傳統(tǒng)中藥在膽管癌防治中的機(jī)制研究進(jìn)展

呂彥霖，潘耀振,2

0 引言

膽管癌是一種來源于膽管上皮的膽管腺癌。根據(jù)解剖位置分為肝內(nèi)膽管癌和肝外膽管癌兩種亞型。近年來，肝內(nèi)膽管癌的發(fā)病率和死亡率不斷上升，這與肝外膽管癌并不一致[1-3]。膽管癌的發(fā)生可能與一系列危險因素有關(guān)，例如乙型和丙型肝炎感染、肝硬化、肥胖癥以及糖尿病等，但病因尚不清楚[4-5]。目前膽管癌的治療策略包括手術(shù)、化療和放療。手術(shù)治療是膽管癌的首選治療方法。據(jù)統(tǒng)計，肝門周圍膽管癌患者接受手術(shù)或肝移植的5年生存率相對較低[6]。目前，已證明基于5-氟尿嘧啶的治療方案可以稍微延長患者生存時間[7]，但化療可能會導(dǎo)致不良反應(yīng)并降低患者的生活質(zhì)量，極大地增加患者負(fù)擔(dān)[8-9]。

近期研究發(fā)現(xiàn)，許多中國傳統(tǒng)中藥，在包括膽管癌在內(nèi)的多種癌癥的治療中均表現(xiàn)出優(yōu)秀的抗腫瘤作用，與此同時，中藥有著價格低廉、儲量豐富等諸多優(yōu)勢，所以在膽管癌的治療中，中藥被認(rèn)為是一種有效且安全的補(bǔ)充替代療法。本文從不同層面綜述近年來中藥抗膽管癌的作用機(jī)制及研究進(jìn)展，為膽管癌的防治提供新的思路。

1 抑制膽管癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)其凋亡

膽管癌細(xì)胞無限增殖是膽管癌難以控制且易復(fù)發(fā)的主要原因。同時，細(xì)胞增殖和凋亡過程機(jī)制復(fù)雜，涉及許多基因。如果癌基因和原癌基因被激活，細(xì)胞就會過度生長，凋亡過程被阻斷，從而產(chǎn)生大量膽管癌細(xì)胞。因此，抑制膽管癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)膽管癌細(xì)胞凋亡，可為膽管癌的防治提供新的思路和方法。

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析驗證中藥抗膽管癌作用

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是結(jié)合藥理學(xué)、分子生物學(xué)、電子技術(shù)和生物信息學(xué)，使中藥有效成分、相關(guān)靶點(diǎn)、途徑和疾病之間形成網(wǎng)絡(luò)關(guān)系的一種很有前途的研究方法。使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)來識別草藥靶點(diǎn)和潛在機(jī)制，對于節(jié)省藥物發(fā)現(xiàn)和設(shè)計所需的資金、精力和時間變得越來越重要。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)成功地實(shí)現(xiàn)了藥物疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和可視化，有助于從多角度評價藥物的作用機(jī)制[10]。

Wang等[11]利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法和細(xì)胞模型研究了黃芪對膽管癌的作用，并預(yù)測了其核心靶點(diǎn)和分子機(jī)制。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，黃芪含有16種活性成分，對膽管癌均有顯著的抗炎和抗腫瘤活性，以槲皮素和山奈酚為核心成分，5個最重要的生物靶標(biāo)是caspase3、MAPK8、MYC、EGFR和PARP，并通過蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗進(jìn)一步驗證顯示黃芪能顯著影響網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測的5個靶點(diǎn)的表達(dá)，顯示了黃芪作為治療膽管癌新藥的潛力。

