體外人多能干細(xì)胞向間充質(zhì)樣細(xì)胞分化、鑒定和純化方法的研究進(jìn)展

王成剛, 李生振, 史嘉敏, 周 平

（1. 蘭州大學(xué)口腔醫(yī)院頜面外科，甘肅 蘭州 730000； 2. 甘肅省牙頜面重建與生物智能制造重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000； 3. 蘭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院動物學(xué)與生物學(xué)系，甘肅 蘭州 730000）

腫瘤、創(chuàng)傷和先天畸形引起的組織器官喪失通常采用移植技術(shù)進(jìn)行修復(fù)，但在臨床實(shí)踐中，存在組織來源有限、二次手術(shù)、免疫原性和倫理道德等諸多問題。近年來，組織工程技術(shù)的快速發(fā)展實(shí)現(xiàn)了骨、軟骨和肌腱等多種器官的再生，為臨床治療帶來了新的思路［1］。種子細(xì)胞是組織工程技術(shù)三大基本要素之一，目前最常用的種子細(xì)胞為多能干細(xì)胞（pluripotent stem cells，PSCs）［2］。間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs） 是一種經(jīng)典的PSCs，分布于脂肪、臍帶和纖維組織等組織和器官中［3］。MSCs 來源于胚胎早期中胚層和外胚層，具有在體內(nèi)外分化為三胚層譜系細(xì)胞的能力，如骨骼、軟骨和脂肪［4］。同時，MSCs具有較強(qiáng)的擴(kuò)增能力，使其成為再生醫(yī)學(xué)和組織工程中應(yīng)用最多的種子細(xì)胞。MSCs 還參與免疫調(diào)節(jié)、抑制炎癥、組織修復(fù)和分泌細(xì)胞生長因子等生命過程［5-6］。研究［7-8］表明：MSCs 具有修復(fù)骨關(guān)節(jié)炎軟骨、修復(fù)創(chuàng)傷缺損、治療冠狀動脈疾病和治療移植后并發(fā)癥等功效，在基礎(chǔ)研究及臨床治療方面具有廣闊的應(yīng)用前景。但人體來源的MSCs 存在取材不便、來源有限和容易老化等缺點(diǎn)，限制了其應(yīng)用。

MSCs 也可由人胚胎干細(xì)胞 （human embryonic stem cells， hESCs） 或人誘導(dǎo)PSCs（human induced PSCs，hiPSCs） 誘導(dǎo)分化為人PSCs 來源間充質(zhì)干細(xì)胞（human PSCs-derived mesenchymal stem cells，hPSCs-MSCs）［9］。hESCs是受精3~6 d 后胚胎內(nèi)的正常細(xì)胞，主要來源于囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，早期體外培養(yǎng)hESCs 需破壞胚胎，存在倫理問題。研究者［10］在化學(xué)成分明確的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)體外受精胚胎的卵裂球單細(xì)胞分化為hESCs，且不會引起胚胎破裂，因此由hESCs 向MSCs 分化的研究成為了熱點(diǎn)。hiPSCs 與hESCs 相似，是由人體細(xì)胞經(jīng)重編程技術(shù)編輯得到的一類高度未分化細(xì)胞，其來源廣泛，具有自我更新及多向分化潛能，且不具有免疫原性［11］。hPSCs-MSCs具有與成體MSCs 相似的組織學(xué)特點(diǎn)和功能，有效克服了成體MSCs 的不足，其體外增殖能力強(qiáng)、來源豐富且免疫原性風(fēng)險低，因此具有重要的科學(xué)研究意義和臨床應(yīng)用價值［12］。但hPSCs-MSCs 也存在誘導(dǎo)效率低和鑒定標(biāo)準(zhǔn)不明確等問題?，F(xiàn)就hPSCs-MSCs 的分化、鑒定和純化方法進(jìn)行綜述，分析目前存在的問題和不足，并展望其應(yīng)用前景，以期為hPSCs-MSCs 在組織工程中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 hPSCs 向間充質(zhì)樣細(xì)胞分化方法

