聚合物囊泡的穩(wěn)定性及H+透膜特性考察

卞康晴，郭靈怡，遲文雅，俞 媛 （海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系藥劑學(xué)教研室, 上海 200433）

聚合物囊泡(PSs) 是由兩親嵌段共聚物自組裝形成的囊泡狀“殼-核”結(jié)構(gòu)微納米載體，其結(jié)構(gòu)類(lèi)似脂質(zhì)體(liposomes)[1]，常用的聚合物材料包括聚乙烯醇（PVA）、聚乙二醇（PEG）、聚己內(nèi)酯（PCL）、聚乳酸（PLA）、聚乳酸-羥基乙酸共聚體（PLGA）等，作為生物膜模型、藥物控釋和基因轉(zhuǎn)染的載體而被廣泛研究。脂質(zhì)體制備過(guò)程中，其穩(wěn)定性受磷脂酰膽堿和膽固醇的比例、溫度和pH 等因素的影響，一定范圍內(nèi)磷脂酰膽堿含量高，高溫和酸性環(huán)境都會(huì)破壞脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。聚合物囊泡具有更加穩(wěn)定和可控的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，熵值較小，比脂質(zhì)和表面活性劑更穩(wěn)定，在化學(xué)修飾、生物分子偶聯(lián)和物理結(jié)構(gòu)等方面具有更好的穩(wěn)定性和靈活性[2,3]，對(duì)（113.7±18.5）nm 水的滲透性較低，可抵抗更大的壓力[4]。聚合物囊泡既可以攜帶水溶性藥物(如氨基酸、多肽、蛋白類(lèi)藥物)，將藥物包封在內(nèi)水相內(nèi)，也可以攜帶脂溶性藥物，將藥物增溶在膜層中。根據(jù)聚合物的鏈長(zhǎng)和分子量差異得到不同膜層厚度的聚合物囊泡，可提高疏水性藥物在囊泡中的包封率[5]。聚合物囊泡的特殊結(jié)構(gòu)和性質(zhì)決定其可用于生物膜模擬、藥物釋放、催化、提供反應(yīng)的微環(huán)境等，因此，在分子封裝和控釋領(lǐng)域有很大的潛在應(yīng)用價(jià)值。作為藥物載體，具有改變藥物在體內(nèi)的分布、防止藥物降解失活、延長(zhǎng)作用時(shí)間以及降低毒副作用等特點(diǎn)[6,7]。

聚合物囊泡的膜穩(wěn)定性好，但用于藥物包載時(shí)可能影響藥物的釋放速率，達(dá)到藥物作用有效濃度時(shí)間長(zhǎng)，影響治療效果[8]。不同嵌段聚合物制備的聚合物囊泡具有不同的膜厚度以及滲透特性。H+分子小、極性強(qiáng)、對(duì)囊泡膜的滲透性弱，Wu 等[6,9]的研究將H+的透膜性能作為考察囊泡膜壁的指標(biāo)，通過(guò)考察H+的跨膜特性評(píng)估囊泡膜的滲透性，進(jìn)一步模擬研究囊泡內(nèi)外可否形成H+跨膜梯度，為囊泡的主動(dòng)載藥提供依據(jù)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)1,4-二氧六環(huán)可對(duì)膜滲透特性進(jìn)行調(diào)節(jié)，有利于藥物包載。8-羥基-1,3,6-三磺酸芘鈉鹽（HPTS）是一種pH 響應(yīng)性的熒光探針，特定波長(zhǎng)下的熒光強(qiáng)度隨著溶液的pH 值發(fā)生變化，可用于監(jiān)測(cè)溶液的酸堿性。因此，本文采用H+跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)考察聚合物囊泡的滲透性，對(duì)幾種不同聚合物材料制備的囊泡和脂質(zhì)體進(jìn)行比較 ，以 pH 敏感熒光探針HPTS 對(duì)載藥相關(guān)的透膜性能以及1,4-二氧六環(huán)對(duì)聚合物囊泡膜的透過(guò)性影響進(jìn)行了考察[9]，并與脂質(zhì)體進(jìn)行對(duì)比。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器和材料

