煙草野火病葉際微生物群落結(jié)構(gòu)與多樣性

摘 要：" 葉際微生物種群穩(wěn)定與煙株健康密切相關(guān)。為揭示感染野火病煙株葉際微生態(tài)特征，該文采用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)不同發(fā)病程度煙株葉片的病斑和健康組織進(jìn)行微生物群落結(jié)構(gòu)與多樣性分析。結(jié)果表明：（1）病斑組織與健康組織優(yōu)勢(shì)菌為變形菌門（Proteobacteria）和子囊菌門（Ascomycota），并且其在病斑組織的相對(duì)豐度顯著高于健康組織；優(yōu)勢(shì)屬為假單胞菌屬（Pseudomonas）、泛菌屬（Pantoea）、鏈格孢屬（Alternaria）、小不整球殼屬（Plectosphaerella）和錐蓋傘屬（Conocybe），僅假單胞菌屬在病斑組織的相對(duì)豐度顯著高于健康組織。（2）病斑組織細(xì)菌群落多樣性和豐富度高于健康組織，并且隨病害程度的增加，多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)分別呈先減后增和先增后減的趨勢(shì)；病斑組織真菌群落豐富度和多樣性指數(shù)隨病害程度的增加先增后減，輕度和中度病葉病斑組織真菌群落多樣性指數(shù)和豐富度高于健康組織，但重度病葉病斑組織真菌群落多樣性指數(shù)和豐富度低于健康組織。（3）病斑和健康組織細(xì)菌的基因功能信息及相對(duì)豐度基本類似，主要為代謝、遺傳信息處理和環(huán)境信息處理3類；真菌的優(yōu)勢(shì)功能類群為植物病原菌、動(dòng)物病原菌-內(nèi)生真菌-植物病原菌-木質(zhì)腐生真菌、未定義腐生真菌、木質(zhì)腐生真菌和植物病原菌-木質(zhì)腐生真菌。該研究結(jié)果為認(rèn)識(shí)煙草野火病演變規(guī)律及葉際微生物群落特征提供了科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 煙草野火病， 高通量測(cè)序， 病葉， 群落結(jié)構(gòu)， 多樣性指數(shù)， 豐富度指數(shù)

中圖分類號(hào)：" Q948.12

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：" A

文章編號(hào)：" 1000-3142（2024）10-1894-11

收稿日期：" 2024-03-24

接受日期：" 2024-05-27

基金項(xiàng)目：" 中國(guó)煙草總公司科技項(xiàng)目［110202101048（LS-08），110202001035（LS-04）］； 國(guó)家自然科學(xué)基金（32160522，31960550）； 貴州省科技基金（黔科合基礎(chǔ)-ZK ［2021］重點(diǎn)036）； 貴州省“百層次”創(chuàng)新型人才（黔科合平臺(tái)人才-GCC ［2022］028-1，黔科合平臺(tái)人才-GCC ［2023］108）； 貴州省科技創(chuàng)新人才團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（黔科合平臺(tái)人才-CXTD ［2023］021）； 貴州省應(yīng)用技術(shù)研究與開發(fā)資金后補(bǔ)助項(xiàng)目； 中國(guó)煙草總公司貴州省公司科技項(xiàng)目（2024XM06）。

第一作者： 郭濤（1998—），碩士研究生，研究方向?yàn)樯飳W(xué)，（E-mail）2634150274@qq.com。

*通信作者：" 余知和，博士，教授，主要從事真菌生物學(xué)及植物病害研究，（E-mail）zhiheyu@hotmail.com；王豐，博士，研究員，主要從事煙草栽培與微生物學(xué)研究，（E-mail）584228992@qq.com。

Microbial community structure and diversity of leaf

phyllosphere in tobacco plants infected with wildfire disease

GUO Tao1， 2， WANG Hancheng2， YU Zhihe1*， CAI Liuti2，

WANG Feng2*， CHEN Xingjiang2

（ 1. College of Life Sciences， Yangtze University， Jingzhou 434025， Hubei， China; 2. Guizhou Academy of Tobacco Sciences， Guiyang 550081， China ）

Abstract：" The stability of phyllosphere microbial community is closely related to plant health. In order to understand the microecological characteristics of tobacco leaves infected with wildfire disease， community structure and diversity of phyllosphere microbiome in diseased spots and healthy tissues of tobacco leaves with different degrees of disease were analyzed using high-throughput sequencing technology in this paper. The results were as follows： （1） The dominant microorganisms in diseased and healthy tissues were Proteobacteria and Ascomycota， and their relative abundance in diseased tissues was significantly higher than that in healthy tissues. The dominant genera were Pseudomonas， Pantoea， Alternaria， Plectosphaerella and Conocybe， and only the relative abundance of Pseudomonas in diseased tissues was significantly higher than that in healthy tissues. （2） The diversity and richness of bacterial communities in diseased spots were higher than those in healthy tissues， and the diversity index showed a trend of decreasing and then increasing with the increase of the disease degree， and the richness index showed a trend of increasing and then decreasing. The richness and diversity index of fungal communities in diseased spots showed a trend of increasing and then decreasing with the increase of the disease degree， and the diversity index and richness of fungal communities in diseased spot tissues of mildly and moderately diseased leaves were higher than those in healthy tissues， but the diversity index and richness of fungal communities in heavily diseased tissues were lower than those in healthy tissues. （3） Gene functional information and relative abundance of bacteria in diseased spots and healthy tissues were generally similar， primarily were metabolism， genetic information processing and environmental information processing. The dominant functional taxa of fungus were plant pathogen， animal pathogen-endophyte-plant pathogen-wood saprotroph， undefined saprotroph， wood saprotroph and plant pathogen-wood saprotroph. The results provide a reference for the understanding of evolutionary pattern of tobacco wildfire disease and characterization of the phyllosphere microbial community.

