菌酶協(xié)同發(fā)酵對魚廢棄物中氨基酸組成及含量的影響

雷 菲，唐 麗，張治軍，曾建華，陳庭勇，潘孝忠

（海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與土壤研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海南耕地保育科學(xué)觀測實驗站，海南省耕地保育重點實驗室，海南 ?？?571100）

魚廢棄物包括魚頭、魚尾、魚皮、鱗片、骨頭、內(nèi)臟、死亡和損壞的魚等固體廢棄物以及由血液和粘液等組成的液體廢物[1]。據(jù)統(tǒng)計，全球每年產(chǎn)生的魚廢棄物超過2 000 萬t[2]，約20%被深加工成肽、魚油和膠原蛋白等物質(zhì)，其余大部分被傾倒、焚燒或作為廢棄物排入江海[3]，造成了大量的資源浪費和環(huán)境風(fēng)險。然而，魚廢棄物含有豐富的粗蛋白、粗脂肪和礦質(zhì)營養(yǎng)元素，可作為原料加工成肥料或飼料，不僅可避免資源的浪費，而且可以大大提升魚廢棄物的利用價值[4]。

目前，魚廢棄物加工方式主要包括酶解和發(fā)酵。其中，酶解常用的酶有木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶等[5-6]。孫靜[7]采用動物蛋白酶和堿性蛋白酶酶解鰹魚加工廢棄物得到魚蛋白降解液，濃縮后添加耐鎘菌株粉末制成富集鎘的魚蛋白有機液肥；陳杰[8]在羅非魚下腳料中添加復(fù)合酶BJ 制成氨基酸液體肥。而目前常用的發(fā)酵技術(shù)有單菌發(fā)酵技術(shù)和混菌發(fā)酵技術(shù)。研究發(fā)現(xiàn)，采用戊糖片球菌發(fā)酵魚糜，可抑制腐敗菌和致病菌的生長，還能提高魚糜中的低分子肽、非蛋白氮和游離氨基酸的含量[9-10]；吳燕燕等[11]用戊糖片球菌、清酒乳桿菌以及肉葡萄球菌混合發(fā)酵鱖魚，可縮短發(fā)酵時間，改善鱖魚發(fā)酵的品質(zhì)；劉書來等[12]用植物乳桿菌和產(chǎn)朊假絲酵母分段發(fā)酵鯖魚加工廢棄物，進一步提升了鯖魚加工廢棄物的游離氨基酸含量。隨著技術(shù)的發(fā)展，學(xué)者們提出了菌酶協(xié)同發(fā)酵的方式。該方式可將發(fā)酵與酶解有機結(jié)合，有效縮短發(fā)酵時間，提升發(fā)酵效率[13]。例如：柯玉原[14]用木瓜蛋白酶和產(chǎn)朊假絲酵母聯(lián)合發(fā)酵鯖魚加工廢棄物，發(fā)酵產(chǎn)物中的氨基態(tài)氮含量較不加酶提升了19.51%。

為提高魚廢棄物發(fā)酵產(chǎn)物中游離氨基酸的含量，研究以鯖魚廢棄物為原料，以團隊前期研究篩選得到的最佳菌種（戊糖片球菌）為第一階段發(fā)酵菌種，將酵母菌和產(chǎn)朊假絲酵母分別與木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶聯(lián)合進行第二階段發(fā)酵，通過比較分析發(fā)酵產(chǎn)物中游離氨基酸的變化，篩選出最佳的發(fā)酵方式，為魚廢棄物發(fā)酵提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用鯖魚廢棄物購于海南省文昌市；戊糖片球菌購于威明海思（山東）生物工程有限公司，菌活力≥1.0×1010CFU/g；產(chǎn)朊假絲酵母菌購于陜西柏科生物科技有限公司，菌活力≥2.0×1010CFU/g；酵母菌購于陜西柏科生物科技有限公司，菌活力≥2.0×1010CFU/g；木瓜蛋白酶購于陜西柏科生物科技有限公司，酶活力1.0×106U/g；風(fēng)味蛋白酶購于陜西柏科生物科技有限公司，酶活力1.0×106U/g。葡萄糖購于廣東光華科技股份有限公司，分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設(shè)計 試驗設(shè)7 個發(fā)酵處理，分別為：CK，只添加戊糖片球菌進行單菌發(fā)酵；FJ，添加戊糖片球菌、酵母菌進行分段發(fā)酵；FJM：添加戊糖片球菌、酵母菌和木瓜蛋白酶進行菌酶協(xié)同分段發(fā)酵；FJF，添加戊糖片球菌、酵母菌和風(fēng)味蛋白酶進行菌酶協(xié)同分段發(fā)酵；FC，添加戊糖片球菌、產(chǎn)朊假絲酵母菌進行分段發(fā)酵；FCM，添加戊糖片球菌、產(chǎn)朊假絲酵母菌和木瓜蛋白酶進行菌酶協(xié)同分段發(fā)酵；FCF，添加戊糖片球菌、產(chǎn)朊假絲酵母菌和風(fēng)味蛋白酶進行菌酶協(xié)同分段發(fā)酵。每處理重復(fù)4 次。