紫外分光光度儀（UV-2401PC，Shimadzu，日本），粒度/Zeta 電位測(cè)量?jī)x， （NICOMPTM380 ZLS，NICOMP，美國(guó)），熒光分光光度儀（LS55 Luminescence spectroscopy，Perkin Elmer，英國(guó)），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（R-200，Buchi，德 國(guó)），Satoris Mettler AE200 天 平（Satoris，德國(guó)），PHS-3TC pH 計(jì)（上海天達(dá)儀器，中國(guó)），葡聚糖凝膠（Sepharose CL-4B, Pharmacia，瑞典），8-羥基-1,3,6-三磺酸芘鈉鹽(8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonic acid trisodium salt，HPTS，Acros，美國(guó)），大豆卵磷脂（上海愛(ài)康精細(xì)化工有限公司，中國(guó)），膽固醇（上海如吉生物科技發(fā)展有限公司，中國(guó)），MPEG-PLGA（實(shí)驗(yàn)室自合成），PBD-b-PEO（聚氧乙烯-聚丁二烯，Polymer Source, 加拿大）， PS-b-PEO（聚氧乙烯-聚苯乙烯，復(fù)旦大學(xué)高分子科學(xué)系黃駿廉教授惠贈(zèng)），1,4-二氧六環(huán)（1,4-dioxane，AR，上海諾泰化工有限公司），其余試劑均為分析純（中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司，中國(guó)）。

1.2 聚合物囊泡及脂質(zhì)體的制備

以開(kāi)環(huán)聚合法合成PEG-PLGA，將20 mg PEG-PLGA 溶于2 ml 丙酮，緩慢注入PBS 緩沖液（0.01 mol/L）中自組裝制備聚合物囊泡（PSs-PLGA），超濾濃縮備用。薄膜分散法制備脂質(zhì)體及兩種聚合物囊泡（PBD-b-PEO、PS-b-PEO），將15 mg 大豆磷脂與5 mg 膽固醇混合溶于10 ml 二氯甲烷中，20 mg PBD-b-PEO、20 mg PS-b-PEO 分別溶于10 ml二氯甲烷中，3 種載體材料分別采用旋轉(zhuǎn)揮發(fā)法成膜，減壓干燥24 h 后用PBS 緩沖液（0.01 mol/L）水化，冰浴探頭超聲得到脂質(zhì)體、PSs-PBD 和PSs-PS，超濾濃縮備用[10]。

1.3 聚合物囊泡的穩(wěn)定性

取適量已制備的脂質(zhì)體和3 種聚合物囊泡，在4 ℃恒溫箱內(nèi)靜置，測(cè)量并記錄時(shí)間t為0、2、4、8、15、20、30 d 時(shí)的粒徑，觀察溶液分層和沉淀情況。同上，另取一組上述溶液，在40 ℃恒溫箱內(nèi)靜置，重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)。

1.4 聚合物囊泡的膜滲透性

在聚合物囊泡對(duì)藥物的包載釋放中，囊泡膜壁的組成成分和滲透性起著重要作用。研究者將H+的透膜性能作為考察囊泡膜壁的指標(biāo)，研究H+的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)可用于囊泡膜的滲透性研究。本文采用H+跨膜滲透考察囊泡的膜滲透性，對(duì)幾種不同聚合物材料制備的囊泡和脂質(zhì)體做出對(duì)比。

1.4.1 HPTS 作為pH 敏感熒光探針

HPTS 是pH 響應(yīng)性的熒光探針，熒光強(qiáng)度隨著溶液pH 值變化而發(fā)生變化，用于監(jiān)測(cè)溶液的酸堿性。HPTS 的激發(fā)波長(zhǎng)（λex）分別是403 nm 和454 nm，發(fā)射波長(zhǎng)（λem）是 509 nm，激發(fā)波長(zhǎng)的強(qiáng)度之比（I454/I403）與HPTS 溶液體系的pH 相關(guān)，而發(fā)射波長(zhǎng)與HPTS 溶液體系的pH 無(wú)關(guān)。根據(jù)這些性質(zhì)，HPTS 作為pH 敏感的熒光探針可用于測(cè)定聚合物囊泡外水相的pH 值變化[6]。

