特異性乳糖酶的開(kāi)發(fā)研究進(jìn)展

侯 超,張申平,馬躍龍

(1. 上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院,上海 200233;2. 國(guó)家食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心(上海),上海 200233)

乳糖酶,又稱(chēng)β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,EC 3.2.1.23),由于具有水解乳糖、生成葡萄糖和半乳糖的特點(diǎn),因此可用來(lái)降低含乳糖制品中乳糖含量,提高含乳糖產(chǎn)品的可消化性,解決乳糖不耐受問(wèn)題[1]。此外,乳糖酶還具有半乳糖苷轉(zhuǎn)移作用,可用來(lái)生產(chǎn)低聚半乳糖(GOS)[2]。

雖然乳糖酶的來(lái)源[3]非常豐富,包括植物、動(dòng)物和微生物,但乳糖酶的實(shí)際應(yīng)用企業(yè)數(shù)量少,只有廣東江門(mén)量子高科生物工程有限公司利用乳糖酶來(lái)生產(chǎn)低聚半乳糖,澳優(yōu)集團(tuán)也成功推出蘇芙拉乳糖酶調(diào)制乳粉。因?yàn)閷?shí)際應(yīng)用的復(fù)雜條件限制了乳糖酶的應(yīng)用,如,在冷鏈條件下無(wú)法高效水解牛乳中乳糖,乳糖酶容易受到胃液的影響而散失活性,工業(yè)生產(chǎn)的復(fù)雜反應(yīng)條件導(dǎo)致乳糖酶的重復(fù)使用次數(shù)少、回收率低。因此,尋找適合特定應(yīng)用條件下的特異性乳糖酶就顯得尤為重要。本文對(duì)特異性乳糖酶及其酶學(xué)特性進(jìn)行介紹,對(duì)定向進(jìn)化和應(yīng)用策略方面進(jìn)行總結(jié),為特異性乳糖酶的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供思路,以期促進(jìn)乳糖酶在乳品工業(yè)中的應(yīng)用。

1 特異性乳糖酶分類(lèi)及研究

特異性乳糖酶沒(méi)有嚴(yán)格的定義,它是基于乳糖酶的應(yīng)用背景,即在特定應(yīng)用環(huán)境中能保持高酶活和穩(wěn)定性的乳糖酶,可稱(chēng)為特異性乳糖酶。這需要乳糖酶具有耐高溫(>50 ℃)、低溫(<10 ℃),酶活高,耐酸性、耐鹽,酶活受溶劑影響小等特性。

1.1 耐熱乳糖酶的研究

一般把酶活最適溫度在50 ℃以上的乳糖酶稱(chēng)作耐熱乳糖酶。由于耐熱乳糖酶在高溫反應(yīng)條件下具有獨(dú)特的工業(yè)生產(chǎn)和應(yīng)用優(yōu)勢(shì),包括增加底物溶解度、提高反應(yīng)速率、減小水解產(chǎn)物對(duì)酶活的抑制作用、降低微生物的污染風(fēng)險(xiǎn)等,所以,相對(duì)于常溫乳糖酶,耐熱乳糖酶具有更強(qiáng)的應(yīng)用性[4]。

