乳腺癌休眠機(jī)制研究進(jìn)展

馬瀾婧，張百紅

0 引言

乳腺癌（breast cancer, BC）是全世界女性死亡的首要元兇，腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移則是乳腺癌相關(guān)死亡的主要原因。微小殘留病灶（minimal residual disease, MRD）的存在是腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的生物學(xué)基礎(chǔ)，乳腺癌患者在初診時(shí)即可能攜帶微轉(zhuǎn)移[1]。全身輔助治療的目的就在于消除播散性腫瘤細(xì)胞（disseminated tumor cells, DTC）以降低復(fù)發(fā)率，然而仍有部分DTC能夠逃避初治治療，作為最小MRD持續(xù)存在，并在原發(fā)腫瘤切除后數(shù)年甚至數(shù)十年保持靜止，這種特定的生物學(xué)行為稱為腫瘤休眠（tumor dormancy），這些細(xì)胞被稱為休眠癌細(xì)胞（dormant cancer cell, DCC）[2-3]。

腫瘤休眠的概念是1954年由Hadfield首次提出。DCC的特點(diǎn)是有絲分裂停滯在G0/G1期和低代謝，通過獲得突變和表觀遺傳修飾來適應(yīng)新的微環(huán)境，使其對(duì)抗腫瘤治療和免疫監(jiān)測具有抵抗力實(shí)現(xiàn)靜止?fàn)顟B(tài)下長期存活[4]。不幸的是，腫瘤休眠是一個(gè)可逆的增殖停滯狀態(tài)。在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境條件下DCC能夠“蘇醒”，恢復(fù)其增殖，最終導(dǎo)致遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和癌癥相關(guān)死亡。較為公認(rèn)的DCC生命周期包括休眠——復(fù)蘇——出芽——種植[5]。DCC常定植的組織器官包括骨髓、肝臟、肺臟、腦、骨骼肌等[6]。但是對(duì)于DCC如何逃避治療、維持表型、重新喚醒等仍然知之甚少，對(duì)休眠機(jī)制的研究具有重大意義。已報(bào)道的控制DCC命運(yùn)的核心機(jī)制涉及經(jīng)典信號(hào)通路、免疫反應(yīng)、表觀遺傳修飾、代謝重編程、非編碼RNA以及腫瘤細(xì)胞和微環(huán)境之間的相互作用等。本文重點(diǎn)歸納以乳腺癌模型為基礎(chǔ)的有關(guān)休眠內(nèi)在分子機(jī)制研究的最新進(jìn)展。

1 自噬

自噬是一種以細(xì)胞成分和細(xì)胞器的溶酶體降解為特征的細(xì)胞分解代謝過程，是對(duì)各種細(xì)胞應(yīng)激的適應(yīng)性反應(yīng)，包括DNA損傷、缺氧、營養(yǎng)和營養(yǎng)因子信號(hào)耗竭以及化學(xué)損傷等。自噬被證明是休眠的乳腺癌細(xì)胞（breast cancer cell, BCC）生存的關(guān)鍵策略之一。

1.1 自噬激活保護(hù)DCC

最早Cufí發(fā)現(xiàn)自噬可以正向調(diào)節(jié)乳腺癌干細(xì)胞（breast cancer stem-like cell, BCSC）表型[7]。而普遍認(rèn)為具有激活休眠和引發(fā)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移性病變能力的DTC正是BCSC[8]。Ovadia團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了一種仿生3D合成基質(zhì)休眠模型，觀察到根據(jù)基質(zhì)密度的不同，ER陽性BCC呈現(xiàn)出休眠或持續(xù)生長狀態(tài)，三陰性BCC從未進(jìn)入休眠狀態(tài)，并且該模型中自噬相關(guān)基因顯著差異表達(dá)[9]。Vera-Ramirez團(tuán)隊(duì)亦構(gòu)建了一個(gè)3D休眠細(xì)胞培養(yǎng)模型，發(fā)現(xiàn)抑制自噬可使休眠的BCC存活率和轉(zhuǎn)移負(fù)擔(dān)顯著降低，其潛在機(jī)制可能是抑制自噬后活性氧等有害物質(zhì)累積并損害其自身線粒體進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[10]。有研究證明自噬激活可以抑制免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷，通過免疫逃逸促進(jìn)DTC的生長[11]。乳腺癌復(fù)發(fā)通常發(fā)生在比正常乳腺或原發(fā)性乳腺腫瘤更“軟”的組織中，如骨髓、腦和肺。研究發(fā)現(xiàn)在更“軟”的微環(huán)境中，由于自噬增加和雌激素受體α表達(dá)減少，乳腺癌細(xì)胞對(duì)他莫昔芬更具抵抗力，抑制自噬可增強(qiáng)BCC對(duì)他莫昔芬的反應(yīng)，也就是說，組織力學(xué)通過影響自噬調(diào)節(jié)乳腺癌的預(yù)后[12]。最新研究發(fā)現(xiàn)AIH1在乳腺癌的體外和小鼠異種移植物模型中亦能觸發(fā)自噬，并促進(jìn)DCC的存活[13]。綜上自噬激活對(duì)DCC起保護(hù)作用。

