強(qiáng)志組方調(diào)控PI3K/Akt/TNF-α信號(hào)通路干預(yù)抽動(dòng)障礙的實(shí)驗(yàn)研究

詹婷，姜韞赟，王妹，靳無菲，李婷，閻兆君

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250014）

抽動(dòng)障礙（tic disorder，TD）是一類常見于兒童與青少年的突然的、反復(fù)出現(xiàn)的、無節(jié)律的以運(yùn)動(dòng)或發(fā)聲為主的神經(jīng)精神障礙性疾病［1］。本病病情復(fù)雜，常伴注意力缺陷多動(dòng)障礙、強(qiáng)迫障礙、睡眠障礙等，對(duì)患者的生活質(zhì)量與身心健康造成不良影響。最新的全國精神病學(xué)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，我國兒童及青少年抽動(dòng)障礙的發(fā)病率為2.5%，且發(fā)病率呈上升趨勢(shì)［2］。西醫(yī)以藥物治療為主，但患者治療后不良反應(yīng)及復(fù)發(fā)率較高，遠(yuǎn)期預(yù)后較差［3］，而中醫(yī)藥治療具有不良反應(yīng)小、無依賴性的優(yōu)點(diǎn)，在臨床運(yùn)用廣泛。閻兆君教授在研究中醫(yī)文獻(xiàn)和長(zhǎng)期臨床實(shí)踐基礎(chǔ)上，基于《黃帝內(nèi)經(jīng)》從志意辨證角度出發(fā)，提出TD患者病機(jī)為“腎志不足”，以益腎強(qiáng)志為主要治法，自擬強(qiáng)志組方治療TD患兒。強(qiáng)志組方由制巴戟天、制遠(yuǎn)志、清半夏、山藥、木香、茯神、生白術(shù)組成，具有強(qiáng)志定意、安魂助勇的功效［4］。Meta分析結(jié)果顯示，強(qiáng)志組方治療TD具有較好療效［5］。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究顯示，強(qiáng)志組方主要作用在多巴胺系統(tǒng)、感染、炎癥反應(yīng)以及miRNA通路，PI3K/Akt、雌激素、腫瘤壞死因子信號(hào)通路三個(gè)重要途徑參與強(qiáng)志組方對(duì)TD的治療［6］。磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/腫瘤壞死因子（TNF-α）信號(hào)通路與TD的關(guān)聯(lián)已在實(shí)驗(yàn)中得到驗(yàn)證［7］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，強(qiáng)志組方通過作用于大鼠DA、NE系統(tǒng)，能明顯緩解大鼠的抽動(dòng)癥狀與刻板行為［8-9］。為進(jìn)一步研究強(qiáng)志組方治療TD的作用機(jī)制，本研究以PI3K/Akt/TNF-α信號(hào)通路為出發(fā)點(diǎn)，探究TD的發(fā)病機(jī)制，進(jìn)一步研究強(qiáng)志組方通過PI3K/Akt/TNF-α信號(hào)對(duì)TD模型大鼠的影響，為強(qiáng)志組方的臨床運(yùn)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠 42只（北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司），3～8周齡，體質(zhì)量（200±20）g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXK（京）2021-0011。飼養(yǎng)于山東中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)動(dòng)物房，溫度（23±2）℃，濕度（55±5）%，12 h光照/黑暗循環(huán)（08：00～20：00），自由進(jìn)食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理批號(hào)：SDUTCM20220224001）。

1.2 藥物

強(qiáng)志組方組成：制巴戟天9 g，制遠(yuǎn)志9 g，清半夏9 g，山藥24 g，木香6 g，茯神24 g，生白術(shù)18 g；飲片由亳州市滬譙藥業(yè)有限公司提供。使用純水浸泡飲片30 min后置于砂鍋內(nèi)，加入藥材5倍量的水，煎煮2次，每次30 min。將2次藥液混合，制備成含生藥量為1 g/mL的藥液，保存于4 ℃冰箱備用。鹽酸硫必利片（江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：LY210105），藥物研磨成粉后，制備成0.1 mg/mL的硫必利混懸液。亞氨基二丙腈（iminodipropionitrile，IDPN）（美國Sigma公司，批號(hào)：317306），將IDPN溶液稀釋至30 mg/mL備用。

