抗革蘭氏陰性菌抗菌肽在畜牧業(yè)應(yīng)用研究進(jìn)展

喻家曉，張明輝，高學(xué)軍

（長江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434023）

革蘭氏陰性菌泛指革蘭氏染色反應(yīng)呈紅色的細(xì)菌。主要的致病性革蘭氏陰性菌（Gram negative bacteria，G-菌）有大腸埃希菌、沙門氏菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌等，這些細(xì)菌會引起腹瀉、尿路感染、呼吸道感染、敗血癥等疾病，對人類健康構(gòu)成極大威脅，也給畜牧生產(chǎn)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。由于抗生素濫用和細(xì)菌耐藥性的出現(xiàn)，治療這些疾病變得越來越困難。G-菌的細(xì)胞膜由內(nèi)膜、細(xì)胞間質(zhì)和外膜組成。內(nèi)膜由疏水的α-螺旋結(jié)構(gòu)的膜蛋白構(gòu)成對稱的磷脂雙分子層；細(xì)胞間質(zhì)中含有大量肽聚糖；外膜是高度不對稱的脂雙層，外膜內(nèi)層為磷脂層，外層主要由脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）組成并包含一些對外環(huán)境具有抵抗作用的親水β-折疊結(jié)構(gòu)外膜蛋白。脂多糖能夠吸附Mg2+和Ca2+等陽離子形成非常緊密的堆積層，形成滲透屏障，使它們在允許營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入的同時能夠有效地屏蔽抗生素等藥物的進(jìn)入[1]。

抗菌肽（Antimicrobial peptides，AMPs）是一種由核糖體合成的多為小于10 kDa 的帶有正電荷的兩親性分子多肽，具有抗細(xì)菌、真菌、病毒和低細(xì)胞毒性等優(yōu)點(diǎn)，且不易產(chǎn)生耐藥性[2]。因此，AMPs 正逐漸成為新一代抗致病性G-菌藥物。

1 AMPs 的分類及結(jié)構(gòu)

AMPs 廣泛分布于多種生物中，是機(jī)體先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分。根據(jù)來源不同可將其分為動物、植物、微生物以及人工合成四大類。

1.1 動物來源的AMPs

動物來源的AMPs 可分為昆蟲抗菌肽、水生動物抗菌肽、哺乳動物抗菌肽及兩棲動物抗菌肽。昆蟲源AMPs 根據(jù)其結(jié)構(gòu)及功能的不同分為4 大類，包括天蠶素（Cecropins）、昆蟲防御素（Insect defensins）、富含脯氨酸抗菌肽（Proline-rich peptides） 和富含甘氨酸抗菌肽（Glysine-rich peptides）。水生動物源AMPs 從貝類、魚類、水生無脊椎動物等分離得到，如Moronecidin、鱟素、Piscidins類、Defensin 類等[3]。哺乳動物源AMPs 主要存在于動物皮膚黏膜、免疫器官以及中性粒細(xì)胞，可根據(jù)其結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特征分為防御素類和Cathelicidins 家族兩大類。兩棲動物源AMPs 根據(jù)其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)可分為含有分子內(nèi)二硫鍵的環(huán)狀肽和具有α-螺旋結(jié)構(gòu)的線性肽，如Magainin II、Bombinins，具有良好抗菌作用[4]。

1.2 植物來源的AMPs

AMPs 存在于植物的根、莖、葉、花、果實(shí)和種子中，并且多存在于植物外層，能抵御病原體的侵入。常見的種類包括硫堇、植物防御素、橡膠蛋白、Knottins、脂轉(zhuǎn)移蛋白和Snakins；不太常見的種類包括Cyclotide、2S Albumins、β-Barrelins、Ib-AMPs、MBPs和Shepherin[5]。

1.3 微生物來源的AMPs

細(xì)菌分泌的AMPs 也稱為細(xì)菌素，是某些細(xì)菌在代謝過程中通過核糖體合成機(jī)制產(chǎn)生的一類具有生物活性的多肽或前體多肽。細(xì)菌素均由細(xì)菌核糖體直接翻譯合成，存在較多的翻譯后修飾的稱為Ⅰ類細(xì)菌素，其他稱作Ⅱ類細(xì)菌素[6]。兩類細(xì)菌素按照各自結(jié)構(gòu)特點(diǎn)又分為若干亞類，如Lantibiotics、Labyrinthopeptins 和Sanctibiotics。近年來研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌分泌的AMPs 如Ⅰ類細(xì)菌素通常比真核生物產(chǎn)生的AMPs 更有效抑制有害細(xì)菌。