嗜熱細(xì)菌是產(chǎn)耐熱乳糖酶的重要來(lái)源,嗜熱細(xì)菌一般生長(zhǎng)溫度在55 ℃以上,以其為來(lái)源開(kāi)發(fā)的乳糖酶具有較好的耐熱穩(wěn)定性。Kong等[5]從嗜熱細(xì)菌中克隆了一個(gè)新的β-半乳糖苷酶基因,并在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)以產(chǎn)生β-半乳糖苷酶,結(jié)果發(fā)現(xiàn):重組酶在75～90 ℃表現(xiàn)出相當(dāng)高的熱穩(wěn)定性,重組酶在75、80、85和90 ℃下的半衰期分別為10.5、4.0、1.0和0.3 h。李云等[6]從芽孢桿菌中篩選到一株高產(chǎn)β-半乳糖苷酶的菌株,并對(duì)純化酶進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn):β-半乳糖苷酶的最適水解反應(yīng)溫度是60 ℃,而且70 ℃放置60 min后,酶活仍然保留65%,可見(jiàn),該β-半乳糖苷酶具有較高的熱穩(wěn)定性。乳酸克魯維酵母β-半乳糖苷酶的穩(wěn)定性差限制了它在低聚半乳糖合成和其他需要高溫操作中的應(yīng)用,Rico-Díaz等[7]為了獲得耐熱變體,通過(guò)在酶亞基之間引入二硫鍵的合理誘變策略獲得高活性菌株,與相同條件下的天然酶相比,耐熱穩(wěn)定性增強(qiáng)且半衰期也有所增加[7]。

1.2 低溫乳糖酶的研究

為實(shí)現(xiàn)乳品的冷鏈加工和運(yùn)輸,盡可能保留乳品的風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)成分,低乳糖牛乳的工業(yè)化生產(chǎn)首選低溫乳糖酶水解牛乳乳糖。理想的適合低乳糖牛乳加工的低溫乳糖酶應(yīng)該在低于10 ℃以下時(shí),仍具有較高的酶活,且催化活性不受水解產(chǎn)物半乳糖、葡萄糖以及牛乳中Na+和Ca2+影響。篩選適合在牛乳體系中高效水解乳糖的低溫乳糖酶,是低乳糖牛乳生產(chǎn)企業(yè)關(guān)注的焦點(diǎn),因此,在低溫下具有高活性的乳糖酶具有商業(yè)、經(jīng)濟(jì)和環(huán)境效益[8]。

大多數(shù)低溫乳糖酶來(lái)自嗜冷菌和節(jié)桿菌,因?yàn)槭壤渚L(zhǎng)期生長(zhǎng)在低溫環(huán)境下,最適生長(zhǎng)溫度低。如,關(guān)波等[9]利用嗜冷桿菌制備低溫乳糖酶,生產(chǎn)的乳糖酶在低溫下具有較高的酶活。拉杰等[10]制備了能夠在低溫下生產(chǎn)無(wú)乳糖或低乳糖產(chǎn)品的乳糖酶,這些乳糖酶不但具有相對(duì)高的酶活,而且在反應(yīng)時(shí)對(duì)溫度和pH的耐受性較好。張宇潔等[11]從天山中國(guó)一號(hào)冰川沉積物中分離出產(chǎn)低溫β-半乳糖苷酶的菌株,對(duì)其酶學(xué)特性研究后發(fā)現(xiàn):在4 ℃時(shí),該酶酶活為最大酶活的78%;10 mmol/L的Na+對(duì)酶活抑制作用不明顯,Ca2+對(duì)酶活具有激活作用。李夢(mèng)等[12]建立了一種符合微生物宏基因組文庫(kù)構(gòu)建要求的DNA提取方法,為低溫乳糖酶基因篩選奠定了基礎(chǔ)。姚從禹[13]從海洋微生物中克隆β-半乳糖苷酶,在大腸桿菌中進(jìn)行外源表達(dá),針對(duì)該酶在低溫下酶活好但不穩(wěn)定的特性,利用復(fù)合酶保護(hù)劑提高其穩(wěn)定性,使它能高效水解牛奶中的乳糖。