1.3 主要試劑與儀器

BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：P0010S）；RIPA組織/細(xì)胞裂解液、脫脂奶粉（北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：R0020、D8340）；磷酸酶抑制劑（美國APEXBIO公司，貨號(hào)：K1015）；PVDF 膜（德國 Millipore公司，貨號(hào)：IPVH00005）；PI3K、Akt、p-Akt、TNF-α兔單克隆抗體（英國Abcam公司，貨號(hào)：ab191606、ab179463、ab192623、ab205587）；GAPDH 兔多克隆抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：10494-1-AP）；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體（北京中衫金橋有限公司，貨號(hào)：ZB2301）；ECL超靈敏化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒（上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司，貨號(hào)：SQ202）；多色熒光成像系統(tǒng)（美國GE公司，型號(hào)：GE Amersham Imager600）；總RNA提取試劑（Biosharp生物公司，貨號(hào)：BS259A）；快速逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（上海奕衫生物科技有限公司，貨號(hào)：RT001）；SYBR Green Fast qPCR Mix（ABclonal生物科技有限公司，貨號(hào)：RX21203）；PI3K、Akt、TNF-α引物（上海生工生物工程股份有限公司，貨號(hào)：2413357427、2413357429、2413357431）；TNFα、IL-6酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒（上海江萊生物科技有限公司，貨號(hào)：JL13202、JL20884）；SuperMaze動(dòng)物行為分析系統(tǒng)（上海欣軟有限公司，型號(hào)：XR-Xmaze）；紫外分光光度計(jì)（美國Thermo Scientific公司，型號(hào)：NANODROP 2000）；PCR儀（美國BIO-RAD公司，型號(hào)：T100）；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國BioTek公司，型號(hào)：BioTek Cytation5）。

2 方法

2.1 動(dòng)物模型復(fù)制及評(píng)價(jià)

采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為空白組（7只）與造模組（35只）。除空白組外，其余大鼠依據(jù)文獻(xiàn)［10］的方法腹腔注射IDPN 300 mg/（kg·d）制備模型，連續(xù)7 d。根據(jù)文獻(xiàn)［11-12］中對(duì)造模組大鼠進(jìn)行刻板行為與運(yùn)動(dòng)行為進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分 ≥ 2分時(shí)，說明大鼠造模成功。

2.2 動(dòng)物分組與給藥

造模成功后的大鼠隨機(jī)分為模型組、硫必利組和強(qiáng)志組方低、中、高劑量組，每組7只。按照人鼠等效劑量換算［13］，強(qiáng)志組方低、中、高劑量組分別按照4.455、8.91、17.82 g/（kg·d）劑量灌胃強(qiáng)志組方水煎液，硫必利組給予0.027 g/（kg·d）硫必利混懸液，空白組與模型組大鼠給予等劑量生理鹽水，連續(xù)干預(yù)28 d。

2.3 行為學(xué)測(cè)試

2.3.1 運(yùn)動(dòng)行為評(píng)分

參考文獻(xiàn)中［11］的評(píng)分方法，在造模前、造模后、灌胃28 d后對(duì)大鼠進(jìn)行運(yùn)動(dòng)行為評(píng)分。先用75%乙醇清潔鼠籠，將大鼠放入鼠籠內(nèi)適應(yīng)10 min。采用雙盲法，由兩名不知道動(dòng)物分組信息的實(shí)驗(yàn)人員觀察20 min，并記錄評(píng)分，最終結(jié)果取兩名實(shí)驗(yàn)人員評(píng)分的平均值。0分：安靜或正常活動(dòng)；1分：過度興奮表現(xiàn)；2分：探索行為增加，不連續(xù)吸鼻；3分：不停跑動(dòng)；4分：不停跑動(dòng)伴驚跳。