茵陳蒿湯是一種著名的中藥處方，在臨床上被用于清除熱量、消除濕氣和消除黃疸[12-13]。Chen等[14]通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)鑒定出茵陳蒿湯中32種具有抗腫瘤作用的有效活性成分，其中槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、異丁烯醇和豆甾醇等多種抗癌活性物質(zhì)被確定為茵陳蒿湯中重要的抗癌活性成分。篩選出了209個化合物靶標(biāo)，有96個靶標(biāo)與癌癥有關(guān)，其中AKT1、IL6、MAPK1、TP53和VEGFA被確定為與膽管癌相關(guān)的5個樞紐蛋白靶標(biāo)，表明茵陳蒿湯是一種具有多靶點(diǎn)治療作用的多組分配方。通過分子對接分析，這些活性化合物和靶標(biāo)表現(xiàn)出良好的相互作用，并通過調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，如MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、PI3K-Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、癌細(xì)胞中的microRNA等發(fā)揮抗癌治療作用。他們又進(jìn)一步通過實(shí)驗進(jìn)行驗證，結(jié)果顯示茵陳蒿湯可通過調(diào)節(jié)相關(guān)靶蛋白抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗膽管癌作用。

1.2 激活Caspase途徑

Caspase家族能夠調(diào)控多種生物過程，在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。Caspase-3是細(xì)胞凋亡最重要的效應(yīng)因子，在細(xì)胞凋亡過程中起著重要作用，其激活表明細(xì)胞凋亡進(jìn)入不可逆階段；Caspase-8是細(xì)胞凋亡最重要的啟動子，能激活幾乎所有凋亡級聯(lián)的下游Caspase，放大凋亡信號，進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡；Caspase-12在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡中起重要作用，激活的 Caspase-12從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)，進(jìn)一步切割前體 Caspase-9，Caspase-9是促凋亡的Caspase，激活的Caspase-9能進(jìn)一步激活Caspase-3，最終激活PARP誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

本課題組研究發(fā)現(xiàn)[15]，青藤堿對人膽管癌細(xì)胞系HUCCT-1和TFK-1中Cleaved-Caspase-3與Cleaved-Caspase-9的表達(dá)及凋亡均有調(diào)節(jié)作用，膽管癌細(xì)胞的總凋亡率和早期凋亡率均隨藥物濃度增高顯著升高。李彬彬等[16]將葛根素應(yīng)用于人膽管癌RBE細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)1 000 μg/ml葛根素可以通過Caspase途徑有效誘導(dǎo)RBE細(xì)胞凋亡，并可以顯著升高細(xì)胞中Cleaved-caspase-8、Cleaved-caspase-9蛋白及凋亡關(guān)鍵蛋白Bax的表達(dá)，降低Bcl-2的表達(dá)，表明葛根素是通過Caspase途徑誘導(dǎo)膽管癌細(xì)胞凋亡的。康曉亮等[17]研究發(fā)現(xiàn)，中藥復(fù)方抑瘤飲作用于膽管癌QBC939細(xì)胞，高劑量組（12 mg/kg）中膽管癌細(xì)胞出現(xiàn)顯著的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，其細(xì)胞核呈顯著變化，出現(xiàn)核染色質(zhì)固縮，甚至出現(xiàn)畸形核，并通過上調(diào)PARP、Caspase-9、Caspase-12等凋亡關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步激活相關(guān)的家族級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，作用效果以高劑量組最為顯著。

1.3 下調(diào)抗凋亡蛋白Mcl-1

Mcl-1蛋白在癌細(xì)胞中是一種相當(dāng)重要的抗凋亡蛋白，其在保護(hù)腫瘤細(xì)胞逃避凋亡、導(dǎo)致腫瘤耐藥性方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。以往的研究表明，Mcl-1蛋白在膽管癌細(xì)胞中高度表達(dá)，與膽管癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[18]。與Mcl-1蛋白密切關(guān)聯(lián)的重要細(xì)胞信號通路有很多，有研究報道稱NFκB/miR-29b/Mcl-1及DNA damage/Mule/Mcl-1這兩個通路在與Mcl-1蛋白密切相關(guān)的細(xì)胞通路當(dāng)中，發(fā)揮著調(diào)控腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，為研究者們尋找高效、安全的抗腫瘤中藥提供了嶄新的思路。朱建明等[19]研究發(fā)現(xiàn)，雙氫青蒿素能通過調(diào)節(jié)膽管癌QBC939細(xì)胞中Mcl-1基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中的MCL1-001、MCL1-002及MCL1-201的表達(dá)水平，在治療6、12、24、48、72 h時發(fā)揮誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用，且細(xì)胞凋亡率呈現(xiàn)劑量與時間依賴性，最高達(dá)到了96%，表明雙氫青蒿素通過調(diào)節(jié)Mcl-1蛋白發(fā)揮優(yōu)秀的誘導(dǎo)膽管癌細(xì)胞凋亡的作用。

