基于網絡藥理學和分子對接技術探討杞貞滋陰合劑治療性腺功能減退癥的作用機制

潘宇炯，何志高，陳石秀，周 桂，周 昕，郁 超 （上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院, 上海 200032）

性腺功能減退癥是一種由多種原因引起的睪酮水平低于健康青年男子正常范圍的疾病，臨床癥狀為焦躁不安、健忘出汗、性功能減退等。從流行病學分析，該病在肥胖和糖尿病人群中發(fā)病較多；其次，多發(fā)病于中老年男性患者，也稱遲發(fā)性性腺功能減退癥（LOH）[1]。目前，西醫(yī)治療男性肥胖和LOH 多以外源性和內源性補充睪酮為主，治療手法單一，且存在諸多的爭議。例如，在臨床中，對于LOH 癥狀中失眠、潮熱、健忘、注意力不集中等精神心理癥狀，單純用睪酮補充治療（TST），癥狀改善不顯著[2-5]。中醫(yī)治療則根據患者在TST 過程中所表現的不同證候采用不同的治療方法，如心功能不全患者以補腎為主，情志精神患者以疏肝為主，生理體能欠佳者以健脾、補益為主等不同的治療方法[5]。

杞貞滋陰合劑（滬藥制備字Z20210006000），是上海市著名中醫(yī)周智恒教授的經驗方。該方中，君藥是熟地黃、黃芪，起滋陰補腎、益氣培元之功效；臣藥是枸杞子、女貞子、山茱萸，起補腎、澀精、固腎之功效；佐藥為沙苑子、當歸，起益精養(yǎng)血之功效；鎖陽陽中求陰為使藥。全方共奏滋陰補腎、益氣生精之功效。前期臨床實驗證明，杞貞滋陰合劑可以有效改善LOH 患者體能不濟、血管舒縮和睪酮水平低下等癥狀[6-7]。

網絡藥理學是通過“藥物-基因-靶點-疾病”相互作用網絡，預測藥物作用機制的學科[8]。分子對接是通過受體和藥物分子之間的相互作用來進行藥物設計的方法。本研究通過網絡藥理學和分子對接技術，對杞貞滋陰合劑的作用機制進行研究，以期為該制劑的后期開發(fā)提供技術支持和理論依據。

1 資料與方法

1.1 杞貞滋陰合劑化學成分檢索的整理與篩選

在中藥綜合數據庫（TCMID）[9]、中藥系統(tǒng)藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）[10]、藥物成分靶標數據庫（HIT）[11]和文獻中檢索杞貞滋陰合劑的相關化學成分，再在TCMID，TCMSP，HIT，STITCH數據庫中查找有效活性成分的靶點，取STITCH 數據庫中化合物靶標關聯度400 以上的靶標[12]，并使用NCBI 數據庫中的基因模塊對生物靶標信息進行標準化，建立相關的化學成分靶標數據庫。

1.2 類藥性的初步篩選

將化合物的物理化學特征與上市藥物特征進行比較，采用Bickerton 等提出的有效的類藥性評估指標（quantitative estimate of druglikeness，QED）評估化學成分的類藥性[13]。

參考DRUGBANK 上市藥物QED 值，選擇0.3為閾值篩選化合物。

1.3 基于二項分布算法的靶標及化學成分的二次篩選

采用基于二項分布的富集評分算法來篩選核心方的作用靶標[14]。

當P<0.01 時，表明該靶標基因被至少k個活性化合物同時作用是小概率事件，則該靶標基因是核心方的主要作用靶標基因，并將含有主要作用靶標基因的化合物作為主要作用化合物。

1.4 疾病靶點篩選

在GENECARD 數據庫[15]的Malacard 模塊中查找“性腺功能減退癥”的靶點數據，以得分雙倍中位數為篩選條件，在DisGeNet 數據庫查找“性腺功能減退癥疾病”的靶點數據。合并以上兩個數據庫的篩選結果，并刪除重復靶標。最后，使用韋恩圖確定杞貞滋陰合劑治療性腺功能減退癥的主要靶標，并使用STRING 數據庫進行蛋白PPI 網絡分析。

1.5 生物功能富集分析

將得到的97 個疾病靶標進行富集分析，其中，通路信息來自KEGG 通路數據庫[16]，基因本體GO富集分析信息數據來源于Gene Ontology 數據庫，再應用超幾何分布模型評估靶標基因群是否與特定的GO 及生物通路顯著關聯：

經過錯誤發(fā)現率（False discovery rate, FDR）[17]法調整的P值，反映了杞貞滋陰合劑靶標或者疾病靶標與通路或GO 的關聯強度，本項目經調整后的P值，以小于0.01認為關聯顯著。

