離體培養(yǎng)條件下萊氏綠僵菌致病形態(tài)和非致病形態(tài)的轉(zhuǎn)錄組分析

劉守柱 張希鵬 郝軒卉 任憲鑾 王世賢 聶玉恒 吳蕊

關(guān)鍵詞：萊氏綠僵菌；轉(zhuǎn)錄組分析；致病形態(tài)；非致病形態(tài)；形態(tài)轉(zhuǎn)變；離體培養(yǎng)

萊氏綠僵菌[Metarhizium rileyi（Farlow）Kep-ler]（Hypocreales：Clavicipitaceae）原名萊氏野村菌（Nomuraea rileyi），是一種重要的昆蟲生防真菌，可在田間自然發(fā)生并對(duì)60多種鱗翅目害蟲，尤其是夜蛾科害蟲，如甜菜夜蛾（Spodopteraexigua）、棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）、斜紋夜蛾（Spodoptera litura）及近年入侵我國(guó)的草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）等有明顯的致病作用，是一種具有廣闊應(yīng)用前景的生防真菌。雖然萊氏綠僵菌在害蟲生物防治領(lǐng)域有突出的優(yōu)點(diǎn)，但較慢的致死速度是制約其大規(guī)模利用的瓶頸。例如，用1x108個(gè)孢子/mL的萊氏綠僵菌孢子懸液處理斜紋夜蛾3齡幼蟲，半致死時(shí)間（LT50）為5.5～6.6d；處理4、5齡幼蟲時(shí)，LT50分別延長(zhǎng)至9.8、11.0d。

萊氏綠僵菌的致病機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過程，可以簡(jiǎn)單歸納為孢子在昆蟲體壁上的粘附、萌發(fā)、體壁穿透等體外侵染過程，以及侵入寄主血腔后的增殖、變形、分泌毒素、組織破壞等體內(nèi)發(fā)育過程。體外過程決定侵染成功率，體內(nèi)過程決定致死速度。研究表明，萊氏綠僵菌成功侵入昆蟲血腔后，菌體在發(fā)育初期以小而短的酵母狀形態(tài)存在，稱為蟲菌體（hyphal body，Hb），以芽殖的方式大量增殖，此時(shí)寄主正常進(jìn)食、蛻皮和生長(zhǎng)；當(dāng)菌體數(shù)量達(dá)到一定密度閾值后，酵母狀的Hb不再進(jìn)行芽殖，而是向兩端生長(zhǎng)，形成細(xì)長(zhǎng)的菌絲，并分泌毒素殺死寄主。萊氏綠僵菌的體內(nèi)發(fā)育過程表明該菌是一種二型性真菌（di-morphism fungus），蟲菌體是非致病形態(tài)，不會(huì)影響寄主的生長(zhǎng)，只有當(dāng)其轉(zhuǎn)變?yōu)榫z后，才能表現(xiàn)出殺蟲效果，是致病形態(tài)。這種二型性轉(zhuǎn)變是萊氏綠僵菌發(fā)揮殺蟲作用的決定因素。

萊氏綠僵菌的二型性轉(zhuǎn)變受基因調(diào)節(jié)。為了明確哪些基因參與或調(diào)節(jié)其二型性轉(zhuǎn)變過程，本研究分別提取離體培養(yǎng)的萊氏綠僵菌的非致病形態(tài)和致病形態(tài)菌體，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和分析，以挖掘與二型性轉(zhuǎn)變有關(guān)聯(lián)的基因和調(diào)節(jié)通路，為深入理解萊氏綠僵菌的致死機(jī)制及提高致死速度提供有益的借鑒。

1材料與方法

1.1供試菌株

供試菌株為聊城大學(xué)昆蟲病理實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期保存的萊氏綠僵菌Nr 5772菌株，用SMAY培養(yǎng)基（1%麥芽糖，1%蛋白胨，1%酵母提取物．1.2%瓊脂粉）繼代培養(yǎng)后保存于4℃冰箱中。試驗(yàn)前將其接種到寄主體內(nèi)進(jìn)行復(fù)壯，然后從感病死亡的蟲體上重新分離菌株，培養(yǎng)于SMAY平板中待用。