2.3.2 刻板行為評(píng)分

根據(jù)Diamond等［12］的方法，在造模前、造模后、灌胃28 d后對(duì)大鼠進(jìn)行刻板行為評(píng)分。先用75%乙醇清潔鼠籠，將大鼠放入清潔干燥的鼠籠里適應(yīng)10 min，采用雙盲法，由兩名不知道動(dòng)物分組信息的實(shí)驗(yàn)人員觀察20 min，并記錄評(píng)分，最終結(jié)果取兩名實(shí)驗(yàn)人員評(píng)分的平均值。0 分：無刻板行為；1 分：旋轉(zhuǎn)行為；2 分：頭和頸部過多垂直運(yùn)動(dòng)；3 分：頭、頸部的垂直運(yùn)動(dòng)和旋轉(zhuǎn)行為；4 分：頭部側(cè)擺合并頭頸部的垂直運(yùn)動(dòng)過多。

2.4 標(biāo)本采集

末次給藥后，大鼠禁食不禁水8 h，采用2%戊巴比妥鈉，2 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠。大鼠腹主動(dòng)脈取血4 mL，靜置后離心備用。將大鼠斷頭，冰盒上剝離雙側(cè)紋狀體組織，急投液氮，取材完成后放入-80 ℃冰箱保存用于后續(xù)檢測(cè)。

2.5 Western blot檢測(cè)大鼠紋狀體PI3K、Akt、TNF-α蛋白表達(dá)水平

將紋狀體組織稱重后加入組織裂解液、PMSF、磷酸酶抑制劑，放入鋼珠后研磨提取蛋白。BCA法檢測(cè)蛋白濃度，根據(jù)濃度，加入5×loading buffer與PBS，金屬浴95 ℃加熱5 min使其變性后備用。采用制膠試劑盒制膠后，準(zhǔn)備電泳，依次上樣各組蛋白樣本與Marker。電泳結(jié)束后采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST沖洗后裁膜放入一抗PI3K、Akt、p-Akt、TNF-α、GAPDH（1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶5 000），4 ℃孵育過夜后。TBST沖洗3次，室溫二抗搖床孵育1 h。TBST沖洗3次后，均勻滴加ECL顯影液后進(jìn)行顯影，以全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)掃描。用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，目的蛋白灰度值比上內(nèi)參灰度值即樣本蛋白的相對(duì)表達(dá)量，磷酸化指標(biāo)用磷酸化蛋白比上總蛋白計(jì)算該蛋白的表達(dá)是否改變。

2.6 qPCR檢測(cè)大鼠紋狀體PI3K、Akt、TNF-α mRNA表達(dá)水平

稱取10～20 mg的紋狀體組織置于研磨管，TRIZOL法提取RNA，Nanodrop檢測(cè)其濃度，使用快速逆轉(zhuǎn)錄試劑盒配制反應(yīng)體系，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，引物由上海生工有限公司設(shè)計(jì)合成，見表1。按照說明書，設(shè)定程序進(jìn)行于實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)程序如下：95 ℃預(yù)變性 3 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃ 5 s，45個(gè)循環(huán)；60 ℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)。反應(yīng)完成得到CT值，將GAPDH作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計(jì)算出樣本mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表1 PCR引物序列

ΔCT=目的基因CT值 - 內(nèi)參基因CT值

ΔΔCT=實(shí)驗(yàn)組ΔCT值 - 對(duì)照組ΔCT

2.7 ELISA檢測(cè)大鼠血清IL-6、TNF-α含量

使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒測(cè)定。血液樣本稀釋5倍后待用，將標(biāo)準(zhǔn)品按照說明書進(jìn)行梯度稀釋，加樣后，37 ℃恒溫箱內(nèi)孵育1 h后棄液。每孔加入抗體工作液，孵育1 h后棄液，洗板3次。每孔加入濃縮酶結(jié)合物，孵育1 h后棄液，洗板5次。加入底物，避光孵育1 h，加入終止液，在酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)得各孔OD值。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS27.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，三個(gè)及以上獨(dú)立樣本均值差異采用F檢驗(yàn)（單因素方差分析），結(jié)果P＜ 0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠行為學(xué)結(jié)果比較

3.1.1 運(yùn)動(dòng)行為評(píng)分比較

造模后，與空白組比較，造模組大鼠出現(xiàn)異常運(yùn)動(dòng)行為。藥物干預(yù)28 d后，與模型組比較，硫必利組與強(qiáng)志組方各劑量組大鼠運(yùn)動(dòng)行為評(píng)分顯著降低（P＜0.001）。見表2。