1.4 調(diào)控細(xì)胞周期

細(xì)胞周期的調(diào)控是細(xì)胞最基本的行為，涉及多種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，從而形成復(fù)雜的分子網(wǎng)絡(luò)信號系統(tǒng)。細(xì)胞周期調(diào)控紊亂是腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。細(xì)胞周期有兩個重要的限制點(diǎn)：G1/S和G2/M，真核細(xì)胞必須經(jīng)過G1-S轉(zhuǎn)化和DNA合成才能進(jìn)入S期并繼續(xù)增殖。RNA和蛋白質(zhì)的合成在G2期進(jìn)行，為M期的有絲分裂做準(zhǔn)備。它們在分子水平上復(fù)雜而活躍，容易受到外界因素的影響。如果能及時調(diào)控，對控制膽管癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展具有重要意義。

張金鐸等[20]研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用莪術(shù)醇可阻滯人膽管癌RBE細(xì)胞進(jìn)入S期，且劑量越高阻滯能力越強(qiáng)，呈現(xiàn)出典型的增殖抑制和促進(jìn)凋亡的抗癌作用，并可以顯著抑制細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)，該結(jié)果表明莪術(shù)醇是通過調(diào)控細(xì)胞周期，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮對膽管癌RBE細(xì)胞的抑制作用。朱幼姍等[21]研究人員發(fā)現(xiàn)，不同濃度的蛇床子素對人膽管癌細(xì)胞系QBC939作用48小時后，均能調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程，使細(xì)胞周期阻斷在G2/M期，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，0.15 mmol/L蛇床子素使QBC939細(xì)胞的凋亡率達(dá)到37.15%，并使其出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變。

2 抑制膽管癌侵襲遷移

腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移導(dǎo)致其不良的臨床預(yù)后被認(rèn)為是抗腫瘤藥物治療的重要靶點(diǎn)。膽管癌同樣是一種高侵襲性腫瘤，患者確診時常伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，是臨床患者死亡的重要因素。因此，抑制膽管癌的侵襲和遷移對膽管癌的治療具有重要意義。

2.1 抑制STAT3信號通路

信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）是STAT家族的一員，被認(rèn)為是一種致癌基因。在不同類型的腫瘤中磷酸化后，具有轉(zhuǎn)錄因子活性，調(diào)節(jié)與細(xì)胞侵襲和遷移密切相關(guān)的各種功能蛋白的表達(dá)。最近，許多研究報道STAT3在膽管癌的轉(zhuǎn)移中起重要作用，并且其表達(dá)與膽管癌的手術(shù)結(jié)果呈負(fù)相關(guān)[22]。因此，STAT3信號被認(rèn)為是膽管癌的潛在治療靶點(diǎn)。