1.4 人工合成AMPs

目前較為成熟的人工制備抗菌肽的方法有三種：一是根據(jù)AMPs 氨基酸序列，通過化學(xué)合成的方法獲得AMPs；二是通過基因工程技術(shù)，將編碼AMPs 的基因?qū)氲奖磉_(dá)載體內(nèi)，獲得產(chǎn)量較高的AMPs；三是通過蛋白酶催化水解特定蛋白質(zhì)獲得具有抗菌活性的AMPs[3]。

1.5 AMPs 的結(jié)構(gòu)

AMPs 通常由12～80 個氨基酸殘基組成，其中絕大部分是電荷攜帶量在（+2）～（+9）之間的陽離子短肽，其中帶有（+2）～（+4）電荷的AMPs 最為豐富[7]。按照AMPs 二級結(jié)構(gòu)特點(diǎn)不同將其分為α-螺旋型、β-折疊型、環(huán)鏈結(jié)構(gòu)型和無規(guī)則卷曲型4 種。

α-螺旋型AMPs 的多肽鏈N 端富含親水的堿性氨基酸（Lys 和Arg），形成一個帶正電荷的親水區(qū)域，C 端則由較多的疏水氨基酸形成疏水親脂的α-螺旋型，兩個α-螺旋型之間靠Gly 和Pro 形成鉸鏈區(qū)。該類AMPs 主要包括Cecropins 家族、蛙皮素、Cathelindia 等。典型的β-折疊型AMPs 是動物防御素，廣泛存在于中性粒細(xì)胞及多種上皮組織中，一般含有38～42 個氨基酸殘基。動物防御素可以分為α 型和β 型，含有β-折疊結(jié)構(gòu)，β-折疊之間靠二硫鍵相連。環(huán)鏈結(jié)構(gòu)型AMPs 多肽鏈的C 端或中部可以形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，環(huán)的兩端或N 端為線狀結(jié)構(gòu)，如來自中性粒細(xì)胞分泌的Bactenecin。無規(guī)則卷曲型AMPs 則沒有特定的結(jié)構(gòu)，如免疫調(diào)節(jié)肽Cathelicidin[4]。

2 AMPs 作用機(jī)制

不同的AMPs 具有不同的抗菌活性譜，例如Magainins、Defensins 和LL-37 對許多G-和G+菌均具有活性，植物防御素主要?dú)缯婢?xì)菌素通常只抑制競爭菌株的生長[8]。AMPs 主要作用機(jī)制為：帶有正電荷的AMPs 會與G-菌外膜上的LPS 結(jié)合，通過靜電相互作用結(jié)合到細(xì)菌表面；接著AMPs 的非極性部分通過疏水作用插入細(xì)菌細(xì)胞的脂質(zhì)雙分子層中，取代Ca2+、Mg2+等穩(wěn)定磷脂的二價陽離子，從而導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)的破壞。AMPs 破壞細(xì)胞膜導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞膜去極化、膜電位下降、膜通透性改變、細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)泄漏，最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡[9]。研究表明，部分AMPs 通過細(xì)胞膜后作用于細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)不同的靶點(diǎn)，通過抑制DNA 和RNA 的合成、降低蛋白質(zhì)合成的速率、抑制蛋白質(zhì)折疊、干擾酶活性、抑制細(xì)胞壁的合成和一些其他的途徑，進(jìn)一步發(fā)揮殺菌作用[10]。

3 抑制G-菌的AMps

3.1 Protegrin-1

Protegrin-1（PG-1）從豬中性粒細(xì)胞中分離獲得，屬于Cathelicidin 家族哺乳動物防御素成員，由18 個氨基酸組成。PG-1 對典型G+菌和G-菌的最低抑菌濃度（MIC）為0.12～2 mg/L，低濃度時可明顯抑制大腸桿菌和枯草芽孢桿菌[11]。

3.2 LL-37

LL-37 由巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞等分泌，由37 個氨基酸組成，電荷攜帶量為+6，其N 端前含有2 個Lys 殘基，具有兩親性α 螺旋結(jié)構(gòu)，屬于Cathelicidin 家族。LL-37 對G+菌和G-菌均有抑制作用，LL-37 對哺乳動物細(xì)胞毒性低，并且具有抗炎作用，是治療G-菌敗血癥的良好候選藥物[12]。