表2 各組大鼠運(yùn)動(dòng)行為評(píng)分比較（±s，分）

表2 各組大鼠運(yùn)動(dòng)行為評(píng)分比較（±s，分）

注：與空白組比較，***P ＜ 0.001；與模型組比較，###P ＜ 0.001。

組別空白組模型組硫必利組強(qiáng)志組方低劑量組強(qiáng)志組方中劑量組強(qiáng)志組方高劑量組造模28 d后0 3.23±0.40 2.19±0.25###2.41±0.37###1.96±0.34###1.93±0.37###n7 7 7 7 7 7造模前0 0 0 0 0 0造模后0 2.86±0.30***2.89±0.33***2.89±0.20***2.82±0.27***2.93±0.34***

3.1.2 刻板行為評(píng)分比較

造模前，各組大鼠未發(fā)現(xiàn)刻板行為。造模后，除空白組外其余各組大鼠均出現(xiàn)不同程度的刻板行為。藥物干預(yù)28 d后，與模型組比較，硫必利組、強(qiáng)志組方各劑量組大鼠刻板行為評(píng)分降低（P＜ 0.05）。見表3。

表3 各組大鼠刻板行為評(píng)分比較（±s，分）

表3 各組大鼠刻板行為評(píng)分比較（±s，分）

注：與空白組比較，***P ＜ 0.001；與模型組比較，#P ＜ 0.05。

造模前造模28 d后0 2.71±0.43#2.23±0.42#2.23±0.37#2.21±0.38#2.23±0.49#組別空白組模型組硫必利組強(qiáng)志組方低劑量組強(qiáng)志組方中劑量組強(qiáng)志組方高劑量組n7 7 7 7 7 7 0 0 0 0 0 0造模后0 2.60±0.42***2.70±0.39***2.91±0.32***2.90±0.37***2.81±0.28***

3.2 各組大鼠紋狀體PI3K、Akt、TNF-α蛋白表達(dá)水平比較

與空白組比較，模型組大鼠紋狀體PI3K、TNF-α蛋白表達(dá)水平及p-Akt/Akt磷酸化水平升高（P＜0.01，P＜ 0.001，P＜ 0.05）。與模型組比較，強(qiáng)志組方低劑量組的大鼠紋狀體PI3K、TNF-α蛋白表達(dá)水平降低（P＜ 0.05），p-Akt/Akt磷酸化水平有降低趨勢(shì)（P＞ 0.05）；強(qiáng)志組方中、高劑量組大鼠紋狀體PI3K、TNF-α蛋白及p-Akt/Akt磷酸化表達(dá)水平降低（P＜0.001，P＜ 0.05），硫必利組紋狀體蛋白表達(dá)水平無明顯變化。見表4。

表4 各組大鼠紋狀體PI3K、Akt、TNF-α蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與空白組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001；與模型組比較，#P ＜ 0.05，###P ＜ 0.001。

TNF-α/GAPDH 0.72±0.08 1.06±0.07***0.92±0.17 0.84±0.09#0.87±0.06#0.87±0.08#組別空白組模型組硫必利組強(qiáng)志組方低劑量組強(qiáng)志組方中劑量組強(qiáng)志組方高劑量組n3 3 3 3 3 3 PI3K/GAPDH 0.94±0.18 1.29±0.13**1.14±0.09 1.03±0.09#0.85±0.11###0.77±0.21###p-Akt/Akt 0.78±0.10 1.07±0.06*0.96±0.26 0.94±0.11 0.70±0.11#0.79±0.20#

3.3 各組大鼠紋狀體PI3K、Akt、TNF-α mRNA表達(dá)水平比較

與空白組比較，模型組紋狀體PI3K、Akt、TNF-α mRNA表達(dá)水平升高（P＜ 0.001，P＜ 0.01，P＜ 0.05）；與模型組比較，強(qiáng)志組方低劑量組紋狀體PI3K、Akt、TNF-α mRNA表達(dá)水平降低（P＜ 0.05），強(qiáng)志組方中劑量組與高劑量組紋狀體PI3K、Akt、TNF-α mRNA表達(dá)水平降低（P＜ 0.01，P＜ 0.05），硫必利組紋狀體PI3K、Akt、TNF-α mRNA表達(dá)降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。見表5。