1.1 hPSCs 向間充質(zhì)樣細(xì)胞分化將hESCs 和hiPSCs 向MSCs 進(jìn)行誘導(dǎo)分化目前已經(jīng)過多次嘗試。2005 年，BARBERI 等［13］報道：將hESCs 與小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞OP9 共培養(yǎng)以促進(jìn)其間充質(zhì)向分化，共培養(yǎng)40 d 后，采用流式細(xì)胞術(shù)分離得到CD73+細(xì)胞，于含胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)1~2 周，誘導(dǎo)獲得具有成纖維細(xì)胞樣形態(tài)表現(xiàn)且陽性表達(dá)MSCs 表面標(biāo)記物的細(xì)胞，即間充質(zhì)樣細(xì)胞。隨后，收集hPSCs 培養(yǎng)過程中分化的細(xì)胞和使用間充質(zhì)培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化的方法被廣泛應(yīng)用。

為了提高誘導(dǎo)分化效率，研究［14］對誘導(dǎo)分化的過程進(jìn)行了優(yōu)化，分為擬胚體（embryoid bodys，EBs）法和單層法。hPSCs 細(xì)胞團(tuán)在懸浮培養(yǎng)過程中形成EBs，并可模擬體內(nèi)胚胎發(fā)育過程，自發(fā)分化為三胚層細(xì)胞，其中中胚層細(xì)胞和外胚層細(xì)胞可進(jìn)一步分化為間充質(zhì)樣細(xì)胞。XU 等［15］采用EBs 法獲得hESCs-MSCs，將H1 hESCs 消化為小團(tuán)塊并于超低黏附培養(yǎng)板中懸浮培養(yǎng)4 d 后獲得EBs，將EBs 轉(zhuǎn)移至明膠包被培養(yǎng)板上培養(yǎng)，將EBs周圍爬出細(xì)胞連續(xù)傳代，獲得間充質(zhì)樣細(xì)胞；懸浮培養(yǎng)5、 7、 10 或14 d 亦可獲得hPSCs-MSCs。SHEYN等［16］利用從EBs 中爬出時間差異獲得2 種間充質(zhì)樣細(xì)胞，均具有多向分化潛能，且早期爬出的細(xì)胞具有更強(qiáng)的成骨分化能力。

將干細(xì)胞培養(yǎng)基中已自發(fā)分化的間充質(zhì)樣細(xì)胞轉(zhuǎn)移至MSCs 培養(yǎng)基中純化，以獲得足夠數(shù)量的細(xì)胞，稱為直接誘導(dǎo)法或單層法。不同實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，以提高實(shí)驗(yàn)效率。OLIVIER 等［17］在使用單層法培養(yǎng)hESCs 的過程中，去除培養(yǎng)基中維持細(xì)胞干性的因子以促進(jìn)細(xì)胞分化，將hESCs克隆邊緣或中央自發(fā)分化的細(xì)胞機(jī)械分離出來，于DMDM+10% FBS+1% 青-鏈霉素+1% 非必需氨基酸的D10 培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 周以上，直至形成較厚和多層的上皮細(xì)胞樣結(jié)構(gòu)，分離該結(jié)構(gòu)即可得到MSCs。該方法具有不需要滋養(yǎng)層細(xì)胞和避免異種細(xì)胞污染的優(yōu)點(diǎn)，但手工挑選缺乏客觀標(biāo)準(zhǔn)，MSCs 中可能混有其他細(xì)胞。研究［18］通過延長干細(xì)胞培養(yǎng)基的換液時間以提高h(yuǎn)ESCs 的自分化效率，或直接采用間充質(zhì)培養(yǎng)基，簡化實(shí)驗(yàn)步驟，從而提高獲得MSCs 的效率。ESCs 培養(yǎng)于含F(xiàn)BS 和堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth facto，bFGF）的間充質(zhì)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)后可獲得大量hESCs-MSCs［19］。LIAN 等［20］在DMEM 中添加血清替代物（serum replacement，SR）、bFGF和血小板源性生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF）培養(yǎng)hESCs 1 周，獲得與MSCs 類似形態(tài)和表面標(biāo)志物的細(xì)胞，且具有多向分化能力。然后在上述培養(yǎng)基中添加了表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF），誘導(dǎo)hiPSCs 分化為MSCs［21］。該方法的優(yōu)點(diǎn)是可采用不含滋養(yǎng)層和不含血清的培養(yǎng)基誘導(dǎo)獲得MSCs，避免了外源性細(xì)胞污染的可能。盡管直接誘導(dǎo)法獲得MSCs 較為方便且實(shí)驗(yàn)過程簡單，但存在分化周期長、分化效率低和無法模擬體內(nèi)胚胎發(fā)育過程等問題。