Key words： tobacco wildfire disease， high-throughput sequencing， diseased leaf， community structure， diversity index， richness index

煙草是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，在山地現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展實(shí)踐中具有重大作用。近年來(lái)，由丁香假單胞菌煙草致病變種（Pseudomonas syringae pv. tabaci）引起的野火病（tobacco wildfire）已演變成煙草種植的主要細(xì)菌性葉斑類病害，常與角斑病、赤星病、棒孢霉葉斑病等混合發(fā)生，造成煙葉生產(chǎn)的嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失（張廣民等，2002；陳燾等，2018）。

植物病害發(fā)生在很大程度上與植物微生態(tài)環(huán)境失衡密不可分，葉際微生物是葉際微生態(tài)環(huán)境中的重要組成成分。研究表明，葉際微生物群落結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定程度與植物葉片健康具有較強(qiáng)的相關(guān)性（Lindow amp; Brandl， 2003; Shakir et al.， 2021）。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展與成熟，越來(lái)越多的學(xué)者應(yīng)用該技術(shù)研究植物病害與微生物群落間的關(guān)系（Li et al.， 2022）。煙草作為以收獲葉片為主的重要經(jīng)濟(jì)作物，其真菌性葉部病害發(fā)生與葉際微生物群落間的關(guān)系研究已有諸多報(bào)道。例如，黃宇等（2020）對(duì)煙草白粉病研究表明，健康煙葉（健葉）葉際真菌群落豐富度及多樣性高于病葉，病葉和健葉的葉際優(yōu)勢(shì)真菌均為高氏白粉菌屬（Golovinomyces）、曲霉屬（Aspergillus）和鏈格孢屬（Alternaria）且病斑組織的豐度高于健康組織；煙草赤星病葉際微生物群落以子囊菌門和變形菌門為主，鏈格孢屬和假單胞菌屬分別為真菌和細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)屬，但健葉真菌和細(xì)菌群落多樣性及豐富度高于病葉（劉亭亭等，2021；Dai et al.， 2022）；Sun等（2023）報(bào)道了感染靶斑病的煙株葉片病原菌的豐度隨病級(jí)增加而顯著上升，葉際真菌群落多樣性和豐富度均低于健葉，細(xì)菌群落多樣性高于健葉而豐富度低于健葉。由此可見，由真菌引起的煙草葉部病害其葉際微生物群落的變化與發(fā)病程度存在密切關(guān)聯(lián)。

煙草野火病是一種細(xì)菌性病害，20世紀(jì)40年代末期在我國(guó)云南煙區(qū)零星發(fā)生。隨著煙草栽培面積逐漸擴(kuò)大，野火病常與其他煙草葉部病害混合發(fā)生，病害流行年份造成重大損失。目前，針對(duì)煙草野火病發(fā)生的影響因素研究主要集中于氣候、溫濕度等環(huán)境因子，而對(duì)于葉際微生物的群落結(jié)構(gòu)及多樣性尚缺乏深入的認(rèn)知。程淺（2020）探討了煙草葉際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與野火病發(fā)生的關(guān)系，但缺少真菌群落結(jié)構(gòu)的相關(guān)研究。Si等（2023）研究了野火病對(duì)雪茄煙的影響，表征感染葉片與健葉之間的微生物群和化學(xué)因子差異，但未對(duì)不同病害程度的野火病煙葉做出進(jìn)一步分析。煙草野火病不但在田間為害煙葉，而且在煙葉采收后至烘干前仍可繼續(xù)為害，導(dǎo)致葉片病斑繼續(xù)擴(kuò)大變成枯焦?fàn)疃ズ婵緝r(jià)值。因此，亟須闡明其病害流行程度與葉際微生物群落的動(dòng)態(tài)變化。鑒于此，本研究以不同發(fā)病程度的煙草野火病煙葉為研究對(duì)象，采用高通量測(cè)序技術(shù)，擬探討以下問題：（1）不同程度發(fā)病煙葉病斑組織與健康組織中微生物群落結(jié)構(gòu)與多樣性差異；（2）不同發(fā)病程度病斑組織微生物群落的變化；（3）不同發(fā)病程度煙葉組織微生物的功能變化。旨在為認(rèn)識(shí)煙草野火病的演變規(guī)律提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2019年6月，在種植品種為云煙87的貴州省施秉縣煙葉產(chǎn)區(qū)（107°51′36″—108°28′51″ E、26°49′47″—27°21′15″ N）采集移栽60 d后發(fā)生煙草野火病的煙葉樣品，根據(jù)病斑面積占比分為輕度（5%～10%）、中度（11%～20%）和重度（21%～50%）葉片（圖1），依次記為A、B、C。用無(wú)菌剪刀剪取樣品葉片的病斑組織（b）和健康組織（j），分別混合均勻置于50 mL無(wú)菌離心管中，每個(gè)樣品3管，每管5 g。樣品采集后放入低溫保存箱，并迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，置于-80 ℃冰箱保存、備用。