表5 各組大鼠紋狀體PI3K、Akt、TNF-α mRNA表達(dá)水平比較（±s）

表5 各組大鼠紋狀體PI3K、Akt、TNF-α mRNA表達(dá)水平比較（±s）

注：與空白組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001；與模型組比較，#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01。

TNF-α 1.00±0.10 1.18±0.11*1.16±0.12 0.98±0.09#0.96±0.03#0.97±0.06#組別空白組模型組硫必利組強(qiáng)志組方低劑量組強(qiáng)志組方中劑量組強(qiáng)志組方高劑量組n3 3 3 3 3 3 PI3K 0.45±0.02 1.05±0.12***0.96±0.06 0.88±0.06#0.84±0.08##0.86±0.02##Akt 1.00±0.04 1.26±0.13**1.17±0.09 1.05±0.09#1.01±0.10##1.03±0.04##

3.4 各組大鼠血清IL-6、TNF-α含量比較

與空白組比較，模型組大鼠血清IL-6、TNF-α含量升高（P＜ 0.001，P＜ 0.01）。與模型組比較，硫必利組血清IL-6含量降低（P＜ 0.01），TNF-α水平無明顯變化（P＞ 0.05）；與模型組比較，強(qiáng)志組方各劑量組血清IL-6含量降低（P＜ 0.001）；強(qiáng)志組方低、中、高劑量組血清TNF-α含量降低（P＜ 0.01，P＜ 0.05）。見表6。

表6 各組大鼠血清IL-6、TNF-α含量比較（±s）

表6 各組大鼠血清IL-6、TNF-α含量比較（±s）

注：與空白組比較，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001；與模型組比較，#P ＜0.05，##P ＜ 0.01，###P ＜ 0.001。

TNF-α 5.03±0.61 6.74±0.48**7.38±0.43 5.31±0.24##4.84±0.73##5.47±1.00#組別空白組模型組硫必利組強(qiáng)志組方低劑量組強(qiáng)志組方中劑量組強(qiáng)志組方高劑量組n4 4 4 4 4 4 IL-6 12.92±1.71 58.94±5.01***44.83±6.56##33.47±3.04###27.22±8.15###30.34±3.37###

4 討論

TD是一類不自主的、快速的、無節(jié)律的，以運(yùn)動(dòng)抽動(dòng)或發(fā)聲抽動(dòng)為主要表現(xiàn)的神經(jīng)精神障礙。西醫(yī)治療TD以藥物為主，包括DA受體阻滯劑、DA系統(tǒng)穩(wěn)定劑、選擇性單胺能拮抗劑、中樞性α受體激動(dòng)劑、抗癲癇藥等，但復(fù)發(fā)率高，不良反應(yīng)明顯。硫必利是目前治療TD的一線藥物，臨床使用過程中發(fā)現(xiàn)其有頭暈、惡心、乏力，嗜睡等不良反應(yīng)［14］。

圖1 蛋白電泳圖

中醫(yī)學(xué)并無TD的病名，據(jù)TD臨床表現(xiàn)，可將其歸屬于“瘛疭”“慢驚風(fēng)”范疇?！鹅`樞·本藏》言：“志意者，所以御精神，收魂魄，適寒溫，和喜怒者也”“志意和則精神專直，魂魄不散，悔怒不起，五臟不受邪”。志意調(diào)和者，能夠正常馭收精神與魂魄活動(dòng)，對(duì)外界環(huán)境變化的感知適應(yīng)能力強(qiáng)，從而免受邪氣的侵襲?！秲?nèi)經(jīng)》早已明確了志意在精神、動(dòng)作、行為駕馭、馭收、發(fā)用及對(duì)內(nèi)外環(huán)境的感知、反饋、調(diào)適的生理作用［15］。閻兆君教授以《內(nèi)經(jīng)》為理論基石，修復(fù)并創(chuàng)建志意辨證理論，廣泛運(yùn)用于精神動(dòng)作行為疾病中，創(chuàng)新性提出TD總的病機(jī)為腎志不足，脾意任越，魂魄不安［16］。腎志不足，志少于行，則會(huì)出現(xiàn)反復(fù)的、不可控制的眨眼、聳肩、清嗓、喉中發(fā)聲等行為；腎志不足，對(duì)情緒、情感活動(dòng)的控制力減弱，則會(huì)表現(xiàn)出脾氣急躁、易沖動(dòng)；腎志不足，則行為不夠果斷勇敢，膽小遇事易退縮。均符合TD患者的疾病及性格特點(diǎn)。