近年來，經(jīng)三維培養(yǎng)獲得hPSCs-MSCs 的方法受到關(guān)注。YAN 等［22］將消化后的hESCs 置于含Y-27632 的mTeSR1培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)，經(jīng)BMP4 和A83-01 誘導(dǎo)分化及MSCs 培養(yǎng)基培養(yǎng)后，于第20 天消化獲得MSCs 微球。研究［23］顯示：與二維培養(yǎng)比較，三維培養(yǎng)的MSCs 活性更強(qiáng)，并有較好的血管生成能力、抗炎能力和組織再生能力。

1.2 功能化合物促進(jìn)hPSCs 向間充質(zhì)樣細(xì)胞分化常規(guī)方法中誘導(dǎo)hPSCs 分化為MSCs 的效率較低，可在培養(yǎng)基中添加營養(yǎng)物質(zhì)以提高h(yuǎn)PSCs 的自發(fā)分化效率。營養(yǎng)血清中含有促進(jìn)細(xì)胞向中胚層和內(nèi)胚層分化的物質(zhì)，且容易獲得，由此血清通常被添加至培養(yǎng)基中以促進(jìn)細(xì)胞分化，最常用的為FBS［24］。此外，常使用血清替代物（knockout serum replacement，KSR）和白蛋白產(chǎn)品誘導(dǎo)分化細(xì)胞形成EBs［25］。但這些物質(zhì)均含有動物源成分，存在微生物感染、免疫原性風(fēng)險和選擇殺傷作用低等問題，因此尋找可促使細(xì)胞向中內(nèi)胚層分化的功能性化合物成為了研究熱點(diǎn)。

LI 等［26］將重編程的鼠誘導(dǎo)PSCs （induced PSCs，iPSCs） 轉(zhuǎn)移至超低黏附培養(yǎng)板形成EBs，于不含白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）的ES 培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)3 d 后轉(zhuǎn)移至含維甲酸（retinoic acid，RA） 的ES 培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d，后分別于含轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor，TGF）-β1、TGF-β3、bFGF 及骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）-2的ES 培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d，均可誘導(dǎo)iPSCs 向間充質(zhì)樣細(xì)胞分化，且RA+TGF-β1 和RA+TGF-β3 可提高M(jìn)SCs 的成骨分化效率，RA+BMP-2 可提高成軟骨分化效率，表明TGF-β 家族的細(xì)胞因子對干細(xì)胞分化具有重要作用。LIAN 等［21］在培養(yǎng)基中加入EGF 和bFGF 富集MSCs，促進(jìn)其生長增殖。此外，血小板源性生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF）也可能有利于促進(jìn)干細(xì)胞向MSCs分化，提高細(xì)胞增殖能力［14］。BRUSCHI 等［27］發(fā)現(xiàn)：生長因子Wnt3a 和激活素A 在BMP4 的協(xié)同作用下， 培養(yǎng)4 d 即可獲得大量hiPSCs-MSCs。ZHANG 等［28］發(fā)現(xiàn)： 聯(lián)合使用 LLY-507 和AZD5153 可以使hESCs 或hiPSCs 高效地向MSCs轉(zhuǎn)化，獲得的hPSCs-MSCs 具有CD73 和CD105 高表達(dá)特征，并表現(xiàn)出多譜系分化潛能、良好的細(xì)胞活力、促血管生成和免疫調(diào)節(jié)特性。研究［27，29-30］顯示：在hPSCs 的干性維持培養(yǎng)基中加入抑制劑可促進(jìn)hPSCs 分化。CHEN 等［29］在含TGF 途徑抑制劑SB431542 的hiPSC 培養(yǎng)基中培養(yǎng)hPSCs，10 d 后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的中胚層基因表達(dá)上調(diào)而多能性基因表達(dá)下調(diào)，并將分化的細(xì)胞常規(guī)轉(zhuǎn)入MSCs 培養(yǎng)基中誘導(dǎo)分化。LIU 等［30］在hPSCs 培養(yǎng)基中加入ROCK抑制劑，后更換為MSCs 基礎(chǔ)培養(yǎng)基，成功使3 種干細(xì)胞分化為MSCs。研究［27］將hPSCs 培養(yǎng)于含Y-27632 的干性維持培養(yǎng)基中，去除Y-27632 后成功獲得了hPSCs 誘導(dǎo)生成MSCs 的中間產(chǎn)物EBs。