1.3 耐鹽乳糖酶的研究

乳清是生產(chǎn)干酪的副產(chǎn)物,直接排放會(huì)造成嚴(yán)重的環(huán)境污染。若利用乳糖酶水解乳清可合成低聚半乳糖,但乳清中含有的無(wú)機(jī)鹽會(huì)對(duì)乳糖酶的酶活造成一定的抑制作用,所以乳糖酶耐鹽能力影響其應(yīng)用前景。張文洪等[14]發(fā)現(xiàn),滇金絲猴糞便來(lái)源的β-半乳糖苷酶具有很好的NaCl穩(wěn)定性,經(jīng)4 mol/L的NaCl溶液處理1 h后,相對(duì)酶活保留率仍很高。Wang等[15]等通過(guò)篩選土壤宏基因組文庫(kù),獲得一種新的β-半乳糖苷酶基因,并將其在畢赤酵母中表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn),該酶在0 ℃不僅有好的活性,而且低濃度鹽溶液(10 mmol/L NaCl溶液)能提升酶活。Karan等[16]對(duì)南極洲深湖中的鹽藻鹵蟲(chóng)來(lái)源的β-半乳糖苷酶基因進(jìn)行克隆表達(dá),并表征酶學(xué)性質(zhì),結(jié)果發(fā)現(xiàn),該酶具有嗜冷和嗜鹽特性,且在4 mol/L NaCl溶液或20%(體積分?jǐn)?shù))有機(jī)溶劑中都有很好的穩(wěn)定性。

1.4 酸性乳糖酶的研究

在酸性條件下發(fā)揮最大酶活性的乳糖酶叫酸性乳糖酶,可用于生產(chǎn)乳糖酶制劑,能緩解機(jī)體乳糖不耐受[17]。酸性乳糖酶通過(guò)水解奶粉中的乳糖,可促進(jìn)牛奶有效成分的吸收和利用[18]。如,黑曲霉和米曲霉來(lái)源的乳糖酶酶活最適pH分別在3.0～4.0、4.5～5.1,適合干酪和酸性乳清的水解[19]。

1.5 耐溶劑化乳糖酶的研究

乳清粉是乳清干燥濃縮后產(chǎn)物,可利用乳糖酶將乳清粉中的乳糖水解成葡萄糖和半乳糖,而且釀酒酵母能以此為底物發(fā)酵制備乙醇[20],但乳糖酶的酶活在反應(yīng)中會(huì)受到乙醇溶劑的影響,繼而影響最終的生產(chǎn)效率。Karan等[21]發(fā)現(xiàn),極端嗜鹽古菌Halorubrumlacusprofundi來(lái)源的乳糖酶在體積分?jǐn)?shù)10%的乙醇溶液中穩(wěn)定且具有活性,高鹽濃度(4.5 mol/L NaCl)溶液對(duì)其活性沒(méi)有影響。Wang等[22]從新疆鹽堿地的菌中克隆并表達(dá)一個(gè)乳糖酶編碼基因galM,結(jié)果發(fā)現(xiàn),該酶在多種有機(jī)溶劑中仍能保持活性,并且對(duì)葡萄糖和半乳糖也具有良好的耐受性,可以此來(lái)生產(chǎn)生物乙醇。

2 特異性乳糖酶催化機(jī)制

特異性乳糖酶的催化機(jī)制主要有保持型機(jī)制和反轉(zhuǎn)型機(jī)制。目前普遍認(rèn)為特異性乳糖酶的催化機(jī)制是保持型水解機(jī)制[23]。特異性乳糖酶催化乳糖反應(yīng)可簡(jiǎn)單分為2個(gè)過(guò)程(圖1),分別是糖基化和去糖基化過(guò)程。親核氨基酸攻擊半乳糖苷鍵中心形成半乳糖基和酶的復(fù)合中間體,羧基基團(tuán)作為酸堿催化劑將質(zhì)子傳遞到糖苷鍵的氧原子上,同時(shí)釋放一分子葡萄糖,此為糖基化過(guò)程。復(fù)合中間體和水反應(yīng)生成半乳糖(水解反應(yīng)),復(fù)合中間體和糖分子或乳糖反應(yīng)時(shí)生成低聚半乳糖(轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)),水解反應(yīng)和轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)均為去糖化過(guò)程[24]。

圖1 特異性乳糖酶催化反應(yīng)機(jī)制[24]Fig.1 Characteristic lactase catalytic reaction mechanism[24]

