貽貝足蛋白fp-5在大腸桿菌中的表達(dá)、修飾與功能分析

姚 林,謝紫莎,王 瑞,2,張魯嘉,李 莎,2

(1. 南京工業(yè)大學(xué) 食品與輕工學(xué)院,江蘇 南京 211800;2. 南京工業(yè)大學(xué) 材料化學(xué)工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京211800;3. 華東師范大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院,上海 201100)

貽貝(mussel)多生長在寒溫帶,屬廣鹽性貝類,遍布世界各沿海國家,其分泌的足絲能夠形成足絲盤固定在海洋礁石上[1-2]。貽貝足絲的主要成分為貽貝足蛋白(Mfp),該蛋白具有卓越的黏附能力、良好的生物相容性和生物降解性,因此在生物醫(yī)藥領(lǐng)域作為一種生物膠黏劑被廣泛研究[3-4]。其中,3,4-二羥基苯丙氨酸(Dopa)在黏附中起到至關(guān)重要的作用,使Mfp能夠通過氫鍵、π-π/π-陽離子相互作用、靜電相互作用、氧化交聯(lián)和金屬-鄰苯二酚配位鍵與底物相互作用[5]。目前已經(jīng)報道的Mfp有6種(Mfp-1～Mfp-6),其中Mfp-5位于貽貝足底部與外界基層接觸部分,Dopa含量高達(dá)25%～30%,是發(fā)揮黏附作用的關(guān)鍵蛋白[6]。

在天然條件下,通過酸萃取法直接從貽貝足部獲得的蛋白量極少[7-8]。利用基因工程手段在大腸桿菌(E.coli)中合成貽貝足蛋白是一種可行的技術(shù),有望帶來巨大的經(jīng)濟(jì)和社會效益。然而,大腸桿菌細(xì)胞無法實(shí)現(xiàn)將酪氨酸殘基羥基化為Dopa的翻譯后修飾過程,而體外通過酪氨酸酶修飾存在效率低的缺陷。Choi等[9]將貽貝融合蛋白fp-151與來自抗生鏈霉菌(Streptomycesantibiocus)的酪氨酸酶(TyrSa)共表達(dá),得到cofp-151,與體外修飾蛋白相比,黏合強(qiáng)度提高了4倍。該研究為改善重組貽貝足蛋白的功能提供了新的思路,而高效的酪氨酸酶是實(shí)現(xiàn)這一過程的關(guān)鍵因素之一。同時,Streptomycescastaneoglobisporu具有更強(qiáng)的黑色素合成能力[10-11],來源于S.castaneoglobisporus的酪氨酸酶(TyrSc)活性更強(qiáng)。此外,來自多刺疣微菌(Verrucomicrobiumspinosum)的酪氨酸酶(TyrVs)可高效生產(chǎn)L-Dopa,有助于提升Mfp黏合性能[12]。

為了進(jìn)一步改善Mfp在真核表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)量低、在原核系統(tǒng)中缺乏至關(guān)重要的翻譯后修飾過程的問題,本研究在E.coli中表達(dá)地中海貽貝足蛋白(fp-5),同時將不同來源的酪氨酸酶(TyrSa、TyrSc、和TyrVs)與fp-5共表達(dá)進(jìn)行體內(nèi)修飾,并對修飾前后的fp-5蛋白測定修飾率和性能,以期為貽貝足蛋白的功能性表達(dá)與潛在應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

使用的菌株、質(zhì)粒和引物列于表1。大腸桿菌E.coliDH5α和大腸桿菌E.coliBL21(DE3)分別作為克隆宿主和表達(dá)宿主。密碼子優(yōu)化后的基因合成委托生工生物工程(上海)股份有限公司,引物合成及測序驗(yàn)證委托通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司。胰蛋白胨和酵母提取物,Oxoid公司;限制性核酸內(nèi)切酶和Primerstar Max聚合酶,ThermoFisher公司;4×SDS-PAGE上樣緩沖液和標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量Marker,寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司;來源于蘑菇的酪氨酸酶,上海阿拉丁生化科技股份有限公司。其他化學(xué)試劑均為市售分析純。