3.3 Citropin 1.1

Citropin 1.1 是一種兩棲類肽，含有α-螺旋結(jié)構(gòu)，由16 個氨基酸組成。Citropin 1.1 對G+菌和G-菌均有抑制作用，同時還具有免疫調(diào)節(jié)作用。Citropin 1.1 能夠顯著減少大腸桿菌敗血癥小鼠的血漿內(nèi)毒素和炎癥細(xì)胞因子含量。對Citropin 1.1 進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾后，其類似物的抗菌活性、穩(wěn)定性明顯增強(qiáng)[13]。

3.4 Magainin II

Magainin II 是兩棲類動物皮膚中產(chǎn)生的肽，屬于防御素類，具有α-螺旋結(jié)構(gòu)。Magainin II 對金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的MIC 值為32 ～128 mg/L，對大腸桿菌的MIC 值為121 mg/L[14]。

3.5 Cecropins

Cecropins 由34～39 個氨基酸殘基組成，分為6種類型（A、B、C、D、E 和P1），其中天蠶素A、B、D 是天蠶素家族的主要成員，分子量大小十分接近，且三者之間氨基酸序列的同源性非常高。其中Cecropin B 含有35 個氨基酸，抗菌活性最強(qiáng)，并且對細(xì)菌、真菌、病毒、原蟲和某些腫瘤細(xì)胞均具有顯著的抑制殺傷效應(yīng)[15]。Cecropins 在抑制G-菌方面有著較好的應(yīng)用前景。

3.6 Tachyplesin Ⅲ

Tachyplesin 是從鱟的血細(xì)胞中提取得到，由17～18 個氨基酸組成的含有兩個二硫鍵結(jié)構(gòu)的陽離子多肽，屬于宿主防御肽，具有廣譜抗菌活性，其家族成員Tachyplesin Ⅲ可以作為敗血癥治療藥物進(jìn)行研究開發(fā)[16]。

3.7 Colistin 黏菌素

Colistin 是從多黏類芽孢桿菌中分離獲得的環(huán)狀陽離子多肽，對大多數(shù)G-菌均具有很強(qiáng)的抑制作用，但其臨床應(yīng)用受到藥代動力學(xué)特性和腎毒性風(fēng)險(xiǎn)的明顯限制[17]。

4 抗G-AMPs 在畜牧業(yè)中的應(yīng)用

4.1 在家禽養(yǎng)殖中的應(yīng)用

4.1.1 在肉雞養(yǎng)殖中的應(yīng)用

在飼料中添加抗G-AMPs 可明顯改善肉雞的生長性能、減輕炎癥反應(yīng)、提高飼料利用率和動物的成活率[18]。在18 胚胎日卵內(nèi)添加禽β-防御素能夠顯著降低由禽致病性大腸桿菌引起的早期雛雞死亡率[19]。在飼料中添加0.05%和0.10%AMPs 時，肉雞的平均日增重顯著高于未添加組；0.10%AMPs 組胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、IgA、IgG、IgM 含量均顯著升高，表明添加一定比例的AMPs 可使肉雞的機(jī)體免疫力處于較優(yōu)水平、促進(jìn)肉雞生長[20]。PG-1對禽源沙門氏菌和大腸桿菌的抑菌效果強(qiáng)于抗生素，在禽飼料中添加PG-1 可顯著提高家禽的生長性能和抗病能力[21]。試驗(yàn)結(jié)果表明添加不同劑量天蠶素AMPs 可以增強(qiáng)感染鼠傷寒沙門氏菌肉雞機(jī)體免疫反應(yīng)，降低器官病變程度，顯著改善肉雞生長性能，降低感染造成的損失[22]。

4.1.2 在蛋雞養(yǎng)殖中的應(yīng)用

AMPs 可提高產(chǎn)蛋雞生產(chǎn)性能，改善蛋品質(zhì)、營養(yǎng)物質(zhì)利用率及免疫功能。添加AMPs 后蛋雞的免疫功能、抗氧化能力、產(chǎn)蛋率、蛋殼厚度、蛋殼硬度以及粗灰分利用率均有提高；在產(chǎn)蛋后期蛋雞日糧中添加200～400 mg/kg AMPs 效果最好[23]。日糧中添加抗G-AMPs（細(xì)菌素、天蠶素等），與對照組相比蛋雞的料蛋比顯著降低，回腸絨毛高度顯著提高，添加30～100 mg/kg 抗G-AMPs（細(xì)菌素、天蠶素等）均可改善回腸腸道黏膜形態(tài)，降低蛋雞腸道內(nèi)有害微生物數(shù)量，提高產(chǎn)蛋率、料蛋比和生產(chǎn)性能[24,25]。