3 特異性乳糖酶高產(chǎn)菌株選育

乳糖酶在乳制品中的應(yīng)用范圍廣,但傳統(tǒng)工業(yè)生產(chǎn)的乳糖酶產(chǎn)量低、生產(chǎn)成本高,因此不利于其廣泛應(yīng)用。為了獲得高產(chǎn)菌株,研究者們進(jìn)行了大量的研究,已經(jīng)取得一定的進(jìn)展[25-27]。特異性乳糖酶和乳糖酶的高產(chǎn)菌株選育技術(shù)類(lèi)似,主要集中在傳統(tǒng)理化誘變育種技術(shù)和基因工程技術(shù)。傳統(tǒng)理化誘變育種技術(shù)包括物理誘變技術(shù)、化學(xué)誘變技術(shù)和復(fù)合誘變技術(shù)。基因工程技術(shù)是將優(yōu)良的乳糖酶基因?qū)肷L(zhǎng)迅速且容易培養(yǎng)的微生物中,得到相應(yīng)的基因工程菌,進(jìn)一步通過(guò)對(duì)發(fā)酵條件優(yōu)化來(lái)提高乳糖酶生產(chǎn)量,從而降低生產(chǎn)成本。特異性乳糖酶異源表達(dá)系統(tǒng)主要有大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)和枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)。

3.1 傳統(tǒng)理化誘變育種技術(shù)

3.1.1 物理誘變技術(shù)

物理誘變是通過(guò)輻照處理使染色體缺失、重組或斷裂等,從而引起后代性狀產(chǎn)生變異[25],目前常用的誘變?cè)从猩渚€、超聲波和離子束等。紫外線照射是最簡(jiǎn)單的物理操作技術(shù),條件容易獲取且操作簡(jiǎn)單,常用于微生物的誘變處理。劉芳寧等[26]通過(guò)紫外照射對(duì)米曲霉進(jìn)行誘變實(shí)驗(yàn),獲得了最佳照射時(shí)間為15 min,繼而誘變篩選得到一株產(chǎn)乳糖酶能力增加幅度最大的突變株,酶活比初始菌株提高了49.22%。杜海英等[27]采用60Co-γ線誘變出發(fā)菌株的原生質(zhì)體,對(duì)黑曲霉進(jìn)行誘變,獲得高產(chǎn)高溫乳糖酶的突變菌株,最終突變菌株產(chǎn)特異性乳糖酶酶活是原始菌株的2.73倍。

相比較于傳統(tǒng)輻射源的突變頻率低、隨機(jī)性大等缺點(diǎn),常壓室溫等離子體技術(shù)(ARTP)應(yīng)運(yùn)而生,它具有誘變操作溫度低、突變快、多樣性高、與細(xì)胞作用明顯以及對(duì)環(huán)境要求低等優(yōu)點(diǎn)[28]。邱雯雯等[29]以ARTP誘變方式對(duì)乳酸克魯維酵母進(jìn)行不同時(shí)長(zhǎng)的誘變處理,得到4株高產(chǎn)乳糖酶的突變菌株,其酶活均大于原始菌株,其中最大乳糖酶酶活是原始菌株的2.8倍。

3.1.2 化學(xué)誘變技術(shù)

化學(xué)誘變是利用化學(xué)誘變劑使DNA烷基化損傷或堿基錯(cuò)配、置換從而引起突變的誘變技術(shù)?；瘜W(xué)誘變劑種類(lèi)很多,主要有亞硝基胍[30]、甲基磺酸乙酯[31]、硫酸二乙酯等[32]和2-脫氧葡萄糖[33]。Ibrahim等[34]使用化學(xué)誘變劑對(duì)2株雙歧桿菌進(jìn)行誘變后發(fā)現(xiàn),誘變菌株的產(chǎn)酶量比野生型增加2倍多。劉文玉等[35]通過(guò)亞硝基胍對(duì)野生低溫β-半乳糖苷酶產(chǎn)生菌株進(jìn)行誘變,篩選出產(chǎn)酶活比原始菌株提高54%的菌株。