配制一系列不同pH 值梯度的緩沖溶液，分別加入適量HPTS（濃度為2.5 μmol/L），檢測(cè)并記錄激發(fā)光波長(zhǎng)在403 nm 和454 nm 的熒光強(qiáng)度I403和I454，分別將I403/I454和I454/I403與pH 值按Boltzmann函數(shù)進(jìn)行曲線(xiàn)擬合，得到I403/I454和I454/I403與pH 值的相關(guān)關(guān)系。

1.4.2 聚合物囊泡外水相的pH 測(cè)定

制備聚合物囊泡和脂質(zhì)體，方法同“1.2”項(xiàng)。用0.2 mol/L 的檸檬酸緩沖溶液（pH 值 4.0）代替pH 值7.4 的PBS 溶液（0.01 mol/L）。將聚合物囊泡或脂質(zhì)體過(guò)Sepharose CL-4B 柱，生理鹽水洗脫。將上述聚合物囊泡或脂質(zhì)體混懸液中加入適量HPTS（濃度為2.5 μmol/L），檢測(cè)并記錄激發(fā)光波長(zhǎng)在403 nm 和454 nm 的熒光強(qiáng)度I403和I454。根據(jù)I454/I403與pH 值的相關(guān)性計(jì)算囊泡外水相的pH 值與H+濃度。

1.4.3 H+跨膜速率的計(jì)算

根據(jù)Fick’s 第一定律，H+從單個(gè)聚合物囊泡擴(kuò)散到外水相的速率為：

式中，M 為H+由聚合物囊泡傳播至外水相的量，A 為聚合物囊泡的表面積，K 為H+在聚已內(nèi)酯（囊泡的膜層）與水中的分配系數(shù)，D 為H+的傳播系數(shù)，L 為聚合物囊泡的膜厚，△C 為囊泡的內(nèi)水相H+濃度（Cin）和外水相H+濃度(Cout)之差。因此，囊泡外水相中H+濃度為：

式中，Vin為囊泡內(nèi)腔體積，Vout為外水相體積。單個(gè)囊泡內(nèi)腔體積Vin根據(jù)公式Vin=4/3π(D/2-L)3計(jì)算，其中，D 為囊泡的粒徑的平均數(shù)。由于K 值未知，所以可用表觀擴(kuò)散系數(shù)D*代替DK。而由于Cin為定值0.1 mmol/L，因此方程（2）可轉(zhuǎn)化為：

參考文獻(xiàn)[9]進(jìn)行推導(dǎo)，同時(shí)囊泡外水相中H+濃度與時(shí)間可按方程Cout+Cin=擬合，其中：

由于實(shí)驗(yàn)中t（s）>>B，表明聚合物囊泡外水相中H+濃度（pH 值）與t1/2成正比，因此方程（3）最終可轉(zhuǎn)化為：

將聚合物囊泡外水相中H+濃度（pH 值）和時(shí)間按方程（4）擬合后，可求算H+在聚合物囊泡跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中的表觀擴(kuò)散系數(shù)D*。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 聚合物囊泡及脂質(zhì)體的制備

嵌段共聚物在溶液中自組裝形成聚合物囊泡的行為與共聚物疏水鏈段與親水鏈段的比例有關(guān)，當(dāng)親水端比例為20%～40%時(shí)為囊泡的形成區(qū)域。PEG 與PLGA 以25∶75（w/w）的比例合成PEGPLGA，以溶劑注入法在溶液中自組裝制備PSs-PLGA，囊泡呈明顯的圓形囊壁狀結(jié)構(gòu)，外壁厚度d 約為10 nm，粒徑為（113.7±18.5）nm[10,11]。以薄膜揮發(fā)法制備了PSs-PBD 和PSs-PS 及脂質(zhì)體，粒徑分別為（139.2±13.1）、（128.0±12.54）、（132.1 ±10.5）nm。