表1 本研究使用的菌株、質(zhì)粒和引物

1.2 方法

1.2.1 重組表達(dá)載體的構(gòu)建

從NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索得到貽貝足蛋白fp-5的cDNA基因mgfp-5序列(GenBank AY521220.1),并基于大腸桿菌的密碼子使用偏好進(jìn)行了密碼子優(yōu)化。根據(jù)模板基因序列和pET28a(+)載體設(shè)計(jì)引物P1和P2,擴(kuò)增成熟肽編碼區(qū)域。用1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,并回收mgfp-5基因,BamHⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶對pET28a(+)質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物雙酶切并膠回收,再將線性質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物在37 ℃下連接30 min,所得質(zhì)粒命名為pET28a(+)-fp5,在N端帶有6×His標(biāo)簽。

類似地,將編碼不同來源酪氨酸酶的DNA序列合成并分別插入pACYCDuet-1的BamHⅠ/HindⅢ 酶切位點(diǎn)和NdeⅠ/XhoⅠ 酶切位點(diǎn)(TyrSa/ORF438:GenBank M11582.1;TyrSc/ORF378:GenBank AY254101.1/GenBank AY254102.1);pETDuet-1的NdeⅠ/XhoⅠ 酶切位點(diǎn)(TyrVs:GenBank MK550618.1)。得到的質(zhì)粒分別命名為pACYC-TyrSa-438、pACYC-TyrSc-378和pETDuet-TyrVs。用引物對P3/P4從pET28a-fp5擴(kuò)增mgfp-5基因,連接到EcoR Ⅰ/HindⅢ 酶切的pETDuet-TyrVs線性載體上,得到質(zhì)粒pETDuet-TyrVs-fp5。

1.2.2 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化

用化學(xué)轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒pET28a-fp5轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中,產(chǎn)物在抗性平板(含25 μg/mL卡那霉素)上均勻涂布,37 ℃過夜培養(yǎng)后挑取單克隆進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證,驗(yàn)證正確的陽性克隆送至測序。

用CaCl2法制備工程菌E.coli(pET28a-fp5)感受態(tài),然后將pACYC-TyrSa-438、pACYC-TyrSc-378轉(zhuǎn)化至該感受態(tài)細(xì)胞,得到雙載體表達(dá)系統(tǒng)。將pETDuet-TyrVs-fp5轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,實(shí)現(xiàn)酪氨酸酶和fp-5共表達(dá)。同上述方法涂布在相應(yīng)抗性的平板并進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.3 重組貽貝足蛋白的表達(dá)純化

挑取測序正確的單克隆接種于5 mL含有25 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基(NaCl 10 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L)中,37 ℃、200 r/min過夜培養(yǎng)。將菌液按1%的接種量轉(zhuǎn)接至100 mL相應(yīng)抗性的LB液體培養(yǎng)基中,振蕩培養(yǎng)OD600達(dá)到0.6～0.8,加入誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度1 mmol/L,相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)6 h。發(fā)酵結(jié)束后在5 000 r/min、4 ℃下離心20 min收集菌體,并儲存在-80 ℃以供后續(xù)使用。

將收集的菌體用磷酸緩沖鹽液(PBS)洗滌,參照文獻(xiàn)[13]純化目的蛋白。用Bradford法檢測蛋白質(zhì)含量后冷凍干燥,-80 ℃保存。

1.2.4 重組貽貝足蛋白的修飾

1)NBT/Gly染色試驗(yàn)。由于硝基藍(lán)四氮唑(NBT)在堿性條件下發(fā)生氧化還原反應(yīng)具有染色能力,因此常用NBT/Gly染色法檢測多巴和多巴醌的存在。將凍干蛋白粉重溶在0.1 mol/L PBS(pH 7.0)中,使用10 U來源于雙孢蘑菇的商品化酪氨酸酶室溫下振蕩修飾6 h,得到體外酪氨酸酶修飾的fp-5(mfp-5)。牛血清白蛋白(BSA)為陰性對照,分別將2 μL質(zhì)量濃度為1 mg/mL的蛋白溶液滴在PVDF膜表面,37 ℃下過度干燥后,參照文獻(xiàn) [13]進(jìn)行染色試驗(yàn)。

2)差異光譜法。為了定量酪氨酸酶修飾的fp-5中的Dopa含量,酸-硼酸鹽差異光譜法測定。在堿性pH下Dopa與硼酸鹽配位化合,因此紫外吸收光值更高。用紫外-可見分光光度計(jì)測量1 mmol/L Dopa標(biāo)準(zhǔn)品和修飾后fp-5分別在0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L硼酸鈉中250～350 nm波長處的吸光值。用樣品在0.1 mol/L硼酸鈉中292 nm處的吸光值減去0.1 mol/L HCl中的吸光值,得到差異光譜值。根據(jù)比爾定律(式(1))計(jì)算樣品中Dopa的濃度。