與物理誘變相比,化學(xué)誘變一般是基因的點(diǎn)突變,對(duì)基因組的損傷小,突變點(diǎn)具有特異性,但是所用試劑一般具有毒性,使用時(shí)應(yīng)注意安全。

3.1.3 復(fù)合誘變技術(shù)

復(fù)合誘變技術(shù)一般同時(shí)采用2種及2種以上誘變技術(shù)進(jìn)行誘變,通過(guò)復(fù)合誘變可以解決單一誘變技術(shù)的局限性,增加基因突變類(lèi)型。復(fù)合誘變技術(shù)通常是物理誘變技術(shù)相互復(fù)合、物理誘變技術(shù)和化學(xué)誘變技術(shù)復(fù)合、化學(xué)技術(shù)相互復(fù)合。李寧等[36]采用紫外線和60Co-γ線協(xié)同誘變,選育出產(chǎn)高溫乳糖酶的高產(chǎn)黑曲霉菌株,突變株產(chǎn)酶能力和酶活均比出發(fā)菌株有所提高。劉文龍等[30]以米曲霉菌株作為出發(fā)菌株,采用紫外線和亞硝基胍復(fù)合誘變的手段,獲得一株遺傳穩(wěn)定性良好的高產(chǎn)乳糖酶菌株,其產(chǎn)乳糖酶酶活較初始菌株提高62.1%。高兆建等[37]通過(guò)微波輻照和亞硝基胍復(fù)合誘變,獲得高產(chǎn)突變菌株,產(chǎn)酶量比原始菌株的提高了115.92%。

3.2 基因工程技術(shù)

3.2.1 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)因具有良好的表達(dá)穩(wěn)定、遺傳機(jī)制研究清晰、生產(chǎn)周期短及易于放大培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn),在重組蛋白的表達(dá)方面有著廣泛應(yīng)用[38]。李宗顯等[39]利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)成功將克雷伯氏菌來(lái)源的乳糖酶基因誘導(dǎo)表達(dá)后,所產(chǎn)酶活比野生菌株的提升近10倍。Liu等[40]從凝結(jié)芽孢桿菌NL01中克隆了一種新的熱穩(wěn)定乳糖酶,在大腸桿菌中表達(dá),該酶顯示出優(yōu)于商業(yè)酶的乳糖水解能力。Li等[41]從海洋細(xì)菌Alteromonassp.中克隆了一個(gè)新的β-半乳糖苷酶基因(gal2A),在大腸桿菌中表達(dá),該酶表現(xiàn)出高轉(zhuǎn)糖基活性,可用于生產(chǎn)低聚半乳糖。

3.2.2 乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)

乳酸菌是一種安全級(jí)的益生菌,乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)作為一種原核表達(dá)系統(tǒng)[42],本身可產(chǎn)殺菌物質(zhì),無(wú)內(nèi)毒素產(chǎn)生,在安全性方面有著明顯的優(yōu)勢(shì)。Schwab等[43]將多種不同來(lái)源的乳糖酶基因轉(zhuǎn)入表達(dá)載體,并在乳酸乳球菌(Lactococcuslacti)中成功表達(dá),但該系統(tǒng)也存在以下不足:乳酸菌在工業(yè)生產(chǎn)的復(fù)雜環(huán)境中難以存活,外源基因在乳酸菌中表達(dá)后,一些分泌蛋白無(wú)法分泌而滯留在細(xì)胞壁上,影響目標(biāo)產(chǎn)品的提取效率。目前,乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)還沒(méi)有在工業(yè)上進(jìn)行大規(guī)模應(yīng)用。

3.2.3 酵母表達(dá)系統(tǒng)

