多，PIC 最高（0.828）。

保護生物多樣性的關鍵步驟是分析種質資源中的遺傳變異，微衛(wèi)星標記能揭示多個等位基因，并易于分離遺傳相似的個體和同源基因組。在種群中發(fā)展新的或現(xiàn)存的獨特等位基因主要與樣本對生存條件和環(huán)境條件的適應有關。獨特等位基因對于保護基因型的遺傳多樣性至關重要。分子標記為遺傳多樣性分析和基因組結構研究提供了工具。研究表明，等位基因（Na）是衡量微衛(wèi)星位點多態(tài)性的重要參數(shù)，該研究選取的10 個微衛(wèi)星位點中，除Emu49、Emu55、Emu132 外，其余7 個位點的等位基因均在4 個及以上，Na 平均為4.350。這表明可以利用這些微衛(wèi)星位點來評估密點麻蜥的遺傳多樣性。有效等位基因數(shù)（Ne）可以更好地了解群體的遺傳變異情況，因為它可以更準確地反映出等位基因的分布情況，從而更好地揭示出群體的基因組結構[13]。研究中2 個密點麻蜥群體在10 個微衛(wèi)星位點上檢測到的平均Na/Ne 的比值大于1，且平均等位基因數(shù)高于平均有效等位基因數(shù)，說明等位基因分布不均勻，造成比值較大的原因可能是近交帶來的負面影響及樣本數(shù)量太少所導致的。

3.2 密點麻蜥種群遺傳結構和遺傳分化

群體的遺傳結構是指一個物種的基因組成，它們的頻率和多樣性取決于交配方式。掌握了不同時期遺傳結構的演變方式就可以探討生物的進化過程[14]。近交系數(shù)（Fis）可以反映出群體內的近交程度。當Fis 為正數(shù)時，說明該群體中有著密切的近親關系；相反，當Fis 為負數(shù)時，說明該群個體之間有著較大的距離[9]。該研究表明，密點麻蜥群體間存在一定程度的基因交流；Fis 只有Emu61 為負值，其余9個位點都為正值，說明密點麻蜥群體近交明顯，雜合子缺失。在此情況下，應適當提高雜合程度，否則種群的基因庫無法得到更新，引進不了其他優(yōu)良基因，長期下去密點麻蜥種群會衰退，最終有可能走向滅絕。

分化系數(shù)（Fst）介于0～0.05 之間時，說明2 個群體之間的遺傳差異較小，可以忽略這一因素；當Fst 介于0.05～0.15 之間時，說明該群體的差異性較??；當Fst 介于0.15～0.25 之間時，群體之間的差異顯著增加；當Fst 達0.25 以上時，群體之間的遺傳差異會變得非常明顯[15-16]。研究結果表明，2 個密點麻蜥群體之間的Fst 達到了0.209，說明2 個群體間遺傳分化水平高，基因流小。而方差分析結果顯示，種群之間的變異率達到了29%，而種群內的變異率達到了71 %，說明種群內部的遺傳分化程度處于偏高水平。

4 結 論

當前，我國密點麻蜥群體的遺傳多樣性較為豐富，但由于其自身的遷徙能力、地理位置的不同以及其他外部因素的影響，導致個體之間的差異趨于明顯，這也意味著它們的適應能力也會有所差異。隨著生物資源的不斷開發(fā)利用，人類必須正確理解并重視它們的遺傳多樣性變化。避免因過度開發(fā)導致物種遺傳多樣性大幅降低，增加密點麻蜥的瀕危風險[17]。

環(huán)境和生物的相互關系是生態(tài)學的基本問題。在自然界中，環(huán)境梯度經(jīng)常導致不同的自然選擇，爬行動物因其擴散能力有限因此對外界環(huán)境尤其是溫度的依賴性強[18]。該研究結果表明，寧夏回族自治區(qū)中衛(wèi)市甘塘鎮(zhèn)和甘肅省張掖市高臺縣八壩村2個地區(qū)分布的密點麻蜥種群的遺傳結構存在較低的基因交流程度，在這種情況下，應引進優(yōu)良基因，加強基因交流，提高群體的雜合程度，強化對密點麻蜥生存環(huán)境和物種資源的保護。

（致謝：萬麗霞副教授與宋江平副教授對本研究樣本采集做出了巨大貢獻，在此致謝！）