4.1.3 在其他家禽養(yǎng)殖中的應(yīng)用

AMPs 可提高鴨、鵝、鵪鶉等禽類的生長性能，改善動物的腸道健康，提高免疫力，促進(jìn)免疫器官發(fā)育等。添加AMPs 顯著降低了肉鴨盲腸中大腸桿菌菌落數(shù)[26]。在白羽番鴨母雛日糧中添加天蠶素AMPs，雛鴨成活率高達(dá)96.67%，顯著高于未添加組；降低了腸道大腸桿菌，增加乳酸桿菌數(shù)；提高平均日增重、降低料重比[27]。添加50、100、200 mg/kg AMPs 后，鵪鶉的產(chǎn)蛋率、蛋殼厚度、蛋黃顏色均有提高[28]。張雪等研究了AMPs 對鵪鶉免疫功能、腸道菌群的影響，發(fā)現(xiàn)添加300 mg/kg AMPs 組α1、α2、β、γ 球蛋白含量比未添加組分別高84.57%、13.64%、18.45%、14.41%；IgA、IgG、IgM 含量明顯高于未添加組；盲腸沙門氏菌顯著降低，腸道內(nèi)乳酸桿菌、雙歧桿菌數(shù)增加；鵪鶉胸腺指數(shù)增加8.26%[29]。

4.2 在家畜養(yǎng)殖中的應(yīng)用

各種G-菌引起的腹瀉等疾病給畜牧生產(chǎn)帶來重大的經(jīng)濟(jì)損失，使得抗G-AMPs 在畜牧業(yè)中應(yīng)用迫切和具有廣闊的前景?？笹-AMPs 能抑制病原菌的生長、改善畜禽腸絨毛結(jié)構(gòu)、增強(qiáng)動物免疫能力，提高飼料轉(zhuǎn)化率，從而提高家畜的生長性能。例如感染大腸桿菌仔豬和斷奶仔豬飼喂抗G-AMPs（天蠶素AD）飼料后，可有效降低仔豬腹瀉率，調(diào)節(jié)斷奶仔豬腸道菌群，仔豬免疫功能明顯增強(qiáng)，改善仔豬的生長性能[30,31]。試驗(yàn)結(jié)果表明，在湖羊養(yǎng)殖生產(chǎn)中使用4、8 g/（只·d）AMPs 粗提物可以顯著提高其試驗(yàn)?zāi)w重及平均日增重，并顯著降低料重比[32]。在基礎(chǔ)飼糧中添加0.03% AMPs可提高犢牛平均日增重、日采食量和斷奶體重，超氧化物歧化酶（SOD）水平和血清免疫球蛋白M（IgM）水平提高，同時減少腹瀉發(fā)生率，改善斷奶犢牛腸道菌群、生長性能和健康狀況[33]。

5 展望

目前，AMPs 已廣泛用于獸醫(yī)學(xué)、疾病預(yù)防學(xué)以及畜禽養(yǎng)殖中，AMPs 對畜禽類生長性能的影響研究逐漸增多。大量研究表明AMPs 在一定程度上能夠提高畜禽生長性能，增強(qiáng)動物免疫能力，且具有無藥物殘留、無污染環(huán)境的特性。在飼料中添加抗G-AMPs 能很好地抑制革蘭氏菌和耐藥菌等的增殖，降低畜禽感染G-菌造成的損失。但AMPs 的研究和應(yīng)用仍存在一些問題和挑戰(zhàn)。例如，AMPs 規(guī)?；苽浜图兓行韪咝У募夹g(shù)工藝，新的AMPs 還需進(jìn)行大量臨床試驗(yàn)來評估其安全性、有效性以及最佳的使用劑量和方式。隨著對AMPs 研究的不斷深入，相信AMPs 將會成為治療G-菌感染的重要手段，在治療腹瀉等動物疾病方面發(fā)揮巨大作用，為畜牧生產(chǎn)保駕護(hù)航?！?/p>