酵母表達(dá)系統(tǒng)的純化步驟簡(jiǎn)單,具有良好的生物活性,重組產(chǎn)物不含內(nèi)毒素[44]。對(duì)于在原核表達(dá)系統(tǒng)中無(wú)活性蛋白和錯(cuò)誤折疊的蛋白,可以嘗試用酵母表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)。Becerra等[45]成功實(shí)現(xiàn)乳糖酶在釀酒酵母中的表達(dá)。王敏[46]將米曲霉來(lái)源的乳糖酶在乳酸克魯維酵母表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)并進(jìn)行條件優(yōu)化,最終酶活達(dá)142.57 U/mL。

畢赤酵母是酵母表達(dá)系統(tǒng)中最常用的表達(dá)宿主,利用甲醇作為碳源和能量來(lái)源。與釀酒酵母相比,畢赤酵母系統(tǒng)具有強(qiáng)大的分泌表達(dá)能力,表達(dá)的蛋白產(chǎn)量大、活性高、細(xì)胞外雜蛋白少且純化成本降低[47],適合用于商業(yè)化生產(chǎn)乳糖酶。侯重文等[48]將米曲霉來(lái)源的乳糖酶基因克隆到畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá),最終水解乳糖的酶活達(dá)530 U/mL。考慮到甲醇為碳源可能會(huì)導(dǎo)致殘留毒性和火災(zāi)等安全風(fēng)險(xiǎn),胡夢(mèng)凱等[49]等構(gòu)建了非甲醇誘導(dǎo)表達(dá)載體來(lái)改善畢赤酵母中乳糖酶的表達(dá)。

3.2.4 枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)

枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)雖具有不易混入內(nèi)毒素[50]、蛋白直接分泌到胞外、有利于后續(xù)的純化和生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn),但其存在轉(zhuǎn)化效率低、自身分泌的蛋白容易將目的蛋白降解等不足。田康明等[51]通過(guò)基因工程技術(shù)獲得了乳糖酶編碼基因及其重組酶,在枯草芽孢桿菌中表達(dá),獲得了具有較好低聚半乳糖生產(chǎn)能力的乳糖酶。

綜上可知,誘變育種操作簡(jiǎn)單,需要通過(guò)大量的誘變?cè)囼?yàn),利用高通量篩選方法從中篩選出高產(chǎn)菌株,但誘變育種致死率較高,一般應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室研究中?；蚬こ碳夹g(shù)能有效提高乳糖酶產(chǎn)量,從根本上解決乳糖酶產(chǎn)量問(wèn)題,適用于商業(yè)化生產(chǎn),但基因工程技術(shù)潛在的危害也不容忽視,需要通過(guò)進(jìn)一步研究對(duì)其進(jìn)行安全性論證。

4 乳糖酶定向進(jìn)化研究進(jìn)展

自然界野生型乳糖酶很難滿足現(xiàn)有應(yīng)用需求,通過(guò)定向進(jìn)化可獲取相關(guān)應(yīng)用需求的基因。許多理性和非理性的工程策略已成功應(yīng)用于優(yōu)化乳糖酶,包括定點(diǎn)突變、截短突變、位點(diǎn)飽和突變、隨機(jī)突變、DNA改組和酶蛋白的單體修飾[52]。乳糖酶在DNA或蛋白質(zhì)水平上的變化能獲得滿足其應(yīng)用環(huán)境的特性,如,減少產(chǎn)物抑制作用、提高熱穩(wěn)定性、改變產(chǎn)物成鍵類(lèi)型、提高乳糖酶轉(zhuǎn)糖苷能力,這極大地促進(jìn)了乳糖酶的應(yīng)用和發(fā)展。