1.6 構建“成分-靶點-疾病”網絡圖

利用Cytoscape 軟件的插件評估篩選核心靶標，組成核心網絡，評估杞貞滋陰合劑疾病KEGG關聯條目的關系。所有圖片中形狀大小、顏色深淺均以度值排序。

1.7 分子對接

取度值較高的核心靶點，導入PDB（https://www.pdbus.org/），篩選條件以X-RAY 下Resolution值小為首選標準，下載PDB 文件，使用PYMOL 軟件，去水、去配體后備用；從PubChem 數據庫下載活性成分，運用AutoDock-Tools 軟件對受體蛋白及配體進行加氫、平衡電荷等操作后，對處理好的活性化合物與靶蛋白進行對接，并進行能量計算，最終運用PYMOL 軟件進行繪圖。

2 結果

2.1 杞貞滋陰合劑活性成分和靶標的篩選

通過TCMSP、TCMID、HIT 數據庫和文獻檢索獲得495 個活性化合物；然后在STITCH 數據庫中，篩選靶標關聯度400 以上的靶標，獲得靶標7 627 個；再通過類藥性分析，共得到246 個滿足類藥性成分的化合物；并使用二項分布算法篩選核心方的作用靶標，篩選得到701 個成分靶標和213 個主要作用化合物。

通過GENECARD 數據庫篩選到1 051 個相關靶標，通過DisGeNet 數據庫篩選到305 個相關靶標，合并刪除重復疾病靶標后，共獲得1 085 個與性腺功能減退癥相關的疾病靶標基因。結合杞貞滋陰合劑的701 個成分靶標，使用韋恩圖確定杞貞滋陰合劑的96 個疾病靶標和148 種活性化合物，見表1。

表1 杞貞滋陰合劑的主要有效活性成分

2.2 杞貞滋陰合劑活性成分和靶標的網絡構件圖

利用Cytoscape 軟件，以杞貞滋陰合劑的96 個疾病靶標和148 種活性化合物，建立“藥物-成分-靶點”網絡圖，其中，度值較高的化合物有棕櫚油、乙醇、槲皮素、木犀草素、山柰酚、果糖、硬脂酸等，見圖1。

2.3 杞貞滋陰合劑靶標的PPI 網絡構件圖

通過STRING 數據庫進行蛋白PPI 網絡分析，并利用Cytoscape 軟件，以疾病為靶標進行蛋白PPI 網絡分析，圖中共有96 個節(jié)點，1 132 條邊，其中，度值排名前10 的靶標是血清白蛋白（ALB）、INS、阿黑皮素原（POMC）、TNF、AKT1、LEP、IGF1、IL-6、FOS、ESR1，見圖2。

圖2 杞貞滋陰合劑疾病靶標蛋白PPI 網絡圖

2.4 GO 富集分析

對杞貞滋陰合劑治療性腺功能減退癥的靶標基因進行GO 富集分析，以P值小于0.01 為關聯顯著,以此進行篩選，生物過程（BP）有1 792 條、細胞組件（CC）有31條、分子功能（MF）有79 條，并取P值前15 條的BP、CC、MF 分別制得條形圖。其中，MF 主要集中在受體激動劑活性、激素活性、RNA 聚合酶Ⅱ轉錄因子活性、G 蛋白偶聯受體結合等；CC 主要集中在分泌顆粒腔、細胞質膜結合囊泡腔、囊泡腔、內質網內腔等；BP 主要集中在對肽類激素的反應、多細胞生物穩(wěn)態(tài)、對營養(yǎng)水平的反應等，見圖3。

圖3 疾病靶點GO 富集分析(前10)

2.5 KEGG 富集分析

對杞貞滋陰合劑治療性腺功能減退癥的靶標基因進行GO 富集分析，以P值小于0.01 為關聯顯著,并以此進行篩選，結果KEGG 信號通路的富集分析報告中，復方靶標與性腺功能減退癥相關的有132 條信號通路，取P值前15 條信號通路，制得氣泡圖和核心網絡與前15 條通路的關系圖見圖4。

圖4 疾病靶點KEGG 富集分析圖

2.6 分子對接

根據“藥物-成分-靶點”網絡分析得到排名前17 的核心活性成分，剔除其中成藥性較差的，例如，乙醇、棕櫚油、果糖、硬脂酸等，最后選取槲皮素、山柰酚、木犀草素作為核心活性成分；從度值排名前8 的核心靶點中，剔除與槲皮素、山柰酚、木犀草素無密切度的ALB 和POMC，最后選取INS、TNF、AKT1、LEP、IGF1、IL-6 六個靶點進行分子對接。其中，對接得分（kcal/mol 值）絕對值>4.25代表結合活性一般，絕對值>5.0 代表結合活性較好，絕對值>7.0 代表結合活性較強[18]。由結果可知，主要核心靶點與核心化合物的結合值都超過了5.0，核心靶點TNF 和LEP 的結合值整體高于其他靶點，其中，LEP 與山柰酚的結合力較強，見表2、圖5。