1.2 基因組DNA提取、PCR擴(kuò)增及高通量測(cè)序

參照Fast DNA SPIN試劑盒（MP Biomedicals）使用說(shuō)明，提取葉際微生物基因組總DNA，經(jīng)超微量分光光度計(jì)NanoDrop 2000（Thermo Fisher Scientific）檢測(cè)質(zhì)量與濃度后，用無(wú)菌水將DNA稀釋至1 ng·μL-1備用。

細(xì)菌16S rRNA基因和真菌轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS1區(qū)分別采用引物515F/806R（Yuan et al.， 2020）和ITS5-1737F/ITS2-2043R（Wu et al.， 2019）進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系及程序參照Apprill等（2005）。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%濃度瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)、GeneJET膠回收產(chǎn)物純化試劑盒（Thermo Fisher Scientific）純化后送至北京諾禾致源科技股份有限公司，利用Ion Plus Fragment Library試劑盒（Thermo Fisher Scientific）構(gòu)建文庫(kù)并在Ion S5TMXL平臺(tái)上進(jìn)行測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)質(zhì)控及群落結(jié)構(gòu)與多樣性分析

下機(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)Cutadapt（https：//cutadapt.readthedocs.io/en/v1.9.1/）軟件剔除、過濾低質(zhì)量序列，以及UCHIME算法去除嵌合體序列，最終得到有效序列（clean reads）。使用UPARSE（http：//www.drive5.com/usearch/）軟件在相似度≥97%的條件下對(duì)clean reads進(jìn)行OTU（operational taxonomic units）聚類，篩選每個(gè)OTU的代表性序列，并基于Mothur算法將OTU代表性序列與Unite（7.2）數(shù)據(jù)庫(kù)和Silva132數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)、注釋物種分類（Edgar amp; Robert， 2013; Urmas et al.， 2013）。利用R語(yǔ)言工具繪制物種群落柱狀圖、主成分分析（principal component analysis， PCA）圖和Venn分析圖等。利用QIIME（https：//docs.qiime2.org）按樣本最小序列數(shù)進(jìn)行樣本序列抽平后，計(jì)算樣品微生物群落α多樣性指數(shù)（Shannon、Simpson、Chao1等）；使用DPS軟件（http：//www.dpsw.cn/download.html）進(jìn)行不同組別物種相對(duì)豐度的差異性分析。采用Tax4Fun程序語(yǔ)言及FUNGuild和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)分析真菌、細(xì)菌群落的功能類群（孫美麗等，2023）。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序深度評(píng)估及數(shù)據(jù)質(zhì)控

稀釋性曲線結(jié)果顯示，葉際細(xì)菌的OTU數(shù)在測(cè)序數(shù)據(jù)量為2 300時(shí)曲線趨于平坦（圖2：A），葉際真菌的OTU數(shù)在測(cè)序數(shù)據(jù)量為40 000時(shí)曲線趨于平坦（圖2：B），表明測(cè)序數(shù)據(jù)已包含所測(cè)樣品中絕大多數(shù)的物種信息，測(cè)序結(jié)果合理。

原始測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控后，平均每組樣品的細(xì)菌和真菌分別獲得80 092條和70 147條高質(zhì)量序列（表1）。細(xì)菌與真菌原始測(cè)序數(shù)據(jù)的GenBank Accession Number分別為PRJNA1025832、PRJNA1025370。

2.2 葉際細(xì)菌與真菌群落結(jié)構(gòu)

2.2.1 門水平葉際群落結(jié)構(gòu) 健康與病斑組織的細(xì)菌群落包括變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes），其中病斑組織變形菌門的相對(duì)豐度高于健康組織（圖3：A）。輕度、中度和重度病葉病斑組織的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門為變形菌門（相對(duì)豐度分別為49.44%、72.39%和61.92%），其次為厚壁菌門（相對(duì)豐度分別為0.01%、1.54%和0.73%）和擬桿菌門（相對(duì)豐度分別為0.06%、0.19%和0.06%）。健康組織優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為變形菌門（Aj、Bj和Cj的相對(duì)豐度分別為2.89%、8.76%和3.15%）。輕度病葉的病斑與健康組織的變形菌門相對(duì)豐度無(wú)顯著性差異，而中度和重度病葉病斑組織的變形菌門相對(duì)豐度顯著高于健康組織；厚壁菌門和擬桿菌門在6組樣品間無(wú)顯著性差異（表2）。