1.2樣品制備

為了最大限度地模仿昆蟲體內(nèi)環(huán)境，采用昆蟲血清培養(yǎng)基Sf-900TMⅡ作為培養(yǎng)基質(zhì)，接種新鮮、無菌的萊氏綠僵菌分生孢子，25℃、180r/min振蕩培養(yǎng)。按以下方法分別制備非致病形態(tài)和致病形態(tài)樣品各3份，每份樣品菌體數(shù)量>108個(gè)。

非致病形態(tài)樣品制備：振蕩培養(yǎng)48h后，取少量培養(yǎng)液鏡檢所含蟲菌體的形態(tài)和數(shù)量，若菌體依然是酵母狀且數(shù)量較多（密度在107～108個(gè)/mL之間），則吸取10mL培養(yǎng)液，5000r/min離心10min，棄去上清，再用無菌水重新懸浮、離心、棄上清，如此清洗2次，最后棄去上清，沉淀物即為待測(cè)樣品，液氮速凍后-80℃冰箱保存。若培養(yǎng)液已有菌體呈現(xiàn)菌絲形態(tài)，則該培養(yǎng)液不用于非致病形態(tài)樣品制備。

致病形態(tài)樣品制備：振蕩培養(yǎng)60h后，取少量培養(yǎng)液進(jìn)行鏡檢，當(dāng)大多數(shù)菌體已由酵母狀變成兩端尖尖的線狀菌體，但還有少量酵母狀的菌體時(shí)，說明萊氏綠僵菌正在進(jìn)行形態(tài)轉(zhuǎn)變，則吸取10mL培養(yǎng)液，用2層50um的纖維素濾膜過濾，然后用無菌水清洗2次，洗脫吸附在濾膜上的絲狀菌體，5000r/min離心10min，所得沉淀即為待測(cè)樣品，液氮速凍后-80℃冰箱保存待用。

1.3轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

將制得的兩種形態(tài)樣品送至深圳微科盟生物技術(shù)有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，3次生物學(xué)重復(fù)。

采用TRIzol法提取總RNA，然后用Oligo（dT）磁珠富集、純化帶有polyA尾的mRNA；以該mRNA為模版，以隨機(jī)寡核苷酸為引物，在M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶體系中合成cDNA第一條鏈：隨后用RNaseH降解RNA鏈，并在DNA polymeraseI體系下，以dNTPs為原料合成cDNA第二條鏈。純化后的雙鏈cDNA經(jīng)過PCR擴(kuò)增最終獲得文庫，庫檢合格后，進(jìn)行Illumina高通量測(cè)序。

1.4測(cè)序數(shù)據(jù)過濾及質(zhì)量評(píng)估

采用Trimmomatic軟件去除測(cè)序原始數(shù)據(jù)（raw reads）中的測(cè)序接頭及測(cè)序質(zhì)量較低的reads，獲得干凈測(cè)序數(shù)據(jù)（clean reads）；為保證數(shù)據(jù)分析的質(zhì)量及可靠性，進(jìn)一步計(jì)算堿基質(zhì)量值Q20．Q30以及GC含量進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，評(píng)估合格后用于后續(xù)分析。

1.5轉(zhuǎn)錄本拼接及質(zhì)量評(píng)估

采用Trinity對(duì)合格的clean reads進(jìn)行拼接．獲得轉(zhuǎn)錄本序列，然后進(jìn)行Corset層次聚類分析，聚合冗余轉(zhuǎn)錄本，在每個(gè)聚類中選出最長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄本作為該聚類的代表序列，定義為Unigene序列。使用單拷貝直系同源基因，采用BUSCO軟件對(duì)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，評(píng)價(jià)拼接結(jié)果的準(zhǔn)確性和完整性。評(píng)估合格的轉(zhuǎn)錄本用于后續(xù)分析。

1.6Unigene功能注釋

通過7個(gè)數(shù)據(jù)庫比對(duì)獲得Unigene的生物學(xué)功臺(tái)旨信息，包括NR（NCBI

Non-Redundant ProteinSequence Database）、NT（NCBI

Nucleotide

Se-quence Database）、KOG（Clusters of OrthologousGroups for Eukaryotic Complete Genomes）、SWISS-PROT、UniProt（Universal Protein Knowledgebase）、KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Ge-nomes）、GO（Gene Ontology）數(shù)據(jù)庫。

