快速樣品前處理技術(shù)-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定糧谷中7種真菌毒素

殷錫峰,梁紅芳,張文文,吳琴燕

(1. 鎮(zhèn)江市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)測試中心,江蘇 鎮(zhèn)江 212009;2. 江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所中心實(shí)驗(yàn)室,江蘇 句容 212400)

真菌毒素是真菌在特殊條件下產(chǎn)生的有毒次生代謝產(chǎn)物[1],目前已知真菌毒素有400多種,危害較大的主要有嘔吐毒素(DON)、黃曲霉毒素(AFT)、赭曲霉毒素(OTA)和玉米赤霉烯酮(ZEN)等[2-6],其不易被破壞,在加熱或加工過程中穩(wěn)定存在[7-10],是重要的慢性飲食危險(xiǎn)因素,過度食用會(huì)導(dǎo)致機(jī)體免疫抑制、器官損傷和生殖紊亂,對(duì)人類的生命安全造成嚴(yán)重威脅[11]。

目前真菌毒素檢測常用的凈化方法有固相萃取法、免疫親和柱法和超臨界萃取法,這些凈化方法常用于單一類真菌毒素的提取[12],而由美國農(nóng)業(yè)部Anastassiades 教授等于2003年開發(fā)的一種快速樣品前處理技術(shù)(quick、easy、cheap、effective、rugged和safe,QuEChER)憑借快速、簡單、便宜等優(yōu)勢,成為真菌毒素前處理的有效手段[13-14];超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)技術(shù)具有強(qiáng)大的分離能力和較高的靈敏度,是真菌毒素檢測領(lǐng)域最為可靠的定量定性分析方法[15]。行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)LS/T 6133—2018《糧油檢驗(yàn)主要谷物中16種真菌毒素的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》中給出了16種真菌毒素的同位素內(nèi)標(biāo)液質(zhì)聯(lián)用同時(shí)檢測方法,其前處理過程復(fù)雜,檢測成本高[16]。因此,確定一種經(jīng)濟(jì)、簡單的多種真菌毒素分析方法對(duì)糧食監(jiān)管和食品安全意義重大。

本研究綜合QuEChERS方法和UPLC-MS/MS技術(shù)的優(yōu)勢,快速凈化糧谷樣品中7種真菌毒素,在保證高回收率的情況下,簡化前處理步驟,以期實(shí)現(xiàn)糧谷樣品中7種真菌毒素的快速定性定量測定。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

4份小麥樣品于2021年收獲于鎮(zhèn)江農(nóng)科院行香科研基地,紅豆、玉米和花生等21份糧谷樣品購于本地零售超市和拼多多網(wǎng)上商城。

試劑及耗材:乙腈(色譜純),美國默克公司;乙酸銨(≥98%,色譜純),德國CNW公司;甲酸(≥99%)、氨水(≥25%)、乙酸按(≥99%),為液質(zhì)專用試劑,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;質(zhì)量濃度均為2.00 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品黃曲霉毒素B1(AFB1)、黃曲霉毒素B2(AFB2)、黃曲霉毒素G1(AFG1)和黃曲霉毒素G2(AFG2),上海源葉生物科技有限公司;10 mg/L赭曲霉毒素A(OTA)、100 mg/L玉米赤霉烯酮(ZEN)和100 mg/L嘔吐毒素(DON),美國romer國際貿(mào)易有限公司;質(zhì)譜用水為屈臣氏蒸餾水;N-丙基乙二胺(PSA)和石墨化碳(GCB),上海昕滬實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

分別取7種毒素標(biāo)樣0.2 mL,利用體積分?jǐn)?shù)84%的乙腈水溶液定容至20 mL,制成混合標(biāo)準(zhǔn)品母液。利用初始流動(dòng)相將混合標(biāo)準(zhǔn)品母液稀釋成適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品工作液,現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1290型UPLC系統(tǒng)、ABsciex 4500質(zhì)譜檢測器,安捷倫科技(中國)有限公司;H2050R型離心機(jī),湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司;AWL-020I-P型超純水系統(tǒng),艾科浦儀器有限公司;XP105DR 型電子天平,賽多利斯科學(xué)儀器有限公司。

1.3 色譜和質(zhì)譜條件

液相色譜柱為Agilent C18色譜柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μm),柱溫40 ℃,進(jìn)樣量1 μL,流速0.25 mL/min。梯度洗脫程序?yàn)?～1 min,90%水相(A);1～4.5 min,90%～10%A;4.5～6 min,10%A;6～6.10 min,10%～90%A;6.10～10 min,90%A。