健康和病斑組織的真菌群落主要為子囊菌門（Ascomycota）和擔(dān)子菌門（Basidiomycota）（圖3：B）。其相對(duì)豐度病斑組織高于健康組織，其中重度病葉病斑組織與健康組織間子囊菌門相對(duì)豐度存在顯著性差異。在輕度、中度和重度病葉病斑組織中，子囊菌門的相對(duì)豐度分別為10.25%、25.86%和32.22%，擔(dān)子菌門的相對(duì)豐度分別為4.52%、2.48%和4.35%。健康組織子囊菌門相對(duì)豐度隨病害程度的增加而減少（Aj、Bj和Cj的相對(duì)豐度分別為6.31%、5.14%和0.47%），而擔(dān)子菌門相對(duì)豐度隨病害程度的增加而增加（分別為0.19%、0.30%和0.47%）。

2.2.2 屬水平葉際群落結(jié)構(gòu) 由圖4：A可知，健康與病斑組織的細(xì)菌群落在屬水平上為假單胞菌屬（Pseudomonas）和泛菌屬（Pantoea）。病斑組織Ab、Bb和Cb假單胞菌屬的相對(duì)豐度（分別為39.47%、59.83%和46.05%）與健康組織Aj、Bj和Cj假單胞菌屬的相對(duì)豐度（分別為0.57%、5.95%和1.10%）存在顯著差異。病斑組織泛菌屬的相對(duì)豐度隨病害程度增加而逐級(jí)上升，與健康組織無(wú)顯著性差異。

煙葉健康和病斑組織的真菌群落優(yōu)勢(shì)屬包括鏈格孢屬（Alternaria）、小不整球殼屬（Plectosphaerella）和錐蓋傘屬（Conocybe），其病斑組織的相對(duì)豐度高于健康組織，但無(wú)顯著性差異（圖4：B），而莖點(diǎn)霉屬（Phoma）在健康組織的相對(duì)豐度高于病斑組織，并且在輕度病葉中二者存在顯著性差異。

2.2.3 OTU屬水平葉際群落結(jié)構(gòu) 由圖5可知，病斑與健康組織樣品共有的細(xì)菌和真菌OTU數(shù)目分別為9和190，其中共有的細(xì)菌OTU分別屬于假單胞菌屬、泛菌屬、立克次氏體目Rickettsiales等，共有的真菌OTU分別屬于鏈格孢屬、錐蓋傘屬、小不整球殼屬、莖點(diǎn)霉屬等。病葉Bb和健葉Bj樣品細(xì)菌群落獨(dú)有的OTU數(shù)目較其他煙葉樣品高（圖5：A）；病葉Bb樣品真菌群落獨(dú)有的OTU數(shù)目較其他煙葉組織高（圖5：B）。

2.3 葉際微生物群落α多樣性

由表3可知，煙葉健康與病斑組織的覆蓋度指數(shù)均大于0.997，表明測(cè)序結(jié)果包含絕大多數(shù)微生物群落。供試6組樣品細(xì)菌群落的Simpson指數(shù)、ACE指數(shù)和覆蓋度指數(shù)均無(wú)顯著性差異，僅輕度病斑組織的Shannon指數(shù)與健康組織存在顯著性差異，中度病斑組織的Chao1指數(shù)顯著高于輕度和重度病葉健康組織。病斑組織細(xì)菌群落物種多樣性與豐富度高于健康組織，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)隨煙葉病害程度的增加呈先減后增的變化趨勢(shì)，而Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)則呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)；健康組織的細(xì)菌群落多樣性和豐富度指數(shù)隨病害程度的增加呈先增后減的趨勢(shì)。

輕度和中度病斑組織真菌群落多樣性和豐富度均高于健康組織，但重度病斑組織真菌群落多樣性和豐富度低于其健康組織。Bb樣品的Shannon指數(shù)與Simpson指數(shù)顯著高于Cb、Aj、Bj樣品；6組樣品組織真菌群落的Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)和覆蓋度指數(shù)均不存在顯著性差異。病斑組織的真菌群落多樣性和豐富度指數(shù)隨病害程度的增加呈先增后減的趨勢(shì)；健康組織的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)隨病害程度的增加而增加，Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)則隨發(fā)病程度的增加而降低。

2.4 葉際真菌與細(xì)菌群落功能預(yù)測(cè)

基于KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)葉際細(xì)菌群落PICRUSt功能預(yù)測(cè)結(jié)果表明，在第一級(jí)功能層水平上，健康和病斑組織葉際細(xì)菌的主要功能為新陳代謝、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、人類疾病以及有機(jī)系統(tǒng)6類生物代謝通路（圖6：A）。健康和病斑組織的葉際細(xì)菌基因功能大體相同且相對(duì)豐度無(wú)顯著性差異。