2 hPSCs-MSCs 的純化和鑒定

hPSCs-MSCs 具有較強(qiáng)的自我更新能力，可在傳代過程中被純化［31］。目前最常用的純化方法是將獲得的細(xì)胞轉(zhuǎn)入MSCs 培養(yǎng)基后連續(xù)傳代5~7 次［32］。經(jīng)4 次傳代后，培養(yǎng)皿中的細(xì)胞便呈現(xiàn)均勻的長梭形［33］。此外，石倫剛等［34］將hESCs 懸浮培養(yǎng)10 d 后形成的擬胚體貼壁培養(yǎng)5~7 d，機(jī)械去除中心高密度部分細(xì)胞，保留周圍剩余細(xì)胞連續(xù)傳代， 提高了 hESCs-MSCs 的純化效率。MOORE 等［35］通過細(xì)胞過濾器對產(chǎn)生的MSCs 進(jìn)行純化，細(xì)胞過濾器一般使用不同大小的微孔過濾細(xì)胞從而達(dá)到純化的目的。細(xì)胞過濾的方法可以相對縮短分化周期，但目前尚無統(tǒng)一且高效的hPSCs-MSCs 純化方法，使不同實(shí)驗(yàn)獲得的細(xì)胞純度難以保障［36］。

2006 年，國際細(xì)胞療法學(xué)會間充質(zhì)和組織干細(xì)胞委員會提出了鑒定hMSCs 的最低標(biāo)準(zhǔn)［37］。目前大部分hPSCs-MSCs 鑒定方法均參照此標(biāo)準(zhǔn)或改進(jìn)此標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。但hPSCs-MSCs 作為一種特殊來源的MSCs， 需對其特性做出明確的界定。CHOUDHERY 等［38］在上述標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上提出了鑒定hPSC-MSCs 的最低標(biāo)準(zhǔn)，主要包括：梭形的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)；標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下貼壁生長；陽性表達(dá)CD29、CD44、CD73、CD90 和CD105 等表面標(biāo)志物，且不表達(dá)CD45、CD34、CD14 或CD11b、 CD79a 或CD19 及人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）-DR 等造血干細(xì)胞表面標(biāo)記物； 不表達(dá)OCT4、 SOX2、 Klf4、Nanog、Lin28、TRA-1-60、TRA-1-81 和堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP） 等iPSCs 誘導(dǎo)因子；可以在體外進(jìn)行成脂、成骨及成軟骨分化；不形成畸胎瘤；可以分泌MSC 相關(guān)旁分泌因子。除上述標(biāo)準(zhǔn)中所提出的表面標(biāo)記物外，CD49、CD54、CD146、CD166 和HLA-ABC 也被認(rèn)為是MSCs 的陽性表面標(biāo)記物。與傳統(tǒng)的MSCs 相似，即使是同一批次細(xì)胞，hPSC-MSCs 內(nèi)部也存在表型和功能差異的亞細(xì)胞群。應(yīng)明確與hPSC-MSCs質(zhì)量和功能相關(guān)的標(biāo)記物，生產(chǎn)高質(zhì)量的hPSC-MSCs，以滿足臨床應(yīng)用的需求。