1.2 抑制自噬促進(jìn)DCC蘇醒

關(guān)于腫瘤休眠的一個(gè)關(guān)鍵但尚未充分認(rèn)知的問題是，哪些事件可以誘導(dǎo)DCC的蘇醒？Aqbi等研究發(fā)現(xiàn)，在接受阿霉素治療的HER2過表達(dá)的小鼠乳腺癌模型中，永久抑制自噬可導(dǎo)致DCC早期脫離休眠和復(fù)發(fā)[14]。2019年的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶3（Pfkfb3）的表達(dá)與自噬呈反比，自噬降低了Pfkbb3的表達(dá)并引發(fā)細(xì)胞休眠；抑制自噬可復(fù)原休眠的BCC中Pfkfb3的異常表達(dá)，并重新激活細(xì)胞增殖生長[15]。目前許多針對(duì)自噬的治療正在進(jìn)行，以最大限度地減少休眠BCC數(shù)量[16]。

2 免疫反應(yīng)

2.1 免疫逃逸

免疫逃逸是假設(shè)癌癥細(xì)胞通過某些“隱身或抵抗”機(jī)制躲避免疫細(xì)胞的破壞[11]。抑制免疫反應(yīng)和免疫逃逸是DCC的特征之一[17]。例如休眠的骨髓瘤細(xì)胞被錯(cuò)誤地識(shí)別為健康骨髓細(xì)胞，從而避免了免疫監(jiān)視[18]。DTC還可以通過下調(diào)主要組織相容性復(fù)合體-Ⅰ的表達(dá)逃避免疫監(jiān)視[19]。在急性髓細(xì)胞白血病模型中， PD-L1的過度表達(dá)可導(dǎo)致白血病細(xì)胞對(duì)細(xì)胞毒性T細(xì)胞介導(dǎo)的殺傷更具抵抗性[20]。這不僅是臨床上應(yīng)用PD-1/PD-L1免疫檢查點(diǎn)抑制劑抗腫瘤治療的理論基礎(chǔ)，也可能是腫瘤休眠的機(jī)制之一。Watt等研究發(fā)現(xiàn)CDK4/6抑制劑誘導(dǎo)了以廣泛增強(qiáng)子激活為特征的BCC染色質(zhì)重塑，新激活的增強(qiáng)子包括逃避細(xì)胞凋亡的經(jīng)典超級(jí)增強(qiáng)子[21]。這也是保護(hù)休眠細(xì)胞免受免疫消除的潛在機(jī)制之一。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是一種細(xì)胞自主反應(yīng)，亦有研究提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激能夠幫助DCC逃避免疫監(jiān)視并建立隱蔽轉(zhuǎn)移[22]。在腫瘤形成的早期，駐留在組織中的巨噬細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞附近聚積，以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和侵襲，它們還誘導(dǎo)強(qiáng)大的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞反應(yīng)，保護(hù)腫瘤細(xì)胞免受適應(yīng)性免疫的影響[23]。干擾素調(diào)節(jié)因子7（interferon regulating factor 7, IRF7）高表達(dá)與乳腺癌患者的無骨轉(zhuǎn)移生存率相關(guān)，其機(jī)制可能是IRF7參與了對(duì)休眠BCC的主動(dòng)免疫監(jiān)視，當(dāng)IRF7受到抑制時(shí)，BCC通過免疫逃逸實(shí)現(xiàn)骨轉(zhuǎn)移[24]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)BCC中IRF7的激活誘導(dǎo)免疫反應(yīng)從髓源性抑制細(xì)胞主導(dǎo)向CD4+/CD8+T細(xì)胞顯性反應(yīng)轉(zhuǎn)變，敲減腫瘤細(xì)胞中的IRF7可逆轉(zhuǎn)休眠，IRF7的上游因子干擾素-β減少可使DCC自發(fā)脫離休眠，并且ER陰性乳腺癌患者的無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存期與干擾素-β相關(guān)[25]。

2.2 其他免疫反應(yīng)