基于FUNGuild功能預(yù)測(cè)，健康與病斑組織葉際真菌生態(tài)功能類群相似。健康和病斑組織葉際真菌優(yōu)勢(shì)類群包括植物病原菌、動(dòng)物病原菌-內(nèi)生真菌-植物病原菌-木質(zhì)腐生真菌、未定義腐生真菌、木質(zhì)腐生真菌和植物病原菌-木質(zhì)腐生真菌。病斑組織的植物病原菌類群相對(duì)豐度高于健康組織，中度病葉病斑組織Bb相對(duì)豐度最高（6.23%），其次為Ab（5.27%）、Cb（2.50%），而健康組織中Bj組相對(duì)豐度最高（0.91%）。動(dòng)物病原菌-內(nèi)生真菌-植物病原菌-木質(zhì)腐生真菌類群的相對(duì)豐度在病斑組織Bb（6.51%）遠(yuǎn)高于其他病斑和健康組織。病斑組織的未定義腐生真菌、木質(zhì)腐生真菌類群相對(duì)豐度均高于健康組織，前者在病斑組織Cb中（4.66%）相對(duì)豐度最高，后者在Bb組（1.04%）相對(duì)豐度最高；健康組織的植物病原菌-木質(zhì)腐生真菌類群相對(duì)豐度高于病斑組織，健康組織Aj中（1.84%）相對(duì)豐度最高（圖6：B）。

3 討論與結(jié)論

豐富多樣的葉際微生物與宿主植物的健康生長(zhǎng)密切相關(guān)。葉際微生物能夠幫助宿主植物固氮、促進(jìn)其生長(zhǎng)、增強(qiáng)其抗逆和抗病能力，但其存在的病原微生物也可通過侵染葉片組織并在葉際定殖積累導(dǎo)致植物發(fā)?。ˋbdelfattah et al.， 2015；楊寬等，2021）。本研究基于高通量測(cè)序技術(shù)，從微觀層面解析了感染野火病煙葉健康與病斑組織葉際微生物的異同，并揭示了不同發(fā)病程度葉片葉際微生物群落結(jié)構(gòu)與多樣性。

本研究發(fā)現(xiàn)，感野火病煙葉的健康與病斑組織葉際微生物菌群結(jié)構(gòu)在物種相對(duì)豐度上存在較大差異。病斑和健康組織的葉際細(xì)菌優(yōu)勢(shì)門和屬分別為變形菌門和假單胞菌屬及泛菌屬等，皆為煙草葉際常見菌群，與Qin等（2019）對(duì)煙草野火病田間防治、孫美麗等（2023）對(duì)靶斑病煙葉葉際優(yōu)勢(shì)細(xì)菌和劉暢等（2020）對(duì)赤星病煙葉葉際優(yōu)勢(shì)細(xì)菌等研究報(bào)道一致。煙草野火病作為細(xì)菌性病害，常與真菌性病害協(xié)同發(fā)生，煙田中野火病與靶斑病、 赤星病等復(fù)合侵染造成煙株發(fā)病的案例屢見不鮮，因此其優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類群或存在相似之處。假單胞菌屬作為野火病的病原，其相對(duì)豐度在病斑組織顯著高于健康組織，表明病原菌的大量定殖是導(dǎo)致野火病蔓延發(fā)生的主要原因。雖然泛菌屬在病斑和健康組織中的相對(duì)豐度無(wú)顯著性差異，但其豐度隨病害程度的增加而逐級(jí)上升，說(shuō)明泛菌屬與煙草野火病的發(fā)生存在正相關(guān)關(guān)系，可能在病害發(fā)生時(shí)具有潛在促進(jìn)作用。葉際真菌主要分布于鏈格孢屬、小不整球殼屬和錐蓋傘屬等，這與劉亭亭等（2022）、向立剛等（2020）研究結(jié)果類似。鏈格孢屬真菌的存在，表明煙葉后期存在赤星病與野火病混合發(fā)生的可能， 這從目前煙田病害發(fā)生規(guī)律上可見一斑。此外，鏈格孢屬、小不整球殼屬和錐蓋傘屬在病斑組織的富集豐度明顯高于健康組織，表明三者在病害發(fā)生時(shí)可能與病原菌存在協(xié)同促進(jìn)的作用，有助于病害發(fā)生。值得注意的是，莖點(diǎn)霉屬在健康組織的相對(duì)豐度高于病斑組織，并且在輕度病葉中二者存在顯著性差異，表明其在病害抑制中具有潛在作用。針對(duì)葉際微生物中變化顯著的優(yōu)勢(shì)菌群值得進(jìn)一步功能探索與研究。