4.1 減少產(chǎn)物抑制作用

在乳糖酶催化乳糖水解反應(yīng)時(shí),半乳糖需要在反應(yīng)過(guò)程中離開(kāi)酶活性位點(diǎn)以進(jìn)行持續(xù)催化。然而,半乳糖會(huì)因?yàn)榕c結(jié)合位點(diǎn)的相互作用而滯留在酶的活性位點(diǎn)上,從而導(dǎo)致產(chǎn)物抑制作用[53],難以實(shí)現(xiàn)高濃度乳糖的完全水解。因此,尋找耐半乳糖的乳糖酶一直是大家關(guān)注的熱點(diǎn)。Liu等[54]通過(guò)改變產(chǎn)物與酶相互作用相關(guān)殘基的定點(diǎn)突變來(lái)減輕產(chǎn)物抑制作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨著半乳糖和突變酶之間的親和力降低,突變酶在乳糖水解中具有潛在應(yīng)用價(jià)值。Zhao等[55]利用定點(diǎn)突變策略來(lái)生產(chǎn)富含低聚半乳糖的酸奶。Zhang等[56]通過(guò)蛋白質(zhì)修飾來(lái)改善乳糖酶特性,降低半乳糖抑制作用。

4.2 提高熱穩(wěn)定性

酶反應(yīng)還需要更高的操作穩(wěn)定性,尤其是在較高溫度下的工業(yè)應(yīng)用中。Ishikawa等[57]對(duì)乳糖酶進(jìn)行定點(diǎn)誘變,獲得了在60 ℃下具有更好熱穩(wěn)定性的三重突變體(K166P、G307P、A833P)[57]。Rico-Diaz等[7]通過(guò)在亞基界面引入半胱氨酸對(duì)乳酸桿菌來(lái)源的乳糖酶進(jìn)行合理突變,突變體 (R116C、T270C、G818C) 在45 ℃的半衰期提高了6.8倍,且催化活性提高;同時(shí)發(fā)現(xiàn),熱穩(wěn)定性和活性的提高可能與亞基之間形成二硫鍵有關(guān),有助于強(qiáng)化蛋白結(jié)構(gòu)。

4.3 改變產(chǎn)物成鍵類(lèi)型

乳糖酶的分子進(jìn)化也會(huì)影響產(chǎn)物的特異性,包括糖苷鍵和聚合狀態(tài)。Yin等[58]發(fā)現(xiàn),環(huán)狀芽孢桿菌來(lái)源的天然乳糖酶傾向于催化β-1,4鍵,通過(guò)飽和突變產(chǎn)生的突變體R484S和R484H能合成包含交替的β-1,3和β-1,4鍵的新低聚半乳糖結(jié)構(gòu),增加了產(chǎn)物成分中β-1,3鍵的比例。

4.4 提高乳糖酶轉(zhuǎn)糖苷能力

在乳糖酶催化低聚半乳糖反應(yīng)中,產(chǎn)物可繼續(xù)成為水解的底物,最終造成低聚半乳糖的產(chǎn)率較低。 對(duì)催化殘基外進(jìn)行定點(diǎn)誘變可以改善轉(zhuǎn)半乳糖基化的性質(zhì),但酶的水解活性不會(huì)完全消除。 Hassan等[59]對(duì)乳糖酶進(jìn)行合理設(shè)計(jì),獲得了與-1和+1亞位點(diǎn)相關(guān)的3個(gè)突變體(Y296F、F417S和F417Y),使低聚半乳糖產(chǎn)量由39.3%提高到50%以上[59]。同樣,Wu等[60]通過(guò)定點(diǎn)誘變來(lái)自S.solfataricusP2的乳糖酶獲得的2個(gè)突變體(F359Q 和 F441Y),以此生產(chǎn)低聚半乳糖的產(chǎn)率為58.3%和61.7%,而天然酶產(chǎn)率為50.9%[60]。

5 特異性乳糖酶應(yīng)用策略

乳糖酶作為一種食品添加劑,在乳品工業(yè)中應(yīng)用廣泛,可用于低聚半乳糖的生產(chǎn)[61]、無(wú)乳糖/低乳糖牛奶的生產(chǎn)[62]、乳制品副產(chǎn)物乳清的降解[63-64]和低乳糖冰激凌的生產(chǎn)[65]等。超濾膜對(duì)大分子低聚糖和生物酶有優(yōu)異阻隔作用,能有效用于游離特異性乳糖酶生產(chǎn)低聚半乳糖中所得的小分子低聚糖分離過(guò)程[66]。