除了免疫逃逸，還有其他免疫反應(yīng)亦參與乳腺癌休眠。目前已報(bào)道4種小鼠BCC可表現(xiàn)為肺部休眠，有趣的是每種細(xì)胞系（67NR、4T07、EMT6和D2.OR）肺休眠機(jī)制都表現(xiàn)出一定程度的免疫依賴性[26]。具體而言，67NR細(xì)胞休眠可以被脂多糖引發(fā)的炎性反應(yīng)喚醒[27]。4T07細(xì)胞可以激發(fā)產(chǎn)生系統(tǒng)性的CD39+/PD-1+/CD8+T淋巴細(xì)胞反應(yīng)，有利于肺部轉(zhuǎn)移性休眠，乳腺癌患者中這種特異性T淋巴細(xì)胞亞群與無病生存期之間的相關(guān)性佐證了這一點(diǎn)[28]。EMT6細(xì)胞肺休眠受髓系來源的抑制性免疫細(xì)胞和CD8+淋巴細(xì)胞之間的相互作用影響[29]。D2.OR細(xì)胞可以通過給予脂多糖[30]或誘導(dǎo)纖維化[31]從休眠中喚醒。

巨噬細(xì)胞在休眠方面似乎是一把雙刃劍，一方面骨內(nèi)膜定植的巨噬細(xì)胞可能通過與表面蛋白之間的直接相互作用，調(diào)節(jié)播散性BCC的休眠，賦予其化療抵抗力并誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，另一方面toll樣受體4的激活可以反向刺激巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榇僭鲋臣?xì)胞，這也表明炎性反應(yīng)可能在促進(jìn)休眠BCC蘇醒中發(fā)揮作用[32]。Correia等構(gòu)建了乳腺癌肝轉(zhuǎn)移的小鼠模型，發(fā)現(xiàn)在休眠環(huán)境中NK細(xì)胞有選擇性地增加，NK細(xì)胞通過干擾素-γ信號(hào)通路維持休眠，在NK細(xì)胞明顯收縮并積聚活化的肝星狀細(xì)胞后休眠結(jié)束[33]。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了免疫反應(yīng)在乳腺癌休眠中的重要性。

3 表觀遺傳

DCC在增殖和休眠狀態(tài)之間波動(dòng)也可能是表觀遺傳改變的結(jié)果[4]。Shimizu等研究提示E3泛素連接酶FBXW7過表達(dá)可誘導(dǎo)癌基因C-MYC和細(xì)胞周期蛋白E的泛素化降解，進(jìn)而限制腫瘤細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期，F(xiàn)BXW7基因敲減可破壞DTC靜止?fàn)顟B(tài)，誘導(dǎo)其增殖[34]。有絲分裂原和應(yīng)激激活激酶1（mitogen- and stress-activated kinase 1, MSK1）是一種染色質(zhì)激酶，可通過組蛋白H3磷酸化改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)，促進(jìn)激活劑依賴性轉(zhuǎn)錄[35]。Sylwia等研究顯示MSK1高表達(dá)與ER陽性乳腺癌患者晚期復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有關(guān)，MSK1可通過調(diào)節(jié)啟動(dòng)子染色質(zhì)狀態(tài)控制細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控BCC休眠[36]。

4 代謝

核因子E2相關(guān)因子2（nucleal factor erythroid-2-related factor 2, NRF2）是一種調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和抗氧化反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。2019年Zhang等發(fā)現(xiàn)NRF2可通過上調(diào)G6PD/HIF-1α/Notch1信號(hào)通路表達(dá)促進(jìn)BCC遷移[37]。Fox等進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，BCC中HER2下調(diào)促進(jìn)細(xì)胞代謝，導(dǎo)致NRF2的代償性上調(diào)；在預(yù)后不良的乳腺癌動(dòng)物模型中觀察到NRF2在休眠期和復(fù)發(fā)腫瘤中被激活，且NRF2誘導(dǎo)代謝重編程以重建氧化還原穩(wěn)態(tài)；NRF2的組成性激活加速復(fù)發(fā)，而抑制NRF2延緩復(fù)發(fā)，這些數(shù)據(jù)提示NRF2驅(qū)動(dòng)的代謝重編程可能促進(jìn)隱匿性乳腺癌復(fù)發(fā)[38]。該團(tuán)隊(duì)隨后的研究發(fā)現(xiàn)，抑制谷氨酰胺酶能夠阻止體外DCC的再激活，并且NRF2驅(qū)動(dòng)的復(fù)發(fā)性BCC對(duì)谷氨酰胺酶抑制敏感性增加，因此提出了一種控制乳腺癌復(fù)發(fā)的潛在新策略[38]。