A=εbc

(1)

式中:A—Dopa在292 nm下的吸光差值;ε—摩爾吸光系數(shù),3 200 L/(mol·cm);b—吸收層厚度,cm;c—Dopa的濃度,mol/L。

再以蛋白濃度計(jì)算得到Dopa的數(shù)量,每個fp-5分子含有20個酪氨酸殘基,由此得到修飾率[14]。

1.2.5 重組貽貝足蛋白的功能分析

1)附著力。研究了未修飾和修飾fp-5在不同類型材料表面的涂層能力。具體涂層顯色過程參照文獻(xiàn)[15],增設(shè)了聚苯乙烯和聚乙烯兩種較玻璃具有不同親疏水性的材料。通過Gel-Pro Analyzer軟件(Media Cybernatics,version 4.0.0.4)對蛋白斑點(diǎn)圖像進(jìn)行掃描分析,比較斑點(diǎn)強(qiáng)度。每個樣品重復(fù)測量3次。

2)黏附力。通過Mfp黏結(jié)兩塊鋁片(寬10 mm×長 100 mm)的搭接剪切實(shí)驗(yàn),可以測量Mfp的大規(guī)模黏附強(qiáng)度。將鋁片依次浸泡在正己烷、丙酮、乙醇和MQ水中15 min,清潔鋁片表面[16]。在室溫下干燥過夜后,在每個鋁片黏附端滴加10 μL的50 g/L乙酸溶液,將5 mg凍干蛋白粉溶解并用抹刀均勻涂抹,2個鋁片覆蓋重疊(10 mm × 10 mm)。為保證重疊區(qū)貼合均勻,用夾子固定,放入37 ℃培養(yǎng)箱3 h進(jìn)一步交聯(lián)。用萬能材料試驗(yàn)機(jī)測量剪切力,用100 N稱重傳感器,剪切方向的速度為 2 mm/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 序列分析及重組質(zhì)粒的構(gòu)建

用Signalp-5.0在線軟件[17]進(jìn)行信號肽預(yù)測,通過Neighbor-Joining方法,對細(xì)菌和真菌來源的酪氨酸酶進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析,并對重組載體進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果見圖1。由圖1可知:fp-5的成熟肽區(qū)域由76個氨基酸構(gòu)成。經(jīng)NCBI同源性比對,貽貝5型足蛋白具有高度保守序列,來源于紫貽貝(Mytilusedulis)和地中海貽貝(Mytilusgalloprovincialis)的5型足蛋白的氨基酸序列幾乎一致。來源于Verrucomicrobium屬、Strepthomyces屬和Agaricus屬的酪氨酸酶處于不同進(jìn)化枝,其中TyrSa和TyrSc處于相對近距離進(jìn)化枝。為了實(shí)現(xiàn)重組TyrSa/TyrSc的功能表達(dá),插入ORF438/ORF378片段,它們可以促進(jìn)Cu2+進(jìn)入活性位點(diǎn)以具有酶活[18]。如果表達(dá)TyrVs去除C端延伸區(qū)的截?cái)嗖糠?酶活會更高[19]。

圖1 序列分析及重組載體的驗(yàn)證Fig.1 Sequence analysis and verification of recombinant vector

通過PCR從克隆質(zhì)粒擴(kuò)增目的基因片段,fp-5、TyrSa、ORF438、TyrSc、ORF378和TyrVs的基因片段的理論大小分別為250、822、441、822、381和1 011 bp。對構(gòu)建的重組載體進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證,條帶大小與預(yù)期一致(圖1(d))。再將構(gòu)建的質(zhì)粒送至公司測序驗(yàn)證,插入序列正確,表明重組表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.2 重組貽貝足蛋白的表達(dá)與純化