圖5 部分蛋白和活性成分分子對接圖

表2 成分與核心靶點分子對接結果

3 討論

睪酮已被證明是維持代謝穩(wěn)態(tài)的關鍵調節(jié)因子?，F代研究證明，睪酮與胰島素抵抗、血脂異常、炎癥細胞因子合成增加等因素密切相關[19-23]。因此，臨床治療LOH 除了補充睪酮，多以控制體重、改善胰島素抵抗的方法達到改善患者的血清睪酮水平和性功能的目的。

本次研究，通過TCMSP、TCMID、HIT 等數據庫搜索，并進行類藥性分析和二項分布算法篩選，共得到701 個成分靶標和213 個主要作用化合物，再通過建立“藥物-成分-靶點”網絡圖，發(fā)現其中與疾病關聯性較強的化合物是槲皮素、山柰酚、木犀草素等，主要作用的疾病靶點是AKT1、IL-6、IGF1、LEP 等。有研究表明，槲皮素可刺激cAMP 依賴性急性調節(jié)（Star）啟動子的激活，增加Leydig 細胞生成睪酮[24]；山柰酚可以改善雄性小鼠生殖器官重量、精子質量，減少睪丸組織損傷[25]；木犀草素能激活Star 蛋白的表達，進而增加睪酮的產生[26]。又有研究表明，IL-6 炎癥細胞因子被釋放到血液中，可能抑制Leydig 細胞的發(fā)育[27]；AKT1 蛋白可通過磷酸化，進而調節(jié)哺乳動物的睪丸功能，而IGF1 可刺激多種AKT1 的活性[28]；LEP 可通過下丘腦PI3K/AKT 通路刺激GnRH 合成與釋放，從而影響血清睪酮水平[29]。

通過KEGG 富集分析共得到132 條通路，并篩選出P值排名前15 的通路，包括FOXO 通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號通路、胰島素抵抗、HIF-1 通路等。其中，缺氧誘導因子-1（HIF1）是參與細胞缺氧反應的關鍵轉錄因子，并且在Leydig 細胞中穩(wěn)定表達，而Leydig 細胞生成睪酮是雄性睪酮的主要來源，當HIF1 上調時，睪酮水平顯著降低[30]。在FOXO 通路中，STAT3、IL-6、AKT1、IGF-1 廣泛參與了FOXO 的激活，FOXO 蛋白作為核轉錄因子，可以促進胰島素或IGF-1 在哺乳動物細胞的增殖[31]。綜上所述，杞貞滋陰合劑治療LOH 的主要活性成分和作用靶點主要涉及Leydig 細胞睪酮合成酶表達和改善胰島素抵抗。其中，Leydig 睪丸間質細胞的功能和數量下降導致的雄激素缺乏是LOH的主要核心機制[32]。有研究表明，胰島素可通過刺激下丘腦促性腺激素釋放激素（GnRH）的產生和分泌，進而刺激黃體生成素（LH）和卵泡刺激素（FSH）的生物合成，而LH 和FSH 是睪丸功能的重要激素調節(jié)因子[33]。中醫(yī)將糖尿病前期歸于“消渴” 等范疇?！督饏T要略》中消渴病篇提到：“男子消渴，小便反多，以飲一斗，小便一斗，腎氣丸主之?！蹦I陽不足，則無力蒸騰氣化水液[34]，而杞貞滋陰合劑的創(chuàng)始者周智恒教授認為LOH 的病因正是腎氣衰、真水枯竭，該方正是有滋陰補腎、益氣生精之功效[6]。眾所周知，胰島素抵抗正是糖尿病的病理基礎。由上可見，杞貞滋陰合劑的中醫(yī)治療LOH的理論和胰島素抵抗的中醫(yī)治療理論相一致，也為本研究指出的杞貞滋陰合劑治療LOH 多涉及改善胰島素抵抗提供了理論依據。本研究為杞貞滋陰合劑治療性腺機能減退癥探索了新的防治思路，但由于數據統(tǒng)計來自于多平臺的數據收錄和總結，結果還需后續(xù)實驗研究做進一步的驗證，從而完善杞貞滋陰合劑治療LOH的作用機制。