5 腫瘤微環(huán)境

DTC在生態(tài)位中的休眠可以被認(rèn)為是一種適應(yīng)性狀態(tài)，最近的研究表明腫瘤微環(huán)境很大程度上參與了誘導(dǎo)、維持或中止BCC休眠[39]。

5.1 缺氧

人乳腺癌細(xì)胞系能夠在1%氧氣條件下穩(wěn)定存活并進(jìn)入休眠狀態(tài)，若恢復(fù)正常氧供細(xì)胞在2周內(nèi)恢復(fù)增殖，其機(jī)制可能與慢性缺氧誘導(dǎo)自噬有關(guān)[40]。故自噬可能是休眠的BCC在缺氧微環(huán)境中生存的關(guān)鍵策略之一[41]。另一項(xiàng)研究認(rèn)為缺氧通過下調(diào)LIFR/STAT3/SOCS3信號(hào)通路賦予骨髓中BCC的休眠表型[42]。氯化鈷可在MCF-7和MDAMB-231細(xì)胞系中模擬缺氧誘導(dǎo)的癌細(xì)胞休眠，且該休眠模型是缺氧誘導(dǎo)因子1α依賴性的[43]。

5.2 細(xì)胞外基質(zhì)

Fang等最早發(fā)現(xiàn)將MDA-MB-231細(xì)胞包埋在較硬凝膠中則表現(xiàn)出細(xì)胞形態(tài)改變、簇形成、倍增時(shí)間延長和代謝速率減慢等休眠狀態(tài)[44]。Liu等也發(fā)現(xiàn)堅(jiān)硬的機(jī)械環(huán)境可以誘導(dǎo)干細(xì)胞樣腫瘤再生細(xì)胞休眠[45]。Pradhan等為了驗(yàn)證細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)DTC命運(yùn)的影響，在16種不同化學(xué)（配體密度和酶降解性）和機(jī)械（彈性、溶脹、網(wǎng)孔大?。┨匦缘乃z支架中觀察MDA-MB-231細(xì)胞生長/休眠狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)配體密度和酶降解性可能對(duì)DTC命運(yùn)影響最大[46]。

Barney團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了一個(gè)可以精細(xì)控制細(xì)胞外基質(zhì)的體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，通過實(shí)時(shí)成像觀察癌細(xì)胞休眠的進(jìn)入和退出，發(fā)現(xiàn)能夠進(jìn)入長期休眠存活的細(xì)胞分布于不同細(xì)胞周期，其共同特征是通過整合蛋白黏附形成有組織的纖維連接蛋白基質(zhì)，休眠后的癌細(xì)胞重啟生長需要降解纖維連接蛋白[47]。Montagner等進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)BCC和肺泡上皮細(xì)胞相互作用可促進(jìn)整合蛋白依賴的纖維連接蛋白形成，且該過程由分泌卷曲相關(guān)蛋白2介導(dǎo)[48-49]。

5.3 血管周圍生態(tài)位

Ghajar等最先設(shè)計(jì)了器官型血管周圍生態(tài)位（perivascular niche, PVN）模型以確定內(nèi)皮細(xì)胞是否直接影響B(tài)CC的生長；這些模型表明內(nèi)皮衍生的血小板反應(yīng)蛋白-1誘導(dǎo)BCC保持靜止；這種抑制性作用在發(fā)芽的新血管系統(tǒng)中丟失；時(shí)間推移分析表明，發(fā)芽的血管不僅允許，而且加速BCC的生長；也就是說穩(wěn)定的微血管構(gòu)成了維持休眠的生態(tài)位，而發(fā)芽的新血管則引發(fā)了DCC轉(zhuǎn)移性生長[50]。Patrick等研究發(fā)現(xiàn)在整合蛋白介導(dǎo)下，DTC可與定植部位PVN相互作用而免受化療的影響，該作用與細(xì)胞周期無關(guān)，使用整合蛋白抑制劑可在不誘導(dǎo)DTC增殖或加劇化療相關(guān)不良反應(yīng)的情況下實(shí)現(xiàn)化療增敏[51]。骨髓是DCC定植最常見的部位之一[6]。Oleta等研究表明在Wnt-β-連環(huán)蛋白途徑介導(dǎo)下，DTC與骨髓基底細(xì)胞PVN相互作用后去分化成為癌癥干細(xì)胞，從而成功啟動(dòng)早期休眠[52]。也有研究表明PVN通過上調(diào)PD-L1的表達(dá)水平為腫瘤細(xì)胞創(chuàng)造了一個(gè)免疫抑制的微環(huán)境[53]，這為臨床上抗血管生成治療和免疫治療聯(lián)合使用提供了理論基礎(chǔ)。