微生物之間高度復(fù)雜的關(guān)系使得局部某些病原菌或有益菌的相對(duì)豐度變化直至引起整個(gè)群落組成的改變，而植物病害發(fā)生伴隨著病原菌的入侵定殖，常常會(huì)改變微生物環(huán)境和群落結(jié)構(gòu)，對(duì)微生物群落多樣性產(chǎn)生影響（劉宇星等，2022）。Zhang等（2018）發(fā)現(xiàn)南瓜白粉病病原菌Podosphaere的豐度隨病情加重而增加；Sun等（2023）對(duì)不同病害等級(jí)煙草靶斑病煙葉的研究表明，葉際病原菌的相對(duì)豐度隨著煙葉病級(jí)的增加而顯著上升；陳乾麗等（2019）對(duì)不同霉變程度煙葉霉?fàn)€病的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，病原菌Aspergillus在霉變重的煙葉葉片中的相對(duì)豐度較霉變輕的煙葉更高。綜上表明，病原菌豐度及群落特征常與煙葉發(fā)病程度存在一定相關(guān)性。本研究對(duì)選取的3類不同發(fā)病程度的野火病煙葉進(jìn)行微生物群落結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，在輕度、中度和重度病葉病斑組織中假單胞菌屬的相對(duì)豐度均大于39%，但在中度病葉病斑組織中其相對(duì)豐度最高，這與前人研究結(jié)果和預(yù)測(cè)有所不同。此外，煙葉健康與病斑組織的微生物多樣性指數(shù)隨著病害程度的增加呈先增后減或逐級(jí)遞減。造成這種現(xiàn)象可能的原因是在野火病發(fā)病初期，葉片組織完整性被破壞，引起環(huán)境中包括病原菌在內(nèi)的各類微生物涌入遭破壞的組織中大量定植，進(jìn)而造成病斑組織微生物群落多樣性和豐富度短暫增加，但隨著病斑面積擴(kuò)大，葉片有限的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生存空間不斷降低，微生物間的定殖和競(jìng)爭(zhēng)加劇，最終導(dǎo)致病原菌以及其他微生物數(shù)量降低。Huang等（2021）對(duì)不同病級(jí)的亞隔孢殼屬葉斑病煙葉的研究也有類似發(fā)現(xiàn)，發(fā)病煙葉組織雖然在功能預(yù)測(cè)中顯示植物病原菌相對(duì)豐度隨病害增加而成比例上升，但葉際病原菌Didymella的相對(duì)豐度在病害后期反而有下降趨勢(shì)。這恰與本研究假單胞菌屬的相對(duì)豐度在重度病斑組織中表現(xiàn)出降低趨勢(shì)一致。葉際微生物群的結(jié)構(gòu)變化因受到環(huán)境等因素的影響往往難以準(zhǔn)確預(yù)測(cè)，但其趨勢(shì)大體可循。一般而言，病原菌和與其相關(guān)聯(lián)的微生物菌群大量定植于葉片組織造成的葉際微生態(tài)平衡被破壞是導(dǎo)致煙葉病害發(fā)生的微觀機(jī)制之一。由此可知，煙草病害的防治可圍繞抑制破壞病原菌和相關(guān)菌群的定植進(jìn)而達(dá)到生物防控的目的。劉天波等（2021）利用拮抗菌防治煙草野火病得到較好效果，并發(fā)現(xiàn)假單胞菌屬、泛菌屬等煙草葉際微生物所占比例發(fā)生顯著變化，芽孢桿菌屬作為有益菌相比對(duì)照增加3.9倍。

葉際微生物在定植積累過程中常發(fā)揮自身特定的生理功能，與其群落結(jié)構(gòu)及組成密切相關(guān)（高爽等，2016）。本研究中功能預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，健康和病斑組織的細(xì)菌類群基因功能信息及相對(duì)豐度較為趨同，以代謝、遺傳信息處理和環(huán)境信息處理3種功能為主，該結(jié)果與煙草角斑病、靶斑病的葉際細(xì)菌功能預(yù)測(cè)結(jié)果較為一致（吳小軍等，2023；孫美麗等，2023），其原因可能是野火病菌在以上葉際病害中也常被作為優(yōu)勢(shì)類群，因而功能預(yù)測(cè)存在相似之處。本研究發(fā)現(xiàn)，病斑組織細(xì)菌多樣性與豐富度高于健康組織，推測(cè)野火病侵染煙葉后，假單胞菌屬、泛菌屬等菌群在葉際養(yǎng)分的利用上占據(jù)主要地位，在定植過程中獲取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而大量繁殖，進(jìn)一步刺激和開發(fā)其代謝、遺傳和環(huán)境信息處理等功能，進(jìn)而演變?yōu)楦胁熑~葉際優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)在病斑與健康組織葉際真菌群落功能預(yù)測(cè)中，病原菌、內(nèi)生真菌及腐生真菌等占據(jù)主導(dǎo)地位，病斑組織的植物病原菌類群相對(duì)豐度高于健康組織，這與Huang等（2021）報(bào)道一致，進(jìn)一步說(shuō)明了植物病原菌和內(nèi)生真菌、腐生真菌為煙草葉際優(yōu)勢(shì)真菌類群，植物病原菌是導(dǎo)致葉際病害的重要原因。

參考文獻(xiàn)：

ABDELFATTAH A， DESTRI NMG， CACCIOLA SO， et al.， 2015.Metabarcoding analysis of fungal diversity in the phyllosphere and carposphere of olive （Olea europaea）" ［J］. PLoS ONE， 10（7）： e0131069.