2.2 聚合物囊泡的穩(wěn)定性

粒徑穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1，與脂質(zhì)體相比，3 種聚合物囊泡在4 ℃放置的粒徑變化均更小，不易出現(xiàn)沉淀和分層，而且隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)，這種趨勢(shì)仍保持，說(shuō)明聚合物囊泡相較脂質(zhì)體更穩(wěn)定。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，在40 ℃條件下，脂質(zhì)體出現(xiàn)結(jié)構(gòu)的破壞無(wú)法測(cè)定粒徑，PSs-PLGA 也逐漸顯示結(jié)構(gòu)的破壞，而PSs-PBD 和PSs-PS 的粒徑相對(duì)保持較好，聚合物囊泡的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性?xún)?yōu)于脂質(zhì)體。

圖1 不同溫度聚合物囊泡及脂質(zhì)體的粒徑穩(wěn)定性

2.3 聚合物囊泡的膜滲透性

2.3.1 HPTS 作為pH 值敏感的熒光探針

圖2 為HPTS 在不同pH 值的緩沖液中的熒光激發(fā)光譜圖。如圖2 所示，HPTS 的熒光激發(fā)光光譜有明顯的pH 值依賴(lài)性。pH 值10.0 時(shí)，HPTS在454 nm 的熒光強(qiáng)度最高，而在403 nm 熒光強(qiáng)度最低，表明HPTS 的大部分-OH 離子化。隨著pH 的降低，HPTS 的-O-質(zhì)子化逐漸增多，HPTS 在454 nm 的熒光強(qiáng)度逐漸降低，而在403 nm 的熒光強(qiáng)度逐漸升高。當(dāng)pH 值< 6.0，454 nm 峰基本消失，而403 nm 峰強(qiáng)度隨著pH 值的降低繼續(xù)逐漸升高。

圖2 HPTS (2.5 μmol/L)與緩沖溶液pH 值的激發(fā)光譜(λem = 509 nm)

將I454/I403或I403/I454對(duì)pH 值作圖，如圖3 所示，I454/I403隨pH 值升高而增加。將I454/I403或I403/I454對(duì)pH 值按Boltzmann 函數(shù)回歸，即可得到I454/I403或I403/I454與pH 值的相關(guān)關(guān)系。在特定pH 范圍內(nèi)，可通過(guò)I403/I454與pH 值的關(guān)系來(lái)測(cè)定聚合物囊泡外水相pH 值。

圖3 HPTS 校準(zhǔn)曲線(xiàn)(I454/I403 或I403/I454 與pH 的關(guān)系)

I403/I454與pH 值：，R=0.995

2.3.2 聚合物囊泡外水相的pH 測(cè)定和H+跨膜速率的計(jì)算

聚合物囊泡或脂質(zhì)體外水相pH 值測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。將囊泡外水相中H+濃度[H+]（Y）對(duì)t1/2(X)作圖（圖4），結(jié)果表明囊泡外水相中H+濃度與t1/2呈線(xiàn)性相關(guān)。

表1 聚合物囊泡和脂質(zhì)體外水相中的氫離子濃度和pH 值(n=3)

圖4 氫離子濃度與t1/2 的線(xiàn)性關(guān)系

脂質(zhì)體：Y= 0.646 4X－0.442 3（R= 0.989）；PSs -PLGA：Y= 0.028 8X+ 0.008 7 （R= 0.984）；PSs-PBD：Y= 0.031 1X+ 0.001（R= 0.983）；PSs-PS：Y=0.000 2X+ 0.03（R= 0.958）