3 hPSCs-MSCs 與成體MSCs 性能比較

與成體MSCs 比較，hPSCs-MSCs 具有來源廣泛、質(zhì)量可控制、可大量生產(chǎn)、低成本和高純度等優(yōu)點(diǎn)。但hPSCs-MSCs 的分化效率較低，EBs 法和單層法均為利用hPSCs 的自發(fā)分化獲得間充質(zhì)樣細(xì)胞，仍未實(shí)現(xiàn)高效的定向誘導(dǎo)分化。目前大多使用基質(zhì)膠、FBS、小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（mouse embryonic fibrolast，MEF）和明膠等動物源性成分誘導(dǎo)分化，但其具有成分復(fù)雜、批次差異及病毒污染等問題，長期誘導(dǎo)可能引起細(xì)胞性狀改變，與臨床應(yīng)用存在較大差距。目前hPSCs-MSCs 尚缺乏高效的細(xì)胞純化方法，且無特異性標(biāo)記物對獲得的間充質(zhì)樣細(xì)胞進(jìn)行鑒定，部分方法獲得的間充質(zhì)樣細(xì)胞可能混雜殘留的hPSCs，有產(chǎn)生畸胎瘤的風(fēng)險，對其進(jìn)行細(xì)致監(jiān)測難度較大。因此，大規(guī)模和高效地獲得高度純化、均一、穩(wěn)定和生物安全性好的間充質(zhì)樣細(xì)胞是亟待解決的關(guān)鍵問題。

4 hPSCs-MSCs 的應(yīng)用前景

單純的iPSCs/ESCs 理論上可無限增殖并具有良好的分化能力，能夠滿足大數(shù)量細(xì)胞需求，但細(xì)胞的自我更新和多能性也可能會導(dǎo)致腫瘤發(fā)生和體內(nèi)移植后的不穩(wěn)定性。將hPSCs 誘導(dǎo)為MSCs 樣細(xì)胞可有利于后續(xù)定向分化，降低致瘤性，且細(xì)胞數(shù)量也可無限獲得。目前，hPSCs-MSCs 的應(yīng)用潛能已表現(xiàn)在多個方面。

與成體來源的MSCs 比較，hPSCs-MSCs 具有更強(qiáng)的增殖能力、較低的免疫原性和更好的免疫調(diào)節(jié)能力［19，30］。hPSCs-MSCs 的免疫調(diào)節(jié)作用已在動物實(shí)驗(yàn)中被廣泛證實(shí)。研究［39］顯示：hiPSCs-MSCs 與納巴霉素聯(lián)合作用可有效延長胰島移植存活時間，甚至誘導(dǎo)50%的受體產(chǎn)生免疫耐受。二者協(xié)同作用可以抑制炎癥細(xì)胞的滲透，并促進(jìn)胰島素持續(xù)釋放。YU 等［40］發(fā)現(xiàn)：hiPSCs-MSCs 在心肺復(fù)蘇中具有免疫調(diào)節(jié)作用，小鼠心肺復(fù)蘇后注射定量hiPSCs-MSCs 可提高其生存率。研究［41］顯示：hiPSCs-MSCs 能夠影響巨噬細(xì)胞M1 表型和M2 表型之間的平衡，使可增加細(xì)胞損傷的M1 表型相關(guān)標(biāo)記物水平降低和清除碎屑、促進(jìn)血管化及組織重塑的M2 表型相關(guān)標(biāo)記物水平升高，證實(shí)hiPSCs-MSCs 的免疫調(diào)節(jié)作用，并為缺血再灌注所造成腦損傷提供新的治療思路。CHUNG 等［42］研究顯示：由脂肪源性干細(xì)胞分化的iPSCs-MSCs仍保持MSCs 良好的分化能力，iPSCs-MSCs 與TGF-β 共同作用可治療肌肉和骨骼損傷，TGF-β可下調(diào)組織相容性Ⅰ類復(fù)合物表達(dá)，降低免疫排斥反應(yīng)。 QIN 等［43］發(fā)現(xiàn)： hESCs-MSCs 可降低B10.RⅢ小鼠嚴(yán)重實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎的發(fā)生。YANG 等［44］發(fā)現(xiàn)：將hiPSCs-MSCs 注射至腹膜內(nèi)，可增加結(jié)腸長度并減小潰瘍面積，且hiPSCs-MSCs 可通過腫瘤壞死因子誘導(dǎo)蛋白6（tumor necrosis factor-induced protein-6， TSG-6）上調(diào)腸上皮表面標(biāo)記物CD44 的表達(dá)，促進(jìn)黏膜愈合，證實(shí)hiPSCs-MSCs 的黏膜治療作用。此外，MSCs 的旁分泌機(jī)制在血管化和肌肉再生中也可發(fā)揮作用［21］。