APPRILL A， MCNALLY S， PARSONS R， et al.， 2005. Minor revision to V4 region SSU rRNA 806R gene primer greatly increases detection of SAR11 bacterioplankton" ［J］. Aquat Microb Ecol， 75（2）： 129-137.

CHEN QL， LI Z， WANG HC， et al.， 2019. Fungal composition and diversity of tobacco phyllosphere from cured tobacco leaves" ［J］. Acta Microbiol Sin， 59（12）： 2401-2409." ［陳乾麗， 李忠， 汪漢成， 等， 2019. 烤后不同霉變程度煙葉際真菌群落組成與多樣性分析 ［J］. 微生物學(xué)報(bào)， 59（12）： 2401-2409.］

CHENG Q， 2020. Study on the relationship between the diversity of tobacco bacterial community and the occurrence of tobacco wildfire and its regulation effect ［D］. Chongqing： Southwest University： 23-24." ［程淺， 2020. 煙草葉際細(xì)菌群落多樣性與煙草野火病發(fā)生的關(guān)系及調(diào)控效應(yīng)研究 ［D］. 重慶： 西南大學(xué)： 23-24.］

CHEN T， ZHOU W， LI HG， et al.， 2018. Research progress in disease occurrence and integrated control of tobacco wild fire" ［J］. Genomics Appl Biol， 37（1）： 469-476." ［陳燾， 周瑋， 李宏光， 等， 2018. 煙草野火病的發(fā)生及綜合防治研究進(jìn)展 ［J］. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)， 37（1）： 469-476.］

DAI YF， WU XM， WANG HC， et al.， 2022. Spatio-temporal variation in the phyllospheric microbial biodiversity of Alternaria alternata-infected tobacco foliage" ［J］. Front Microbiol， 13： 920109.

EDGAR H， ROBERT C， 2013. UPARSE： highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads" ［J］. Nat Methods， 10（10）： 996-998.

GAO S， LIU XC， DONG Z， et al.， 2016. Advance of phyllosphere microorganisms and their interaction with the outside environment" ［J］. Plant Sci J， 34（4）： 654-661." ［高爽， 劉笑塵， 董錚， 等， 2016. 葉際微生物及其與外界互作的研究進(jìn)展 ［J］. 植物科學(xué)學(xué)報(bào)， 34（4）： 654-661.］

HUANG Y， WANG HC， CAI LT， et al.， 2021. Phyllospheric microbial composition and diversity of the tobacco leaves infected by Didymella segeticola" ［J］. Front Microbiol， 12： 699699.

HUANG Y， WANG HC， CHEN QL， et al.， 2020. Community structure and diversity of fungi in leaves of tobacco plant infected with powdery mildew" ［J］. Guizhou Agric Sci， 48（5）： 54-58." ［黃宇， 汪漢成， 陳乾麗， 等， 2020. 感染白粉病煙株葉片真菌的群落結(jié)構(gòu)與多樣性 ［J］. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)， 48（5）： 54-58.］

LINDOW SE， BRANDL MT， 2003.Microbiology of the phyllosphere" ［J］. Appl Environ Microbiol， 69（4）： 1875-1883.

LI PD， ZHU ZR， ZHANG Y， et al.， 2022. The phyllosphere microbiome shifts toward combating melanose pathogen" ［J］. Microbiome， 10（1）： 56-56.

LIU C， WANG HC， XIE HL， et al.， 2020. Biodiversity analysis of phyllosphere bacterial genus from tobacco leaves infected by brown spot disease" ［J］. Tob Sci Technol， 53（2）： 8-14." ［劉暢， 汪漢成， 謝紅煉， 等， 2020. 感染赤星病煙草葉際細(xì)菌的多樣性分析 ［J］. 煙草科技， 53（2）： 8-14.］

LIU TB， TENG K， ZHOU XP， et al.， 2021. Effects of antagonistic bacteria on tobacco wild fire and responses of phyllosphere microbiota" ［J］. Microbiol Chin， 48（8）： 2643-2652." ［劉天波， 滕凱， 周向平， 等， 2021. 拮抗菌群對(duì)煙草野火病的防治效果及葉際微生物群落多樣性的影響 ［J］. 微生物學(xué)通報(bào)， 48（8）： 2643-2652.］

LIU TT， ZENG YT， WANG HC， et al.， 2021. Metabolic and microbial community structure analysis in the phyllosphere of tobacco leaves with different maturity during brown spot occurring season" ［J］. Chin Tob Sci， 42（6）： 22-29." ［劉亭亭， 曾隕濤， 汪漢成， 等， 2021. 赤星病發(fā)生期不同成熟度煙葉葉際微生物代謝與群落結(jié)構(gòu) ［J］. 中國(guó)煙草科學(xué)， 42（6）： 22-29.］