1.7差異表達(dá)基因分析

采用DESeq2軟件，根據(jù)每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的片段數(shù)（fragments per kilobaseper million，F(xiàn)PKM）對(duì)測(cè)序深度進(jìn)行校正，以一個(gè)基因在兩組樣品中的表達(dá)量差異達(dá)到兩倍以上[llog2（Fold Change）>1]且校正P值（adjust Pvalue，P）<0.05為差異基因標(biāo)準(zhǔn)，篩選萊氏綠僵菌在形態(tài)轉(zhuǎn)變過程中上調(diào)和下調(diào)表達(dá)的基因，繪制火山圖，并根據(jù)功能注釋結(jié)果進(jìn)行GO富集和KEGG富集分析。

2結(jié)果與分析

2.1萊氏綠僵菌非致病形態(tài)和致病形態(tài)的鑒別

經(jīng)過顯微鏡觀察，萊氏綠僵菌在非致病形態(tài)和致病形態(tài)之間有非常明顯的區(qū)別（圖1）。非致病形態(tài)菌體酵母狀，菌體短，側(cè)面或頂端多有拇指狀的芽突，以出芽的形式進(jìn)行增殖；致病形態(tài)菌體長(zhǎng)，兩端尖細(xì)，游離或聚集成簇，數(shù)量不再增加。

2.2萊氏綠僵菌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及質(zhì)量評(píng)估

由表1可見，測(cè)序后各樣本的原始?jí)A基數(shù)量均在6G以上，組成42M以上的原始序列，過濾后得到的干凈堿基數(shù)量高于5.5G，形成的干凈序列>37M，數(shù)據(jù)有效率>86%；Q20值均為100%，Q30值≥99.86%，錯(cuò)誤率均為0.03%，遠(yuǎn)低于0.1%的閾值，說明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)量較高，可以用于后續(xù)的分析。

2.3轉(zhuǎn)錄本拼接及質(zhì)量評(píng)估

兩組樣品的clean reads經(jīng)過拼接后共得到142263個(gè)轉(zhuǎn)錄本，經(jīng)過Corset聚類分析后歸人90528個(gè)不同的類中，進(jìn)一步聚合冗余轉(zhuǎn)錄本后，共得到89498個(gè)Unigene。利用BUSCO軟件，與真核生物直系同源基因庫比對(duì)，完整的雙拷貝基因比對(duì)成功率為93%，完整的單拷貝基因比對(duì)成功率為7%，沒有基因片段和比對(duì)不成功的基因，說明轉(zhuǎn)錄本拼接準(zhǔn)確、完整（圖2）。

2.4Unigene功能注釋

大部分（84.45%） Unigene在1個(gè)及以上數(shù)據(jù)庫中得到注釋，只有15.55%的基因沒有得到注釋（表2）。在7個(gè)數(shù)據(jù)庫中，注釋到NR數(shù)據(jù)庫的Unigene最多，占78.69%；注釋到GO數(shù)據(jù)庫的Unigene數(shù)量最少，占41.59%；同時(shí)在7個(gè)數(shù)據(jù)庫中得到注釋的Unigene占比20.72%。

2.4.1GO功能注釋

在GO數(shù)據(jù)庫中得到注釋的Unigene，功能主要集中在生物學(xué)過程（biologi-cal process．BP）、細(xì)胞組分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）三個(gè)子類（圖3）。在BP子類中，與細(xì)胞過程（cellularprocess）、基因表達(dá)調(diào)控（regulation of gene expres-sion）、蛋白質(zhì)定位（protein localization）相關(guān)的基因最多；在CC子類中，與細(xì)胞質(zhì)（cytoplasm）、胞內(nèi)膜結(jié)合細(xì)胞器（intracellular membrane-boundedorganelle）、細(xì)胞核（nucleus）有關(guān)的基因最多；在MF子類中，注釋到催化活性（catalytic activity）、水解酶活性（hydrolase activity）、轉(zhuǎn)移酶活性（transferase activity）的基因最多。