離子源為電噴霧離子源;掃描方式為正負(fù)離子切換掃描;檢測方式為質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(MRM),氣簾氣為35;電噴電壓為5 500 V(或-4 500 V);溫度為450 ℃;氣體離子源1溫度為40 ℃;氣體離子源2溫度為40 ℃。其他優(yōu)化的質(zhì)譜條件表見表1。

表1 7種真菌毒素的MRM質(zhì)譜參數(shù)

1.4 色譜條件優(yōu)化及樣品前處理

1.4.1 色譜條件優(yōu)化

將8 μg/L的AFB1、AFB2、AFG1、AFG2 和OTA以及250 μg/L的 DON和ZEN制成混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液,以乙腈和水為流動(dòng)相,考察甲酸、氨水和乙酸銨添加量對(duì)水相中離子化效率的影響。

1.4.2 提取溶劑的優(yōu)化

準(zhǔn)確稱取粉碎的小麥樣品5 g于50 mL離心管中,樣品中添加混合標(biāo)準(zhǔn)品母液1 mL,加入提取溶劑乙腈(體積分?jǐn)?shù)84%)的水溶液20 mL,考察提取溶劑中甲酸(0、0.5%、1%、2%、4%和8%)對(duì)7種毒素加標(biāo)回收率的影響[17]。

1.4.3 凈化劑的優(yōu)化

小麥樣品加標(biāo)提取后,離心取2 mL上清液,分別按照0、10、20、35和50 mg/g小麥的量加入PSA和GCB,振蕩凈化30 min后,考察凈化劑及其用量對(duì)7種真菌毒素加標(biāo)回收的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動(dòng)相優(yōu)化結(jié)果

根據(jù)7種毒素化合物的理化性質(zhì),選擇乙腈為有機(jī)相,水相分別選擇5 mmol/L乙酸銨、5 mmol/L乙酸銨(含0.1%甲酸)和5 mmol/L乙酸銨(含0.01%氨水),正負(fù)離子切換掃描,7種毒素的離子響應(yīng)強(qiáng)度如表2所示。

表2 7種真菌毒素的質(zhì)譜離子響應(yīng)強(qiáng)度

通過在水相中添加少量的甲酸、乙酸銨和氨水改變流動(dòng)相的pH,可以改善峰形,提高質(zhì)譜離子化效應(yīng)[18],AFB1、AFB2、AFG1、AFG2 和OTA為正離子掃描,在酸性條件下易離子化;DON和ZEN為負(fù)離子掃描,在堿性條件下易離子化。由表2可知:由于DON在流動(dòng)相有甲酸的條件下無信號(hào),而在堿性流動(dòng)相條件下,AFB1、AFB2、AFG1、AFG2 和OTA仍有較高的響應(yīng)強(qiáng)度。

綜合考慮,采用乙腈和5 mmol/L乙酸銨(含0.01%氨水)為流動(dòng)相,通過優(yōu)化洗脫梯度,使色譜峰效果最佳,各毒素的色譜峰如圖1所示。

圖1 7種真菌毒素色譜圖Fig.1 The chromatogram of seven mycotoxins

2.2 方法的線性關(guān)系、檢出限和定量限

梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品母液2、4、8、16、32、64、128和256倍作為標(biāo)準(zhǔn)品溶液,以待測物的質(zhì)量濃度(X,μg/L)為橫坐標(biāo),定量離子的峰面積(Y)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,分別以3倍和10倍信噪比(S/N)所對(duì)應(yīng)的待測濃度計(jì)算檢出限(LODs)和定量限(LOQs),結(jié)果如表3所示。由表3可知:7種毒素在一定的范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.991,LODs為0.02～13.22 μg/L,LOQs為0.08～39.55 μg/L,符合實(shí)際檢測要求。

表3 7種真菌毒素的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.3 前處理?xiàng)l件優(yōu)化結(jié)果