Zhu等[23]通過研究發(fā)現(xiàn)，吳茱萸堿可以通過上調(diào)負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子磷酸酶抗碎裂蛋白2（SHP-2）的表達(dá)，進(jìn)而阻斷由IL-6/STAT3介導(dǎo)的膽管癌信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致膽管癌TKF-1細(xì)胞中侵襲遷移關(guān)鍵蛋白E-cadherin和N-cadherin表達(dá)下調(diào)，從而抑制細(xì)胞侵襲遷移，這表明吳茱萸堿可通過抑制STAT3信號通路發(fā)揮抑制膽管癌細(xì)胞侵襲遷移的作用。鄧秋媛等[24]將紫草素應(yīng)用于人肝內(nèi)膽管癌RBE細(xì)胞，通過M2型丙酮酸激酶-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子3（PKM3-STAT3）通路，發(fā)現(xiàn)PKM2、 p-STAT3蛋白表達(dá)水平被抑制，進(jìn)而抑制膽管癌中侵襲遷移關(guān)鍵蛋白E-cadherin和N-cadherin的表達(dá)。因此，紫草素能有效地通過PKM3-STAT3信號通路抑制膽管癌細(xì)胞的侵襲和遷移。

2.2 抑制上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），其中上皮衍生的腫瘤具有間充質(zhì)干細(xì)胞特性，表明了腫瘤轉(zhuǎn)移的可能性，其機(jī)制是破壞腫瘤細(xì)胞間的細(xì)胞黏附，重塑細(xì)胞骨架，提高細(xì)胞的流動性和侵襲性，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。其促進(jìn)侵襲和遷移的同時伴隨著N-Cadherin、E-Cadherin和Vimentin的調(diào)節(jié)，都是誘導(dǎo)膽管癌細(xì)胞侵襲和遷移的重要機(jī)制。鄭世勤等[25]通過應(yīng)用TGF-β1誘導(dǎo)人膽管癌細(xì)胞系RBE發(fā)生EMT，后應(yīng)用大蒜素進(jìn)行治療。通過MTT實(shí)驗得到大蒜素24 h的IC50大約為130.7 μmol/L，應(yīng)用此濃度大蒜素進(jìn)行細(xì)胞劃痕實(shí)驗以及Transwell實(shí)驗，結(jié)果顯示大蒜素可以顯著抑制由TGF-β1誘導(dǎo)的人膽管癌細(xì)胞的侵襲遷移，且可以上調(diào)膽管癌細(xì)胞中E-Cadherin，下調(diào) N-Cadherin、Vimentin的表達(dá)水平，表明大蒜素可通過抑制上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化實(shí)現(xiàn)對膽管癌細(xì)胞侵襲遷移的抑制。

2.3 抑制MMPs信號通路

腫瘤細(xì)胞的侵襲遷移，首先要降解細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix, ECM），在降解過程中，MMP2與MMP9為主要的降解酶?；|(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMPs）可以通過破壞機(jī)體抑制腫瘤細(xì)胞侵襲遷移的屏障，降解細(xì)胞外基質(zhì)及基底膜，從而在腫瘤細(xì)胞生長微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長中發(fā)揮不可替代的作用。林雪晶等[26]發(fā)現(xiàn)，木香烴內(nèi)酯可抑制膽管癌細(xì)胞的增殖，并可通過抑制膽管癌細(xì)胞中MMP-2、MMP-9表達(dá)，抑制MMPs信號通路，進(jìn)而抑制膽管癌細(xì)胞的侵襲遷移。

3 逆轉(zhuǎn)細(xì)胞耐藥性

耐藥性是指細(xì)胞反復(fù)接觸某一藥物后，對該藥物的敏感性降低，從而使該藥物的治療效果降低甚至失效。多藥耐藥性（multidrug resistance,MDR）是指腫瘤細(xì)胞同時對多種抗腫瘤藥物具有耐藥性的現(xiàn)象，是臨床化療失敗的主要原因，也是患者預(yù)后不良的重要因素。