基于志意辨證理論，閻兆君教授自擬強(qiáng)志組方治療TD，方中巴戟天補(bǔ)腎增志，木香強(qiáng)志，遠(yuǎn)志益志開竅，茯神開心益智、安定魂魄，清半夏調(diào)和陰陽，山藥強(qiáng)腎志、安神魂、定精魄，白術(shù)健脾益氣，諸藥共行益腎強(qiáng)志之功。

PI3K/Akt信號(hào)通路［17］是常見的炎癥信號(hào)通路，具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。PI3K家族在炎癥、免疫、腫瘤、肥胖等疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用，細(xì)胞內(nèi)PI3K在外界信號(hào)刺激后，會(huì)有不同程度的升高［18］。Akt是PI3K下游的直接靶蛋白，磷酸化后的PI3K與Akt的PH結(jié)構(gòu)域結(jié)合，使得Akt磷酸化［19］。磷酸化的Akt進(jìn)一步激活A(yù)kt下游炎性蛋白TNF-α。已有實(shí)驗(yàn)證明了PI3K/Akt信號(hào)通路與TD的相關(guān)性。HONGYAN等［7］研究發(fā)現(xiàn)，使用PI3K抑制劑抑制LY294002能明顯緩解TD大鼠的抽動(dòng)癥狀，顯著降低大鼠紋狀體與血清炎癥因子水平，說明PI3K/Akt信號(hào)通路可能介導(dǎo)了TD的病理過程。

TD伴隨著免疫功能紊亂，ZHONG等［20］研究顯示，IDPN建立的TD大鼠模型腦內(nèi)IL-6和TNF-α等細(xì)胞因子明顯高于正常組。TAO等［21］對(duì)1 724例TD患者和550例對(duì)照組患者分別進(jìn)行細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ水平的檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TD患者血清IL-6濃度明顯高于對(duì)照組。一項(xiàng)對(duì)多發(fā)性抽動(dòng)癥患者的促炎細(xì)胞因子和T細(xì)胞的Meta分析結(jié)果顯示，多發(fā)性抽動(dòng)癥患者包括IL-6、TNF-α在內(nèi)的促炎因子水平增加［22］。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與上述文獻(xiàn)研究結(jié)果一致。

本實(shí)驗(yàn)成功復(fù)制TD大鼠模型，通過Western blot、qPCR與Elisa法探究強(qiáng)志組方是否通過調(diào)控PI3K/Akt/TNF-α信號(hào)通路發(fā)揮防治TD的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，強(qiáng)志組方能夠降低大鼠運(yùn)動(dòng)行為與刻板行為評(píng)分，下調(diào)紋狀體PI3K、Akt、TNF-α蛋白及mRNA表達(dá)水平，降低血清IL-6、TNF-α水平。說明強(qiáng)志組方能抑制大鼠紋狀體PI3K/Akt/TNF-α通路的激活和外周炎癥因子生成，有效減輕TD大鼠抽動(dòng)癥狀。

5 結(jié)論

強(qiáng)志組方能改善TD大鼠異常的運(yùn)動(dòng)行為與刻板行為，其機(jī)制與調(diào)控紋狀體PI3K/Akt/TNF-α通路的過度激活，降低外周炎癥因子有關(guān)。本研究從PI3K/Akt/TNF-α信號(hào)通路入手，為TD發(fā)病機(jī)制及有效防治提供新思路和新靶點(diǎn)。但TD的發(fā)病是多因素作用的結(jié)果，強(qiáng)志組方治療TD的深入病因機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。