除調(diào)節(jié)免疫作用，hPSCs-MSCs 也可修復(fù)各類組織缺損。研究［45］顯示：hiPSCs-MSCs 生長于磷酸鈣支架上可促進(jìn)成骨分化并引導(dǎo)骨再生。應(yīng)用BMP-2 基因修飾hiPSCs-MSCs 的磷酸鈣支架對骨礦化能力具有促進(jìn)作用［46］。 通過移植hiPSCs-MSCs 可減輕小鼠后肢缺血和改善肝功能［47］。QI 等［48］構(gòu)建hiPSCs-MSCs 釋放谷胱甘肽過氧化物酶3 （glutathione peroxidase 3，GPx3），hiPSCs-MSCs-GPx3可有效抑制肝衰老，降低肝損傷。 JIANG 等［49］發(fā)現(xiàn)： 經(jīng)玻璃體腔移植的hiPSCs-MSCs 可有效地將功能線粒體提供給視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，防止線粒體損傷所致的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞退變。GUO 等［50］發(fā)現(xiàn)：在心肌梗死小鼠模型中多次靜脈注射hiPSCs-MSCs 可不同程度地恢復(fù)小鼠的心臟功能。YOON 等［51］研究顯示：hESCs-MSCs 可恢復(fù)順鉑損傷后卵巢的結(jié)構(gòu)和功能，通過向小鼠腹腔連續(xù)10 d 注射順鉑，建立卵巢早衰模型，靜脈注射hESCs-MSCs 后發(fā)現(xiàn)其可有效保護(hù)雌鼠卵巢功能并保留生育能力，為hESCs-MSCs 治療女性卵巢早衰的臨床應(yīng)用提供了新的思路。

5 總結(jié)與展望

綜上所述，hPSCs 可通過EBs 法和單層法分化為間充質(zhì)樣細(xì)胞，hPSCs-MSCs 表現(xiàn)出與成體MSCs 相似的生物學(xué)特點(diǎn)與功能，還具有來源廣泛、低成本和免疫原性更低等優(yōu)點(diǎn)，進(jìn)一步彌補(bǔ)了成體MSCs 的不足，具有重要的科研意義和臨床應(yīng)用價值。同時，hPSCs-MSCs 可促進(jìn)血管化和組織重塑，用于修復(fù)各類組織缺損，并具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)和免疫抑制能力等作用，使其成為再生醫(yī)學(xué)和組織工程中應(yīng)用最多的種子細(xì)胞。hPSCs-MSCs 能夠在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域和組織工程領(lǐng)域展現(xiàn)出更大的優(yōu)勢與價值，具有巨大的科研價值和廣闊的臨床應(yīng)用前景。