1.2.2 發(fā)酵工藝 將魚廢棄物洗凈切碎后用打漿機碎成魚糜狀，將30 g 魚糜和10 mL 去離子水加入三角瓶中，75℃巴氏滅菌20 min，制成發(fā)酵基質(zhì)。發(fā)酵分為2 個階段，第一階段為無氧發(fā)酵，在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入戊糖片球菌0.4 g 和高溫滅菌的200 g/L葡萄糖溶液10 mL，在恒溫搖床30℃無氧發(fā)酵36 h；第二個階段為有氧發(fā)酵，加入酵母菌0.4 g 或者產(chǎn)朊假絲酵母0.4 g，木瓜蛋白酶0.03 g 或者風(fēng)味蛋白酶0.03 g，在恒溫搖床30℃有氧發(fā)酵66 h。發(fā)酵結(jié)束后取出樣品，置于-20℃冰箱冷藏備用。

1.2.3 測定項目及方法 試驗中游離型氨基酸種類和含量采用超高效液相色譜和高分辨質(zhì)譜法測定。（1）樣品檢測前處理。將10 mL 樣本稀釋80 倍，吸取100 mL 到離心管中，加入2 倍體積乙腈，渦旋混勻，-20℃靜置30 min；12 000 r/min 離心10 min，取上清；加入等體積的0.2 mol/L 鹽酸，渦旋混勻，室溫條件下提取1 h；12 000 r/min 離心10 min，取上清；取10 μL 樣品到瓶中，加入70 μL AccQ·Tag Ultra Borate 緩沖液和20 μL AccQ·Tag 試劑，再將反應(yīng)混合物在55℃加熱10 min，冷卻后上機檢測。（2）色譜條件。色譜柱為Waters BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相A 為超純水（含0.1%甲酸），流動相B 為乙腈（含0.1%甲酸），進行梯度洗脫（0 min 乙腈5%，5.5 min 乙腈10%，7.5 min 乙腈25%，8 min 乙腈60%，8.5 min 乙腈5%，13 min 乙腈5%）；流速0.5 mL/min；柱溫55℃；進樣量1 μL。（3）質(zhì)譜分析。色譜分離后采用美國Thermo 公司的Q Exactive 高分辨質(zhì)譜檢測系統(tǒng)進行質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)采集，利用Trace Finder 軟件處理質(zhì)譜數(shù)據(jù)，以外標法定量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft office Excel 2007 軟件對原始數(shù)據(jù)進行整理計算，采用SPSS 27.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用Origin 2021 和Microsoft office Excel 2007 軟件繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵方式對魚廢棄物中游離氨基酸種類及含量的影響

由表1 可知，從各處理發(fā)酵產(chǎn)物中均檢測出21 種游離氨基酸， 其中谷氨酸族6 種，天冬氨酸族6 種，丙酮酸族3 種，絲氨酸族2 種，組氨酸族1 種，芳香族3 種。魚廢棄物經(jīng)過不同酶、菌劑發(fā)酵后，各組的游離氨基酸含量存在一定的差異。與CK 相比，F(xiàn)C 的組氨酸、4-羥基-L-脯氨酸和天冬氨酸含量顯著上升，分別增加了14.60%、50.81%和237.21%；FJ 的天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、蘇氨酸和丙氨酸含量均顯著上升，分別增加了8 051.65%、2 016.39%、2 196.82%、38.86%、280.71%、99.36%、2 391.08%和52.90%；FCF 的甘氨酸、天冬氨酸和丙氨酸也顯著上升，分別增加了32.45%、321.94%和53.18%；FCM 有8 種氨基酸較CK 顯著上升，增加范圍為19.66%～407.70%，其中天冬氨酸的上升幅度最大；FJF 有15 種氨基酸較CK 顯著上升，增加范圍為19.77%～9 843.60%，其中天冬酰胺的上升幅度最大；FJM 有16 種氨基酸較CK 顯著上升，增加范圍為18.79%～8 950.21%，天冬酰胺的上升幅度最大。

