新型冠狀病毒快速檢測(cè)標(biāo)本前處理方法改良及其效果評(píng)價(jià)

萬(wàn)廣財(cái), 李 鋌, 孫唯秀, 于秀艷

（吉林省腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科，吉林 長(zhǎng)春 130012）

新型冠狀病毒又稱(chēng)嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）是β 屬的單股正鏈RNA 病毒，直徑為60~140 nm，病毒外觀呈棘突樣的球形［1-2］。SARS-CoV-2 具有傳染性強(qiáng)、傳播速度快和易突變等特點(diǎn)，在國(guó)內(nèi)外流行性傳播［3-4］。隨著SARSCoV-2 的變異，其毒力減弱，但免疫逃逸能力增強(qiáng)。奧密克戎是SARS-CoV-2 的變異株，易感染人的支氣管，但對(duì)肺部的損傷較輕。目前主要流行的變異株為奧密克戎XBB.1.5、 XBB.1.16 和 EG.5變異株。EG.5 變異株的F456L 和Q52H 基因發(fā)生突變，導(dǎo)致其對(duì)人體的呼吸道上皮細(xì)胞具有較強(qiáng)的親和力。及時(shí)和高效地檢出SARS-CoV-2 及其變異株對(duì)新型冠狀病毒感染（corona virus disease 2019，COVID-19）的防治尤為重要。

《新型冠狀病毒肺炎防控方案第十版》指南［5］將實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR） 法作為確診SARS-CoV-2 陽(yáng)性患者的金標(biāo)準(zhǔn)［6］。RT-qPCR 法具有靈敏度、特異性和精確性較高的特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于SARS-CoV-2 核酸檢驗(yàn)［7］。目前多采用胍鹽聯(lián)合56 ℃、30 min 水浴的前處理方式以提高滅活效果，但其對(duì)SARS-CoV-2檢測(cè)結(jié)果的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。此外，SARS-CoV-2附著于呼吸道上皮細(xì)胞，傳統(tǒng)的SARS-CoV-2 核酸檢測(cè)方法通過(guò)單管震蕩SARS-CoV-2 標(biāo)本提高上皮細(xì)胞中SARS-CoV-2 檢出率，該方法使用廣泛，但較為耗時(shí)。本研究通過(guò)改良的SARS-CoV-2 前處理檢測(cè)技術(shù)，提高SARS-CoV-2 核酸檢測(cè)效率，為高效和快速地檢測(cè)SARS-CoV-2 及相關(guān)冠狀病毒提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2022 年3 月—2022 年9 月吉林省腫瘤醫(yī)院SARS-CoV-2 陰性標(biāo)本90 例和SARS-CoV-2 陽(yáng)性標(biāo)本30 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①有RT-qPCR 檢測(cè)結(jié)果；②有內(nèi)參基因的擴(kuò)增曲線。排除標(biāo)準(zhǔn)：① 無(wú)RT-qPCR 檢測(cè)結(jié)果；② 無(wú)內(nèi)標(biāo)基因的擴(kuò)增曲線。研究符合《赫爾辛基宣言》原則。

1.2 主要試劑和儀器核酸提取試劑（批號(hào)：20210802A） 和SARS-CoV-2 核酸擴(kuò)增試劑（批號(hào)：20210802A）（上海伯杰醫(yī)療科技有限公司），鄭州標(biāo)源質(zhì)控品（批號(hào)：20210216，濃度為316~3 160 copies·mL－1），含胍鹽的病毒采樣管（批號(hào)：20210168，北京熱景生物技術(shù)股份有限公司）。全自動(dòng)核酸提取儀（BG-Abot-96，上海伯杰醫(yī)療科技有限公司）， RT-qPCR 儀（ABI7500， 美國(guó)Thermofisher 公司），數(shù)顯三用恒溫水箱（LH-600，上海皓莊儀器有限公司）。