研究人員通過應(yīng)用阿霉素（ADM）誘導(dǎo)人膽管癌細(xì)胞株QBC939的多藥耐藥，建立了人膽管癌細(xì)胞株QBC939/ADM。馬宏波等[27]發(fā)現(xiàn)人參有效成分人參皂苷Rg3能抑制人膽管癌細(xì)胞株QBC939/ADM中MDR1 mRNA的表達(dá)，并通過下調(diào)MDR1的表達(dá)逆轉(zhuǎn)膽管癌細(xì)胞的多藥耐藥。劉秀妃等[28]發(fā)現(xiàn)，姜黃素作用于QBC939/ADM細(xì)胞時，單獨(dú)姜黃素對QBC939/ADM細(xì)胞沒有明顯的抑制作用，而姜黃素聯(lián)合環(huán)磷酰胺和5-氟尿嘧啶對QBC939/ADM細(xì)胞的抑制作用更好，明顯強(qiáng)于單獨(dú)使用，說明姜黃素具有顯著的逆轉(zhuǎn)耐藥作用。

4 協(xié)同抗腫瘤作用

治療膽管癌的臨床藥物種類繁多，其中最常見的是5-氟尿嘧啶（5-Fu）。 5-Fu是消化系統(tǒng)腫瘤中廣泛使用的化療藥物，價格低廉。此外，吉西他濱（GEM）、順鉑（CIS）和阿霉素（DOX）也有廣泛的應(yīng)用。然而，膽管癌對這些目前可用化療藥物的反應(yīng)很差。在臨床實(shí)踐中，醫(yī)生曾嘗試聯(lián)合使用不同的化療藥物，以最大限度地發(fā)揮抗癌作用，但聯(lián)合用藥的效果并不都很理想。

汪洋等[29]通過研究單獨(dú)使用細(xì)梗香草總皂苷以及與5-Fu聯(lián)合使用對膽管癌QBC939細(xì)胞所發(fā)揮抗癌作用的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4 μg/ml的細(xì)梗香草總皂苷聯(lián)合3 μg/ml的5-Fu，可使膽管癌細(xì)胞的增殖抑制率達(dá)到65.3%，顯著強(qiáng)于單獨(dú)用藥，并且聯(lián)合用藥顯著增加膽管癌細(xì)胞中Caspase-3表達(dá)，降低PARP表達(dá)，且兩藥用藥濃度均小于其各自的IC50，表明細(xì)梗香草總皂苷與5-Fu具有協(xié)同作用，5-Fu對膽管癌的化療效果被其顯著增強(qiáng)。Fu等[30]研究者發(fā)現(xiàn)，30 μg/ml 5-Fu聯(lián)合6 ml/mg槐耳相比單獨(dú)用藥，在膽管癌的治療方面具有更強(qiáng)的抗增殖、周期阻滯、誘導(dǎo)凋亡和抗轉(zhuǎn)移作用，并且聯(lián)合用藥可以顯著抑制膽管癌中STAT3及其靶基因（如Ki67、Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2）的表達(dá)，表明槐耳聯(lián)合5-Fu對膽管癌細(xì)胞Huh28具有協(xié)同抗腫瘤作用。

5 問題與展望

中藥及其活性成分能夠抑制膽管癌細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)凋亡、抑制侵襲轉(zhuǎn)移、逆轉(zhuǎn)耐藥性、協(xié)同抗腫瘤作用等，并通過不同機(jī)制在不同水平上達(dá)到抗膽管癌的目的，現(xiàn)已取得階段性突破，但仍存在諸多不足。與化療藥物相比，中藥的影響因素更多，作用機(jī)制更復(fù)雜，具有多靶點(diǎn)、多層次的特點(diǎn)。雖然中藥抗膽管癌的機(jī)制研究已經(jīng)深入到基因水平，但每種中藥的機(jī)制研究僅限于一些已知的作用靶點(diǎn)和信號通路的調(diào)控，未能在新的領(lǐng)域取得突破，缺乏一定的深度；此外，大部分研究停留在實(shí)驗動物階段，人體試驗較少，很難反映藥物在體內(nèi)的代謝和機(jī)制。因此，對中藥防治膽管癌機(jī)制的研究應(yīng)更加深入和全面，以盡快構(gòu)建一個科學(xué)和標(biāo)準(zhǔn)化的結(jié)合傳統(tǒng)中藥配方治療膽管癌的理論體系。

利益沖突聲明：

所有作者均聲明不存在利益沖突。