從回歸方程的斜率可知，脂質(zhì)體中H+的釋放速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于囊泡中H+的釋放，而3 種聚合物囊泡相比，PSs-PLGA 的釋放速率大于PSs-PS，與PSs-PBD 沒(méi)有顯著差異，PSs-PS 在測(cè)定時(shí)間內(nèi)幾乎沒(méi)有H+透膜現(xiàn)象發(fā)生，這與材料的屬性密切相關(guān)。將上述脂質(zhì)體和PSs -PLGA 兩直線(xiàn)的斜率代入方程（10）：

求得H+的表觀擴(kuò)散系數(shù)。其中Cin= 0.1 mmol/L，Vout=2 ml，計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明，H+在脂質(zhì)體的表觀擴(kuò)散系數(shù)D*=8.39×10-4cm2/s，是H+在PSs-PLGA 的表觀擴(kuò)散系數(shù)D*=3.51×10-8cm2/s 的2.39×104倍。囊泡膜壁對(duì)H+的滲透性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于脂質(zhì)體。這一性質(zhì)將既有利于囊泡內(nèi)被包封藥物的保存，又表明囊泡內(nèi)外可以建立H+跨膜梯度，為囊泡的主動(dòng)載藥提供依據(jù)。

表2 脂質(zhì)體和聚合物囊泡的膜表觀擴(kuò)散系數(shù)(D*)

2.3.3 1,4-二氧六環(huán)對(duì)聚合物囊泡滲透性的調(diào)節(jié)作用

聚合物囊泡的膜壁較厚，而且分子間排列結(jié)構(gòu)緊密，所以對(duì)分子的滲透性低。考察1,4-二氧六環(huán)對(duì)PEG-PLGA 以及PBD-b-PEO，PS-b-PEO 制備的囊泡的膜透過(guò)能力的影響。囊泡外水相加入1,4-二氧六環(huán)室溫孵育，濃度分別是5%、15%、20%，按時(shí)間點(diǎn)測(cè)定H+濃度，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖5。隨著囊泡外水相中1,4-二氧六環(huán)含量的增加，由5%～20%，囊泡膜層對(duì)H+的滲透能力加強(qiáng)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明1,4-二氧六環(huán)對(duì)PEG-PLGA 囊泡膜的滲透性具有很好的調(diào)節(jié)作用，其作用與囊泡外水相中的1,4-二氧六環(huán)含量成正相關(guān)（P<0.05）。1,4-二氧六環(huán)對(duì)聚合物囊泡的滲透能力有顯著提高。

圖5 不同時(shí)間氫離子擴(kuò)散濃度

3 小結(jié)與討論

本研究采用溶液中自組裝法制備PSs-PLGA，并與不同材料制備的聚合物囊泡以及脂質(zhì)體進(jìn)行穩(wěn)定性及膜滲透特性的考察。HPTS 是pH 響應(yīng)性的熒光探針，熒光強(qiáng)度隨著溶液的pH 值變化而發(fā)生變化，利用HPTS 對(duì)pH 的響應(yīng)性，設(shè)計(jì)H+滲透實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)聚合物囊泡的膜滲透性性能。結(jié)果表明，PSs-PLGA 的膜滲透性較脂質(zhì)體低，而比PBD-b-PEO 和PS-b-PEO 制備的囊泡膜滲透性高，適度的滲透性有利于囊泡中藥物釋放和裝載。同時(shí)1,4-二氧六環(huán)可以作為PSs-PLGA 的膜層增塑劑，調(diào)節(jié)膜的滲透性能，改善PSs-PLGA 的載藥和釋藥能力。FDA 批準(zhǔn)PLGA 作為藥用高分子材料，因其具有良好的生物降解和與分子量相關(guān)的緩釋藥物作用。作為一種與脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)類(lèi)似的納米載體，與聚合物納米粒不同，聚合物囊泡由于是中空殼核結(jié)構(gòu)，因此其藥物釋放更快且載體的降解周期更短。兼具穩(wěn)定性的優(yōu)點(diǎn)，結(jié)合靶向配體的修飾以及聚合物材料合成策略，PLGA 為基礎(chǔ)的聚合物囊泡在藥物靶向遞送中具有廣泛的研究?jī)r(jià)值[12]。