5.4 成骨細(xì)胞

Hughes等觀察到在小鼠體內(nèi)模型中，骨髓中播散的BCC往往定植在富含成骨細(xì)胞的部位；體外試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證成骨細(xì)胞可以保護(hù)BCC免受細(xì)胞應(yīng)激誘導(dǎo)的死亡[54]。Kolb等研究認(rèn)為造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cells, HSC）生態(tài)位中的一些成骨細(xì)胞通過與BCC相互作用支持休眠狀態(tài)而被激活，它們獲得抑制三陰性和ER陽性BCC增殖的能力，在延緩BCC生長中發(fā)揮作用[55]。后續(xù)研究認(rèn)為被激活的成骨細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞外小泡可減少BCC進(jìn)入S期進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖[56]。

5.5 間充質(zhì)干細(xì)胞

Nobre等研究發(fā)現(xiàn)骨髓駐留的間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stroma/stem-like cells，MSC）可引導(dǎo)乳腺癌DTC進(jìn)入休眠，并且如果有衰老或其他外源性因素打破MSC內(nèi)穩(wěn)態(tài)，可進(jìn)一步打破休眠以及導(dǎo)致乳腺癌骨復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移[57]。也有研究發(fā)現(xiàn)BCC與MSC融合可以誘導(dǎo)休眠[58]。另一項(xiàng)研究則認(rèn)為BCC是在吞噬MSC后被迫進(jìn)入休眠[59]。

6 非編碼RNA

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA, lncRNA）近年來作為潛在的癌癥治療靶點(diǎn)和腫瘤生物標(biāo)記物而備受關(guān)注。Tivari等率先發(fā)現(xiàn)休眠的ER陽性BCC的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化基因被激活[60]。Liu等團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)BCSC的上皮樣和間充質(zhì)樣亞群在肺部表現(xiàn)出不同程度的休眠和致瘤性，LncRNANR2F1-AS1在休眠的間充質(zhì)樣BCSC中上調(diào)，通過抑制ΔNp63轉(zhuǎn)錄引發(fā)肺臟BCC的EMT，降低致瘤性并促進(jìn)肺部BCC的休眠[61]。LncRNAELEANORS是一組最初在復(fù)發(fā)性BCC模型中識(shí)別出的非編碼RNA[62]。Fukuoka等發(fā)現(xiàn)ELEANOR僅在ER陽性乳腺癌病例表達(dá)，并且ELEANOR陽性乳腺癌患者的晚期復(fù)發(fā)率增加，經(jīng)多因素分析表明，ELEANORS是一個(gè)獨(dú)立的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)因素；進(jìn)一步對(duì)細(xì)胞系、小鼠異種移植物和患者組織的分析表明，ELEANORS上調(diào)了干細(xì)胞基因CD44的表達(dá)，并維持了癌癥干細(xì)胞的數(shù)量，這可能促進(jìn)腫瘤休眠[63]。Kumar等團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)LncRNAMALAT1的缺失完全消除了BCC的轉(zhuǎn)移潛力，而MALAT1的過表達(dá)可以誘導(dǎo)休眠的BCC蘇醒或再激活[64]。一項(xiàng)研究調(diào)查顯示miR-200c在乳腺癌晚期復(fù)發(fā)患者樣本中高表達(dá)，其與乳腺癌幸存者無病生存率降低相關(guān)[65]。以上證據(jù)闡明了LncRNA和miRNA在DCC覺醒中的重要性，表明這些非編碼RNA可能被用作乳腺癌預(yù)測性生物標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)。

7 結(jié)語

迄今為止DCC無法通過常規(guī)臨床手段檢測到，故早期發(fā)現(xiàn)并有效消除DTC是腫瘤學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)突出挑戰(zhàn)。關(guān)于當(dāng)下臨床實(shí)際工作中如何靶向乳腺癌休眠以減少晚期復(fù)發(fā)現(xiàn)象，筆者認(rèn)為可分為兩方面：減少進(jìn)入休眠的BCC數(shù)量和阻斷DCC覺醒。前者有賴于臨床醫(yī)生更規(guī)范積極應(yīng)用現(xiàn)有乳腺癌初始根治治療手段，后者要求臨床醫(yī)生更加注重影響乳腺癌休眠的臨床和流行病學(xué)因素。

利益沖突聲明：

所有作者均聲明不存在利益沖突。