表1 不同發(fā)酵方式魚廢棄物中游離氨基酸的種類及含量 （μg/mL）

2.2 不同發(fā)酵方式對魚廢棄物中游離氨基酸總量和相對含量的影響

由圖1 可知，與CK 相比，其他處理發(fā)酵產(chǎn)物中的游離氨基酸總量均顯著增加，幅度為12.84%～62.50%，其中FJM 的游離氨基酸總量最高，為23 451.59 μg/mL；其次為FJF，游離氨基酸總量為20 673.52 μg/mL；第三為FCM，游離氨基酸總量為18 990.34 μg/mL。不同發(fā)酵方式對魚廢棄物發(fā)酵產(chǎn)物中游離氨基酸的相對含量也有一定影響，由圖2可知，CK、FC、FJ 和FCF 中游離氨基酸相對含量最高為組氨酸，F(xiàn)CM、FJF 和FJM 中游離氨基酸相對含量最高為賴氨酸，組氨酸和賴氨酸占各組總氨基酸的比例為24.37%～32.62%。與CK 相比，F(xiàn)C 和FCF 的丙氨酸相對含量增加幅度最大，分別為1.52%和2.67%；FJ、FJF 和FJM 的谷氨酰胺相對含量增加幅度最大，分別為4.57%、4.73%和3.51%；FCM的賴氨酸相對含量增加幅度最高，為3.97%。

圖1 不同發(fā)酵方式的魚廢棄物游離氨基酸總量

圖2 不同發(fā)酵方式的魚廢棄物游離氨基酸相對含量

2.3 樣品游離氨基酸的主成分分析

利用SPSS 27.0 軟件先對數(shù)據(jù)進行標準化處理，再進行主成分分析，得到表2 和表3。由表2 和表3可知，前4 個主成分的初始特征值均大于1，累積貢獻率為94.05%，因此選擇前4 個主成分進行后續(xù)分析。第一主成分的方差貢獻率為51.81%，主要影響因子為甘氨酸、谷氨酸、蛋氨酸、纈氨酸和異亮氨酸（載荷系數(shù)≥0.92）；第二主成分的方差貢獻率為23.18%，主要影響因子為組氨酸、 -氨基丁酸和脯氨酸（載荷系數(shù)≥0.72）；第三主成分的方差貢獻率為13.39%，主要影響因子為苯丙氨酸和色氨酸（載荷系數(shù)≥0.83）；第四主成分的方差貢獻率為5.66%，主要影響因子為組氨酸和4-羥基-L-脯氨酸（載荷系數(shù)≥0.48）。

表2 主成分的特征值及方差貢獻率

表3 主成分特征向量及載荷分析

以每個主成分對應(yīng)的方差貢獻率與4 個成分累計貢獻率的比值為權(quán)重系數(shù)，建立魚廢棄物發(fā)酵液游離氨基酸分類評價模型F= 0.55F1+0.25F2+0.14F3+0.06F4，計算各處理魚廢棄物發(fā)酵液的綜合得分，以反應(yīng)各樣本經(jīng)不同酶和菌發(fā)酵對樣品產(chǎn)生游離氨基酸的貢獻。由表4 所示，CK 的綜合得分為-4.57，F(xiàn)C、FJ、FCF、FCM、FJF 和FJM 的綜合得分均高于CK，說明經(jīng)過不同酶和菌發(fā)酵處理后，魚廢棄物的游離氨基酸含量均得到了提升。FJM 的綜合得分最高，為5.36，說明添加戊糖片球菌、酵母菌和風(fēng)味蛋白酶進行菌酶協(xié)同分段發(fā)酵對魚廢棄物中游離氨基酸的形成最有利。