雖然游離特異性乳糖酶的催化效果較好,但存在穩(wěn)定性差、不能重復(fù)使用等缺點(diǎn),導(dǎo)致生產(chǎn)目標(biāo)的成本增加。為了保證特異性乳糖酶的催化特性,可以采用固定化酶技術(shù)。固定化特異性乳糖酶是將特異性乳糖酶與載體相互作用,將特異性乳糖酶限制在一定的空間內(nèi)。特異性乳糖酶可通過(guò)物理和化學(xué)方法進(jìn)行固定。物理方法包括吸附法和包埋法,化學(xué)方法包括共價(jià)結(jié)合法和交聯(lián)法。一般采用吸附法將特異性乳糖酶固定在載體材料上,這樣可以最大限度保留特異性乳糖酶的“特性”,但酶與載體作用力不強(qiáng),容易脫落。交聯(lián)法是利用酶自身的雙功能團(tuán)結(jié)構(gòu)在交聯(lián)劑作用下連接起來(lái)的一種固定方法,是酶與載體結(jié)合最有效和最穩(wěn)定的方法之一,可使酶和載體間鍵合;也可在無(wú)載體情況下,使酶分子間形成聚合物。該法操作成本低,能防止酶泄露,但交聯(lián)反應(yīng)可能發(fā)生在酶的活性中心,從而使酶活降低或失活,降低固定化酶的回收率[67]。

為了提高特異性乳糖酶的固定化使用效率,有時(shí)將2種或2種以上的固定化方法聯(lián)用,如,吸附-交聯(lián)、包埋-交聯(lián)、吸附-包埋-交聯(lián)等。吸附法可以提高乳糖酶的固定化率,包埋-交聯(lián)相結(jié)合的方法能夠增加結(jié)合強(qiáng)度,可解決乳糖酶泄露和固定化乳糖酶操作穩(wěn)定性問(wèn)題。

6 結(jié)論與展望

特異性乳糖酶在乳品工業(yè)中的應(yīng)用是一個(gè)持續(xù)性研發(fā)熱點(diǎn),特異性乳糖酶的研究一直集中于從天然來(lái)源中篩選、基于應(yīng)用條件采用分子手段對(duì)其特性進(jìn)行調(diào)控和固定化應(yīng)用等方面。本文以特異性乳糖酶的應(yīng)用為出發(fā)點(diǎn),對(duì)特異性乳糖酶進(jìn)行介紹,從特異性乳糖酶的催化應(yīng)用、酶的生產(chǎn)、酶的定向進(jìn)化和應(yīng)用策略等方面進(jìn)行綜述。

特異性乳糖酶的分子調(diào)控技術(shù)(定點(diǎn)突變)極大地提高了轉(zhuǎn)糖基化活性和底物耐受性,擴(kuò)大了其應(yīng)用范圍。通過(guò)研究酶的三維結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系,開(kāi)發(fā)高效的高通量篩選方法來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)糖基化活性,可以加速商業(yè)化特異性乳糖酶的生產(chǎn)。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展,特異性乳糖酶的催化機(jī)制和調(diào)控機(jī)制會(huì)有更深入的研究,新的特異性乳糖酶基因也會(huì)不斷地被克隆和突變,應(yīng)逐漸提高其在食品工業(yè)方面的安全性研究。在實(shí)際應(yīng)用中,固定化特異性乳糖酶能很好地發(fā)揮其特性,但在固定化過(guò)程中會(huì)損失一部分特性,應(yīng)開(kāi)發(fā)新的固定化方法和應(yīng)用載體來(lái)保持或增加其催化特性。