2.4.2KOG注釋結(jié)果KOG注釋成功的基因在25個(gè)組別中的分布狀況如圖4所示。其中，與主要功能預(yù)測(cè)（general function prediction only）有關(guān)的基因注釋最多，其次是與翻譯后修飾、蛋白質(zhì)折疊和伴侶蛋白（posttranslational modification．pro-tein turnover，chaperones）有關(guān)的基因，以及與翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物合成（translation，ribosomalstructure and biogenesis）有關(guān)的基因。

2.4.3KEGG注釋注釋到KEGG的基因分屬于細(xì)胞過程（Cellular Processes）、環(huán)境信息處理（En-vironmental Information Processing）、遺傳信息處理（Genetic Information Processing）、代謝（Metabo-lism）、生物系統(tǒng)（Organismal Systems）5個(gè)子類（圖5）。其中，注釋到代謝子類的基因最多，與之相關(guān)的代謝通路（metabolic pathways）占比最高，達(dá)到10.95%，次生代謝物的生物合成（biosynthe-sis of secondary metabolites）次之，占比4.56%，說明此時(shí)萊氏綠僵菌的代謝活動(dòng)旺盛：其次是遺傳信息處理子類，與核糖體和RNA轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的基因占優(yōu)；在細(xì)胞過程子類中，與細(xì)胞內(nèi)吞、細(xì)胞周期、細(xì)胞自噬、減數(shù)分裂相關(guān)的基因最多，與群體感應(yīng)相關(guān)的基因也位于前列，說明萊氏綠僵菌的二型性轉(zhuǎn)變與群體感應(yīng)調(diào)節(jié)有關(guān)：在環(huán)境信息處理子類中，與MAPK信號(hào)途徑、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、雙元系統(tǒng)有關(guān)的基因位于前列．cAMP、Ras、AMPK等信號(hào)途徑也有較高的表達(dá)：在生物系統(tǒng)子類中，與Thermogenesis有關(guān)的基因表達(dá)量較高。

2.5差異表達(dá)基因分析

用DEseq2軟件對(duì)獲得的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后，以llog2（ Fold Change）l>1且P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)基因。結(jié)果（圖6）發(fā)現(xiàn)，在89498條基因中，差異表達(dá)基因占7.58%，其中，上調(diào)表達(dá)的有3113個(gè)，下調(diào)表達(dá)的有3671個(gè)。根據(jù)注釋結(jié)果，對(duì)得到的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集和KEGG富集分析，未能富集到有效的差異基因。

3討論與結(jié)論

昆蟲病原真菌雖然有很好的靶標(biāo)特異性和環(huán)境安全性，但由于該類生物制劑在田間使用時(shí)效果不穩(wěn)定、病程長(zhǎng)、致死慢，無法及時(shí)有效地控制害蟲暴發(fā)危害，制約其大面積應(yīng)用。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2018年我國(guó)生物農(nóng)藥產(chǎn)量2.9萬t，其中微生物農(nóng)藥占34%，生物農(nóng)藥總體防治覆蓋率約為10%，微生物制劑的使用更少，遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于化學(xué)農(nóng)藥的使用率。而提高微生物制劑殺蟲效果的最簡(jiǎn)便方法就是與化學(xué)農(nóng)藥聯(lián)合使用：如劉守柱等研究表明高效氯氰菊酯在亞致死劑量時(shí)可以提高萊氏綠僵菌對(duì)斜紋夜蛾的毒力，但聯(lián)合使用會(huì)削弱微生物制劑綠色、安全的環(huán)保優(yōu)勢(shì)。

不同種類的昆蟲病原菌可能有不同的致死機(jī)制。萊氏綠僵菌已經(jīng)被證明是二型性真菌，存在致病和非致病兩種形態(tài)，其中非致病形態(tài)持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，但一旦轉(zhuǎn)變?yōu)橹虏⌒螒B(tài)就可以很快把寄主殺死．因此，加快其向致病形態(tài)的轉(zhuǎn)變是縮短該病原菌潛伏期以提高致死速度的關(guān)鍵。Boucias等研究指出，萊氏綠僵菌的這種二型性轉(zhuǎn)變可能是受群體感應(yīng)（quorum sensing，QS）調(diào)節(jié)和控制的，但尚無直接證據(jù)支持。本研究通過KEGG注釋發(fā)現(xiàn)，萊氏綠僵菌形態(tài)轉(zhuǎn)變的過程中，與QS通路有關(guān)的基因表達(dá)量較高，為萊氏綠僵菌的QS調(diào)節(jié)機(jī)制提供了分子方面的初步證據(jù)。雖然在進(jìn)一步的差異表達(dá)基因富集分析中并未發(fā)現(xiàn)集中在QS信號(hào)通路上的差異表達(dá)基因，但我們?nèi)栽诓町惐磉_(dá)基因庫中篩選到了與QS有關(guān)的上調(diào)和下調(diào)基因，為下一步的研究奠定了基礎(chǔ)。