表4 不同發(fā)酵方式樣品綜合得分及排序

2.4 聚類分析

為了進一步分析不同發(fā)酵方式對魚廢棄物發(fā)酵產(chǎn)物中氨基酸含量的影響，利用SPSS 27.0 軟件對數(shù)據(jù)進行了聚類分析，結(jié)果如圖3 所示。當歐式距離大于5、小于10 時，所有樣品可聚為4 類，第一類為CK、FC 和FCF；第二類為FCM；第三類為FJ、FJF；第四類為FJM，說明同一類樣品中的氨基酸含量最為相似。當歐式距離大于15、小于20 時，所有樣品可聚為2 大類，其中CK、FC、FCF 和FCM歸為第一大類，F(xiàn)J、FJF 和FJM 歸為第二大類，說明同一大類樣品中的氨基酸含量具有一定的相似性。當歐式距離為25 左右時，所有樣品才歸為一類，說明第一大類和第二大類樣品的氨基酸含量相似度較低。由此可知，與CK（戊糖片球菌單菌發(fā)酵）相比，分段發(fā)酵以及在分段發(fā)酵基礎(chǔ)上增加酶進行菌酶協(xié)同發(fā)酵對魚廢棄物發(fā)酵產(chǎn)物中氨基酸含量都產(chǎn)生了一定的影響，其中2 次發(fā)酵菌種的選擇對氨基酸含量影響較大，這與主成分分析的結(jié)果基本一致。

圖3 不同發(fā)酵方式的魚廢棄物聚類分析樹狀圖

3 小結(jié)與討論

試驗結(jié)果表明，采用分段發(fā)酵和菌酶協(xié)同發(fā)酵均能顯著提高魚廢棄物發(fā)酵產(chǎn)物中的游離氨基酸含量， 與CK 比，F(xiàn)C、FJ、FCF、FCM、FJF 和FJM處理的發(fā)酵產(chǎn)物中有3～16 種氨基酸含量顯著上升，總氨基酸含量增加了12.84%～62.50%，其中FJM 的總氨基酸含量最高。通過主成分分析和聚類分析發(fā)現(xiàn)，添加戊糖片球菌、酵母菌和風(fēng)味蛋白酶進行菌酶協(xié)同分段發(fā)酵對魚廢棄物中游離氨基酸的形成最為有利。

采用微生物分段發(fā)酵能提高營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化及次生代謝產(chǎn)物積累量[12,15-16]。劉書來等[12]用植物乳桿菌和產(chǎn)朊假絲酵母進行分段發(fā)酵，第二階段發(fā)酵產(chǎn)物中氨基態(tài)氮含量較第一階段提高了43.33%。試驗結(jié)果表明，與戊糖片球菌單菌發(fā)酵相比，戊糖片球菌與產(chǎn)朊假絲酵母分段發(fā)酵產(chǎn)物中游離氨基酸總量增加了12.84%，戊糖片球菌與酵母菌分段發(fā)酵產(chǎn)物中游離氨基酸總量增加了30.05%。不同酵母產(chǎn)蛋白酶的能力不同，對蛋白分解的能力也不同，有研究發(fā)現(xiàn)釀酒酵母對氨基酸廢液的同化效果高于產(chǎn)朊假絲酵母[17-18]。試驗結(jié)果顯示，戊糖片球菌與酵母菌分段發(fā)酵產(chǎn)物中的天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、谷氨酸和蘇氨酸含量均較戊糖片球菌與產(chǎn)朊假絲酵母分段發(fā)酵顯著上升，游離氨基酸總量增加了15.25%。

菌酶協(xié)同可以共同促進底物酵解，提高蛋白消化率[17]。史路路等[19]用淀粉酶、糖化酶和酵母菌協(xié)同發(fā)酵玉米蛋白粉，發(fā)酵后總氨基酸含量增加了18.88%。筆者在分段發(fā)酵的基礎(chǔ)上，分別添加了風(fēng)味蛋白酶和木瓜蛋白酶進行協(xié)同發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)游離氨基酸總量均進一步得到了提升。魚廢棄物中的蛋白質(zhì)在蛋白酶的作用下可酶解成氨基酸、小分子肽等物質(zhì)，但不同蛋白酶的酶解效果不同。關(guān)平彥等[20]發(fā)現(xiàn)風(fēng)味蛋白酶酶解金槍魚下腳料的效果優(yōu)于胰蛋白酶和中性蛋白酶。該試驗中，與FC 處理相比，F(xiàn)CF 和FCM 處理發(fā)酵產(chǎn)物中的游離氨基酸總量分別增加了2.23%和16.61%；與FJ 處理相比，F(xiàn)JF 和FJM 處理發(fā)酵產(chǎn)物中的游離氨基酸總量分別增加了10.15%和24.95%，說明此試驗中木瓜蛋白酶的酶解效果優(yōu)于風(fēng)味蛋白酶。