圖2為重組貽貝足蛋白的表達(dá)與純化結(jié)果。由圖2可知:E.coli(pET28a-fp5)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后能夠表達(dá)分子量～1.24×104的可溶蛋白fp-5,與理論分子量一致,表達(dá)量約為總蛋白量的51%,產(chǎn)量約為19.3 mg/L。N端融合6×His標(biāo)簽的fp-5經(jīng)Ni柱親和層析純化,洗脫得到純度約98%的目的蛋白(圖2(b)),在雙載體和單載體系統(tǒng)中,重組fp-5蛋白與來源于細(xì)菌的酪氨酸酶成功共表達(dá),體內(nèi)修飾fp-5(cofp-5)和TyrVs(～3.80×104)以可溶形式表達(dá),而TyrSa(～3.24×104)和TyrSc(～3.27×104)大部分表達(dá)為包涵體,cofp-5在單載體表達(dá)系統(tǒng)中的分子量(～1.07×104)小于雙載體系統(tǒng)中的分子量(～1.24×104)。ORF438(～1.49×104)或 ORF378(～1.30×104)的分子量與cofp-5相似,因此,它們不能通過SDS-PAGE清楚地區(qū)分。當(dāng)單獨(dú)攜帶pACYC-TyrSa-438或pACYC-TyrSc-378質(zhì)粒的大腸桿菌表達(dá)時,ORF438或ORF378僅以不溶性形式存在(數(shù)據(jù)未顯示)。

圖2 重組蛋白的表達(dá)與純化SDS-PAGE電泳圖Fig.2 SDS-PAGE analysis of recombinant protein expression and purification

2.3 重組貽貝足蛋白的修飾分析

通過NBT/Gly氧化還原循環(huán)染色方法,定性檢測Dopa殘基,不同顏色強(qiáng)度的斑點(diǎn)反映了不同水平的Dopa含量,結(jié)果見圖3(a)。由圖3(a)可知:作為陰性對照的BSA和缺乏Dopa的未修飾fp-5完全沒有被染色,體外修飾的mfp-5可以看到一個淡藍(lán)紫色的斑點(diǎn),與TyrSa體內(nèi)修飾的cofp-5(5-Sa)顏色強(qiáng)度相近。此外,TyrSc體內(nèi)修飾的cofp-5(5-Sc)顏色較淺,而TyrVs體內(nèi)修飾的cofp-5(5-Vs)顯示出最強(qiáng)的藍(lán)紫色斑點(diǎn)。由此可見,不同修飾方式和酪氨酸酶能夠?qū)p-5蛋白的酪氨酸殘基進(jìn)行不同程度的修飾。

圖3 cofp-5中酪氨酸殘基修飾的分析Fig.3 Analysis of tyrosine modifications in cofp-5

進(jìn)一步比較3種表達(dá)系統(tǒng)中cofp-5的產(chǎn)量和酪氨酸的修飾率,結(jié)果見圖3(b)。由圖3(b)可知:體內(nèi)修飾蛋白5-Vs、5-Sa和5-Sc的產(chǎn)量分別為18.6、27.2和19.1 mg/L。該產(chǎn)量低于先前文獻(xiàn)[20]的fp-5產(chǎn)量(4.5 L培養(yǎng)物產(chǎn)量約為50 mg/L),可能是由于搖瓶試驗(yàn)和發(fā)酵罐發(fā)酵工藝的不同,其中5-Vs表達(dá)量的降低可能是由于TyrVs的大量可溶表達(dá)。

通過酸-硼酸鹽差異光譜分析定量體內(nèi)修飾cofp-5中Dopa,結(jié)果見圖3(b)。由圖3(b)可知:5-Vs中的20個酪氨酸殘基中約有11個羥基化為Dopa,修飾率約為55.20%,高于5-Sa(約15.70%)和5-Sc(約26.00%)。目前僅有報道對共表達(dá)修飾前后的黏附性進(jìn)行測試,而未進(jìn)一步分析修飾率[9]?？傮w而言,采用共表達(dá)體內(nèi)修飾與體外修飾的貽貝足蛋白(9.6%)相比[21],修飾率顯著提高。