2.3.1 提取劑的優(yōu)化結(jié)果

由于7種毒素化學(xué)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)不同,提取溶劑的選擇是檢測過程中最重要的環(huán)節(jié),直接影響回收率的高低。赭曲霉毒素和黃曲霉毒素多使用乙腈與水的混合液為提取劑,并加入一定的酸進(jìn)行酸化[19-20],本研究在提取溶劑中加入0～8.0%甲酸,考察不同酸體積分?jǐn)?shù)提取對(duì)7種真菌毒素回收率的影響,結(jié)果如表4所示。由表4可知:7種毒素在體積分?jǐn)?shù)0.5%甲酸提取時(shí)有較高的加標(biāo)回收率,AFB2和AFG2的加標(biāo)回收率均從65%左右分別顯著提高至72.32%和83.76%,而AFB2和AFG1的加標(biāo)回收率低于80%,需要進(jìn)一步凈化。

表4 不同酸濃度提取對(duì)7種真菌毒素回收率的影響

2.3.2 凈化劑優(yōu)化結(jié)果

因?yàn)樾←溨写嬖诖罅扛蓴_物(如色素、蛋白和糖等),需要對(duì)提取液進(jìn)行凈化,GCB 對(duì)色素具有強(qiáng)吸附效果,PSA可除去碳水化合物、有機(jī)酸和少量色素,是目前較為常用的凈化劑[12],因此本研究選取GCB和PSA作為QuEChERS凈化劑。2種凈化劑處理小麥加標(biāo)回收率如圖2所示。由圖2可知:GCB對(duì)OTA、ZEN、AFB1、AFB2、AFG1和AFG2均有強(qiáng)吸附作用,對(duì)DON無吸附,適合DON的凈化。當(dāng)PSA用量為20～50 mg/g時(shí),加標(biāo)回收率維持在83%～105%,說明PSA適合OTA、ZEN、DON、AFB1、AFB2、AFG1和AFG2 這7種毒素的凈化。

圖2 2種凈化劑用量對(duì)7種毒素加標(biāo)回收率的影響Fig.2 Effects of dosage of two sorbents on the recoveries of seven mycotoxins

因此,最終確定采用包含體積分?jǐn)?shù)0.5%甲酸的84%乙腈水溶液作為提取劑,PSA作為QuEChERS 凈化吸附劑。

2.4 不同糧谷樣品毒素檢測

2.4.1 不同糧谷加標(biāo)回收率

采用優(yōu)化的凈化方法,對(duì)小麥、大米、玉米、花生和綠豆這5種市售糧谷樣品進(jìn)行分析,加標(biāo)回收率如表5所示。由表5可知:7種真菌毒素的加標(biāo)回收率在84.15%～103.59%范圍內(nèi),均符合檢測要求,該方法適合多種糧谷樣品的真菌毒素檢測。

表5 不同種類糧谷中7種毒素的加標(biāo)回收率

2.4.2 實(shí)際樣品檢測

對(duì)市售的豆類、花生、面粉、大米、小麥及其成品粉狀商品共計(jì)25份樣品進(jìn)行檢測,結(jié)果如表6所示。由表6可知:DON在18份樣品中均有檢出,檢出率達(dá)80%,均未超出限量標(biāo)準(zhǔn);OTA、ZEN、AFB1和ABF2的檢出率分別為20%、28%、24%和12%;AFG1和AFG2均未檢出。OTA、ZEN和AFB1超標(biāo)率分別為8%、4%和16%,超標(biāo)樣品均為粉狀制品,說明糧谷深加工產(chǎn)品的毒素超標(biāo)風(fēng)險(xiǎn)較大,為確保糧食制品質(zhì)量安全,在加工環(huán)節(jié)中對(duì)真菌毒素污染物監(jiān)測具有重要意義。

表6 市售糧谷樣品7種毒素檢測結(jié)果

3 結(jié)論

建立了基于QuEChERS-UPLC-MS/MS檢測技術(shù)的糧谷樣品7種真菌毒素的快速檢測方法。在優(yōu)化色譜流動(dòng)相后,7種毒素?fù)碛休^好的峰形和較高的響應(yīng)強(qiáng)度;通過優(yōu)化提取溶劑和凈化方法,有效提高了方法的加標(biāo)回收率。該方法中7種毒素在各質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(R2>0.99),檢出限低,靈敏度高,適用于豆類、花生、玉米、大米和小麥5種樣品的真菌毒素檢測。利用本方法對(duì)25份糧谷樣品進(jìn)行檢測,OTA、ZEN、DON和AFB1檢出率較高。因此,需要加強(qiáng)對(duì)這4種真菌毒素的檢測和防護(hù),保障國家食品安全。