自誘導(dǎo)分子（autoinducers）是啟動(dòng)QS系統(tǒng)的開關(guān)，不同的菌體中具有不同的誘導(dǎo)分子．并且不同的誘導(dǎo)分子誘導(dǎo)的方向不同。本研究對(duì)萊氏綠僵菌的兩種不同形態(tài)進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在其二型性轉(zhuǎn)變過程中有多個(gè)生理過程發(fā)生了明顯變化，尤其是與代謝有關(guān)的基因高表達(dá)，說明此時(shí)代謝活動(dòng)旺盛，可能會(huì)產(chǎn)生大量的次生代謝產(chǎn)物，而這些代謝產(chǎn)物中的某些成分可能會(huì)充當(dāng)自誘導(dǎo)分子，誘導(dǎo)QS系統(tǒng)的調(diào)節(jié)活動(dòng)。在眾多的代謝產(chǎn)物中，金合歡醇（farnesol）是一種公認(rèn)的QS誘導(dǎo)分子，但它的主要功能是誘導(dǎo)菌體處于酵母狀態(tài)，與萊氏綠僵菌的形態(tài)轉(zhuǎn)變方向相反；4-羥基苯乙醇（tyrosol）是另外一種常見的誘導(dǎo)分子，誘導(dǎo)產(chǎn)生菌絲形態(tài)的菌體，與萊氏綠僵菌的形態(tài)轉(zhuǎn)變方向正相關(guān)。金合歡醇和4-羥基苯乙醇亦有可能協(xié)同調(diào)節(jié)真菌的形態(tài)轉(zhuǎn)變。

本研究還發(fā)現(xiàn)MAPK等與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān)的基因表達(dá)也處于前列，說明形態(tài)轉(zhuǎn)變過程中細(xì)胞間的信息交流頻繁，可能是胞外的信號(hào)傳導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，引起細(xì)胞增殖方式改變，由出芽增殖改變?yōu)闃O性生長(zhǎng)，從而引起形態(tài)的改變。Ras蛋白是激活MAPK途徑的重要分子，對(duì)真菌的致病力有非常重要的調(diào)節(jié)作用。本研究發(fā)現(xiàn)Ras基因表達(dá)量較高，因其功能主要是調(diào)節(jié)真菌產(chǎn)孢和菌絲生長(zhǎng)，間接證明萊氏綠僵菌的致病力確實(shí)與菌體形態(tài)有關(guān)，即菌絲是致病形態(tài)。萊氏綠僵菌菌絲的形成與Ras超家族中的RacA和Cdc-42蛋白有關(guān)，它們?cè)谌R氏綠僵菌微菌核形成過程中調(diào)控菌絲的極性生長(zhǎng)．因而也很有可能參與寄生過程中萊氏綠僵菌的形態(tài)轉(zhuǎn)變。

由于缺乏可參考的萊氏綠僵菌全基因組注釋圖譜，本研究雖然篩選到了6000多個(gè)差異表達(dá)基因，但無法比對(duì)到萊氏綠僵菌的基因組中，導(dǎo)致GO和KEGG富集分析均無結(jié)果，說明在萊氏綠僵菌基因組研究方面依然較為薄弱。此外，本研究所用材料是在離體狀況下制備而來，與昆蟲體內(nèi)的真實(shí)狀況存在差異，今后將繼續(xù)進(jìn)行活體轉(zhuǎn)錄組分析，以進(jìn)一步探討萊氏綠僵菌的二型性轉(zhuǎn)變機(jī)制。