2.4 重組貽貝足蛋白在不同表面的附著力

為了研究不同酪氨酸修飾率的fp-5蛋白的附著和涂層性能,本研究對BSA、mBSA(體外修飾的BSA)、fp-5、mfp-5(體外修飾的fp-5)、5-Vs、5-Sa和5-Sc進(jìn)行了對比分析。分別將這幾種蛋白質(zhì)溶液滴在不同種材料的表面,即載玻片(glass)、聚苯乙烯板(PS)和聚乙烯薄膜(PE)。通過振蕩沖洗后考馬斯亮藍(lán)染色,研究蛋白附著力強(qiáng)度,結(jié)果如圖4(a)、4(b)和4(c)所示。由圖4(a)～(c)可知:BSA和mBSA被完全沖掉,未修飾和修飾的fp-5不同程度地黏附在所有測試基材上。修飾后的fp-5表現(xiàn)出顯著的表面包覆能力,而未修飾的fp-5輕微黏附在表面,這表明Dopa不是促成Mfp黏附特性的唯一因素[22]。已有的研究僅對Mfp(fp-5[23]和fp-3[15])體外修飾前后在玻璃表面的附著力進(jìn)行測試,其中fp-5的附著強(qiáng)度僅通過肉眼觀察比較。選取不同親疏水性表面,通過軟件分析斑點(diǎn)強(qiáng)度,發(fā)現(xiàn)在更疏水的表面,Dopa對附著力影響更大,這可能是由于Dopa含有大量的芳香結(jié)構(gòu),通過疏水相互作用附著在疏水材料表面,在Dopa氧化自聚合過程中,逐漸形成更大的共軛結(jié)構(gòu),疏水作用顯著增強(qiáng)。

圖4 修飾/未修飾fp-5在各種表面涂層分析Fig.4 Recombinant fp-5 with or without tyrosinase modified coating to various surfaces

通過Gel-Pro軟件對蛋白斑點(diǎn)強(qiáng)度進(jìn)行分析,結(jié)果如圖4(d)～4(f)所示。由圖4(d)～4(f)可知:5-Vs的蛋白斑點(diǎn)顏色在所有材料表面相對較深。這說明通過酪氨酸酶共表達(dá)修飾,將酪氨酸殘基羥基化為Dopa,Dopa通過π-π/π-陽離子相互作用,從而一定程度提升了重組貽貝足蛋白的附著力。

2.5 重組貽貝足蛋白的黏附強(qiáng)度

為了量化重組貽貝足蛋白的大規(guī)模黏附水平,通過搭接剪切試驗(yàn),分別對fp-5、5-Vs、5-Sa和5-Sc黏附鋁片的情況進(jìn)行研究,結(jié)果如圖5(a)所示。對5-Vs進(jìn)行黏附試驗(yàn),結(jié)果見圖5(b)。由圖5(a)可知:未修飾fp-5的剪切強(qiáng)度為(0.07±0.002) MPa,而5-Sa((0.08±0.030) MPa)和5-Sc((0.14±0.006) MPa)的剪切強(qiáng)度值略高于未修飾fp-5的。值得注意的是,cofp-5中黏附強(qiáng)度最大的為5-Vs((0.32±0.02) MPa),約為未修飾的fp-5的4.6倍。這是由于酪氨酸酶體內(nèi)修飾后,Dopa通過形成金屬-鄰苯二酚配位鍵增強(qiáng)黏附作用。盡管cofp-5的整體黏附強(qiáng)度小于之前的文獻(xiàn)報道,其中fp-5的強(qiáng)度為1.11 MPa[20],但這些研究是在不同的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行的,并且先前的研究未測試修飾后的黏附強(qiáng)度,難以直接進(jìn)行比較。由圖5(b)可知:力-距離曲線的最高點(diǎn)為黏合頭的物理斷裂處,后逐漸下降。綜上,采用來源于多刺疣微菌的酪氨酸酶體內(nèi)修飾fp-5的策略獲得了具有強(qiáng)黏附特性的貽貝蛋白(5-Vs)。

圖5 fp-5和cofp-5的大規(guī)模黏附強(qiáng)度Fig.5 Bulk-scale adhesive strength of fp-5 and cofp-5

3 結(jié)論

在E.coli中實(shí)現(xiàn)fp-5的共表達(dá)修飾,并對修飾率和黏附性進(jìn)行定量分析,主要結(jié)論如下:

1)成功在大腸桿菌中共表達(dá)fp-5和酪氨酸酶,實(shí)現(xiàn)酪氨酸殘基體內(nèi)羥基化為Mfp黏附過程中的關(guān)鍵物質(zhì)Dopa。

2)比較不同體內(nèi)修飾cofp-5的產(chǎn)量和修飾率,篩選出最佳共表達(dá)系統(tǒng),蛋白5-Vs產(chǎn)量18.6 mg/L,修飾率約為55.20%,遠(yuǎn)高于體外修飾效率。

3)對5-Vs附著力和黏附強(qiáng)度進(jìn)行評價,黏附力約為未修飾fp-5的4.6倍,有望作為生物黏合劑應(yīng)用于生物醫(yī)用材料等領(lǐng)域。