1.3 研究對(duì)象分組分別用傳統(tǒng)方法和2 種改良方法檢測(cè)90 例SARS-CoV-2 陰性標(biāo)本及30 例SARS-CoV-2 陽(yáng)性標(biāo)本，按照檢測(cè)方法分為傳統(tǒng)組、改良1 組和改良2 組。傳統(tǒng)組采用胍鹽聯(lián)合56 ℃、30 min 水浴方式滅活、單管震蕩、標(biāo)本去編號(hào)和單手開(kāi)蓋方式檢測(cè)；改良1 組采用胍鹽滅活、單管震蕩、標(biāo)本去編號(hào)和單手開(kāi)蓋方式檢測(cè)；改良2 組采用胍鹽滅活，上下、左右和180 度角的方式整批震蕩，標(biāo)本去編號(hào)及單手開(kāi)蓋方式檢測(cè)。見(jiàn)圖1。

圖1 改良2 組上下、左右和180 度角的震蕩方式示意圖Fig. 1 Schematic diagram of oscillation ways of vertical,horizontal, and at a 180-degree angle in modified 2 group

1.4 核酸提取各組分別加入200 μL 待測(cè)標(biāo)本、3 個(gè)陰性對(duì)照、1 個(gè)陽(yáng)性對(duì)照和1 個(gè)質(zhì)控品（鄭州標(biāo)源生物科技有限公司）。采用上海伯杰全自動(dòng)核酸提取儀及其配套提取試劑進(jìn)行核酸提取。

1.5 RT-qPCR 法檢測(cè)各組標(biāo)本采用RT-qPCR法檢測(cè)各組標(biāo)本中SARS-CoV-2 內(nèi)參基因、N 基因和ORF1ab 基因。反應(yīng)體系：12 μL 核酸擴(kuò)增反應(yīng)液、4 μL 酶混合液和4 μL ORF1ab/N 反應(yīng)液。反應(yīng)條件：50 ℃、10 min 逆轉(zhuǎn)錄，95 ℃、5 min 預(yù)變性，95 ℃、10 s，55 ℃、40 s，共45 個(gè)循環(huán)。每次實(shí)驗(yàn)使用同一批號(hào)試劑平行測(cè)量3 次，取平均循環(huán)閾值（cycling threshold，Ct） 值，記錄各組標(biāo)本SARS-CoV-2 檢出時(shí)間。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用GraphPad Prism 8.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并繪圖。采用Spearman 相關(guān)分析法分析2 組間Ct 值的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)（r）越接近1，相關(guān)性越強(qiáng)。采用Bland-Altman 法對(duì)2 組間Ct 值進(jìn)行一致性檢驗(yàn)［5］。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組SARS-CoV-2 相關(guān)性分析改良1 組Ct 值（29.87±1.68） 與傳統(tǒng)組Ct 值（29.92±1.65） 具有強(qiáng)相關(guān)性（P<0.01），線性回歸方程為Y=0.992 7X+0.175 6，r=0.975 4（0.966 2—0.982 1）。改良2 組（29.90±1.63） 與傳統(tǒng)組（29.92±1.65）的Ct 值具有強(qiáng)相關(guān)性（P<0.01），線性回歸方程為Y=0.975 9X+0.704 6，r=0.986 2（0.980 9—0.990 0）。見(jiàn)圖2~4。

圖2 改良1 組和傳統(tǒng)組目的基因擴(kuò)增曲線Fig. 2 Amplification curves of target genes in modified 1 group and traditional group

圖3 改良2 組和傳統(tǒng)組目的基因擴(kuò)增曲線Fig. 3 Amplification curves of target genes in modified 2 group and traditional group

圖4 各組SARS-CoV-2 相關(guān)性分析Fig. 4 Correlation analysis on SARS-CoV-2 between various groups

2.2 各組SARS-CoV-2 一致性檢驗(yàn)改良1 組與傳統(tǒng)組檢測(cè)SARS-CoV-2 陰性標(biāo)本的組間偏差為0.158 2（－0.613 7—0.930 1），檢測(cè)SARS-CoV-2陽(yáng)性標(biāo)本的組間偏差為0.117 0 （－0.403 1—0.637 1），2 組間Ct 值偏差均小于1，證實(shí)改良1 組與傳統(tǒng)組呈良好的一致性。改良2 組與傳統(tǒng)組檢測(cè)SARS-CoV-2 陰性標(biāo)本的組間偏差為0.015 7（－0.550 4—0.581 8），檢測(cè)SARS-CoV-2 陽(yáng)性標(biāo)本的組間偏差為0.022 7（－0.454 1—0.499 4），2 組間Ct 值偏差均小于1，證實(shí)改良2 組與傳統(tǒng)組呈良好的一致性。見(jiàn)圖5。