LIU TT， WANG HC， SUN ML， et al.， 2022. Effects of Bordeaux mixture on the community structure and metabolic function of tobacco phyllosphere microorganisms" ［J］. Chin J Pestic Sci， 24（6）： 1446-1455." ［劉亭亭， 汪漢成， 孫美麗， 等， 2022. 波爾多液對(duì)煙草葉際微生物群落結(jié)構(gòu)與代謝功能的影響 ［J］. 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)， 24（6）： 1446-1455.］

LIU YX， DONG CB， SHAO QY， et al.， 2022. Advances on phyllosphere microorganisms and their association with plant health" ［J］. J Microbiol， 42（2）： 88-98." ［劉宇星， 董醇波， 邵秋雨， 等， 2022. 葉際微生物與植物健康研究進(jìn)展 ［J］. 微生物學(xué)雜志， 42（2）： 88-98.］

QIN C， TAO JM， LIU TB， et al.， 2019. Responses of phyllosphere microbiota and plant health to application of two different biocontrol agents" ［J］. AMB Express， 9（1）： 42.

SHAKIR S， ZAIDI SS， VRIES DTF， et al.， 2021. Plant genetic networks shaping phyllosphere microbial community" ［J］. Trends Genet， 37（4）： 306-316.

SI H， CUI B， LIU F， et al.， 2023. Microbial community and chemical composition of cigar tobacco （Nicotiana tabacum L.） leaves altered by tobacco wildfire disease ［J］. Plant Direct， 7（12）： e551.

SUN ML， SHI CH， HUANG Y， et al.， 2023. Effect of disease severity on the structure and diversity of the phyllosphere microbial community in tobacco" ［J］. Front Microbiol， 13（4）： 1081576.

SUN ML， SHI CH， XIAO BQ， et al.， 2023. Composition and diversity of phyllospheric microbial community in tobacco leaves infected by tobacco target spot disease" ［J］. Tob Sci Technol， 56（4）： 1-9." ［孫美麗， 史彩華， 肖本青， 等， 2023. 煙草靶斑病葉際微生物群落結(jié)構(gòu)與多樣性分析 ［J］. 煙草科技， 56（4）： 1-9.］

URMAS K， NILSSON RH， KESSY A， et al.， 2013. Towards a unified paradigm for sequence-based identification of fungi" ［J］. Mol Ecol， 22（21）： 5271-5277.

WU XJ， WANG HC， SUN ML， et al.， 2023. Composition and diversity of phyllosphere microbial community on tobacco leaves infected with angular leaf spot" ［J］. Tob Sci Technol， 56（10）： 1-10." ［吳小軍， 汪漢成， 孫美麗， 等， 2023. 煙草角斑病葉際微生物群落結(jié)構(gòu)與多樣性分析 ［J］. 煙草科技， 56（10）： 1-10.］

WU YY， GENG JK， XU S， et al.， 2019. Isolation and identification of intestinal fungi in Spodoptera frugiperda larvae of Chongqing area" ［J］. J Southwest Univ （Nat Sci Ed）， 41（9）： 1-8.

XIANG LG， WANG HC， ZHENG P， et al.， 2020. Analysis of endophytic fungi and phyllosphere fungi of flue cured tobacco leaves with brown spot disease" ［J］. Acta Tab Sin， 26（4）： 93-100.nbsp; ［向立剛， 汪漢成， 鄭蘋， 等， 2020. 赤星病烤后煙葉內(nèi)生及葉際真菌分析 ［J］. 中國(guó)煙草學(xué)報(bào)， 26（4）： 93-100.］

YANG K， WANG HL， YE KH， et al.， 2021. Advances in research on phyllosphere microorganisms and their interaction with plants" ［J］. J Yunnan Agric Univ （Nat Sci）， 36（1）： 155-164." ［楊寬， 王慧玲， 葉坤浩， 等， 2021. 葉際微生物及與植物互作的研究進(jìn)展 ［J］. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)）， 36（1）： 155-164.］

YUAN Z， ZHANG CY， PENG XX， et al.， 2020. Intestinal microbiota characteristics of mice treated with Folium senna decoction gavage combined with restraint and tail pinch stress" ［J］. 3 Biotech， 10（4）： 1-11.

ZHANG GM， LU JH， KAN GF， et al.， 2002. Recent development in the study of tobacco wildfire disease" ［J］. Acta Tabac Sin， 8（2）： 34-37." ［張廣民， 呂軍鴻， 闞光鋒， 等， 2002. 煙草野火病研究概況 ［J］. 中國(guó)煙草學(xué)報(bào)， 8（2）： 34-37.］

ZHANG Z， LUO LY， TAN XQ， et al.， 2018. Pumpkin powdery mildew disease severity influences the fungal diversity of the phyllosphere" ［J］. PeerJ， 6（2）： e4559.

（責(zé)任編輯 李 莉 王登惠）