圖5 各組SARS-CoV-2 一致性檢驗(yàn)Fig. 5 Consistency test for SARS-CoV-2 in various groups

2.3 各組SARS-CoV-2 檢出時(shí)間改良1 組檢測(cè)90 例SARS-CoV-2標(biāo)本檢出時(shí)間為15 min，改良2 組檢測(cè)90 例SARS-CoV-2 標(biāo)本檢出時(shí)間為10 min，傳統(tǒng)組檢測(cè)90 例SARS-CoV-2 標(biāo)本檢出時(shí)間為45 min。與傳統(tǒng)組比較，改良組1 檢出時(shí)間可減少約67%，改良2 組檢出時(shí)間可減少約11%。

3 討 論

SARS-CoV-2 具有極強(qiáng)的傳染力，人群普遍易感；其主要通過(guò)與肺泡上皮細(xì)胞表達(dá)的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）結(jié)合而侵入人體［8-9］。ACE2 可參與SARS-CoV-2全部生命周期活動(dòng)［10］。SARS-CoV-2 侵入人體后，疾病進(jìn)展迅速，主要表現(xiàn)為呼吸困難、嗅覺(jué)和味覺(jué)消失。研究［11-12］表明：奧密克戎變異株的K417N、E484A、N501Y、F456L 和Q52H 基因及Delta 變異株的刺突蛋白發(fā)生變異，使SARS-CoV-2 致病力減弱，免疫逃逸能力增強(qiáng)。因此需要一種快速和高效的核酸檢驗(yàn)方法檢出SARS-CoV-2。

本研究結(jié)果顯示：通過(guò)將胍鹽聯(lián)合56 ℃、30 min 水浴方式滅活改良為胍鹽滅活，可減少約66%的SARS-CoV-2 檢出時(shí)間，2 種滅活方式的Ct值具有強(qiáng)相關(guān)性和良好的一致性，提示胍鹽滅活可替代傳統(tǒng)滅活方式。將單管震蕩改良為上下、左右和180 度角整批震蕩，檢出時(shí)間可減少約11%，2 種震蕩方式的Ct 值具有強(qiáng)相關(guān)性和良好的一致性，提示上下、左右和180 度整批震蕩可替代單管震蕩。改良震蕩方式的檢出時(shí)間更短，為更理想的SARS-CoV-2 檢測(cè)方法。

SARS-CoV-2 對(duì)熱和紫外線敏感，陳培松等［1］研究表明：56 ℃、30min 滅活方式對(duì)SARS-CoV-2核酸檢測(cè)無(wú)明顯影響。胍鹽具有溶解和變性蛋白質(zhì)的作用，可使核蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)消失。同時(shí)胍鹽可滅活核糖核酸酶（ribonuclease，RNase），保護(hù)SARS-CoV-2 核酸結(jié)構(gòu)完整性［13-14］。研究［15-20］顯示：胍鹽和56 ℃、30 min 水浴方式均可有效滅活病毒， 保證SARS-CoV-2 核酸含量基本不變，與本研究結(jié)果一致。在采用胍鹽滅活的前提條件下，56 ℃、30 min 水浴對(duì)上皮細(xì)胞中SARS-CoV-2 核酸含量改變無(wú)明顯影響，因此在有胍鹽滅活的前提條件下，不推薦56℃、30 min 水浴的滅活方式。

本研究采用的改良SARS-CoV-2 標(biāo)本檢測(cè)方法與傳統(tǒng)檢測(cè)方法具有強(qiáng)相關(guān)性和良好一致性，可節(jié)約核酸檢出時(shí)間，提升SARS-CoV-2 核酸檢測(cè)效率，可為高效和快速地檢測(cè)SARS-CoV-2 及相關(guān)冠狀病毒提供參考。