黏蛋白型O-糖基化與結(jié)直腸癌基礎(chǔ)和臨床研究進(jìn)展

汪澤慧 張 軍

南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院消化內(nèi)科（210006）

O-糖基化是指絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸的羥基共價連接碳水化合物殘基的過程，根據(jù)初始聚糖的不同，可進(jìn)一步細(xì)分為O-連接α-N-乙酰半乳糖胺（N-acetylgalactosamine,GalNAc）和O-連接β-N-乙酰氨基葡萄糖。前者最初在黏蛋白（mucin, MUC）中被發(fā)現(xiàn)，故又被稱為MUC 型O-糖基化。MUC 型O-糖基化由多肽GalNAc 轉(zhuǎn)移酶家族啟動，這些酶催化GalNAc 添加到肽鏈的絲氨酸或蘇氨酸殘基上，形成Tn抗原結(jié)構(gòu)。正常情況下，各種糖基轉(zhuǎn)移酶逐步向Tn 抗原的GalNAc 殘基添加額外的糖，形成所謂的核心結(jié)構(gòu)。這些核心結(jié)構(gòu)可以進(jìn)一步延伸，與分支構(gòu)成具有生理活性的O-聚糖結(jié)構(gòu)。在正常細(xì)胞中，MUC 型O-聚糖的成熟通常會被拉長并產(chǎn)生支鏈，末端最終被唾液酸或巖藻糖覆蓋。癌細(xì)胞僅表達(dá)早期生物合成的中間產(chǎn)物，也稱為截短的O-聚糖，表現(xiàn)為單一的GalNAc（Tn 抗原）、被唾液酸覆蓋的GalNAc（sTn 抗原）或核心-1 二糖GalNAc（T 或TF 抗原），Tn 抗原、sTn 抗原和T 抗原的過度表達(dá)與結(jié)直腸癌（colorectal cancer,CRC）的發(fā)生和不良預(yù)后相關(guān)[1]。這些O-聚糖的截斷很大程度上歸因于糖基化過程中關(guān)鍵成分的異?；蛉毕荩渲邪ǖ谝徊缴锖铣擅付嚯腉alNAc 轉(zhuǎn)移酶家族和各類O-聚糖延伸酶，如核心1 β-1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶1（core 1 beta-1,3-galactosyltransferase 1, C1GalT1）及其特定的分子伴侶Cosmc 和β1，3-N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶等。本文簡要綜述MUC 型O-糖基化與CRC 基礎(chǔ)研究及其臨床應(yīng)用的研究進(jìn)展，旨在為闡明CRC 的發(fā)生、發(fā)展機制，克服腫瘤耐藥，探索新型治療手段和篩選簡便高效的診斷篩查標(biāo)志物提供新的思路。

一、MUC型O-糖基化與CRC的發(fā)生、發(fā)展

CRC 是全球癌癥死亡的第二大病因。CRC 細(xì)胞內(nèi)O-糖基化相關(guān)的糖基轉(zhuǎn)移酶、分子伴侶和表面的Tn 抗原、sTn 抗原、T 抗原都存在不同程度的失調(diào)，且以自身獨特方式參與了CRC 的發(fā)生和發(fā)展，包括侵襲和轉(zhuǎn)移、異常凋亡和增殖、免疫逃逸等。

1.MUC 型O-糖基化與CRC 的轉(zhuǎn)移：O-糖基化是蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的常見修飾之一，參與許多細(xì)胞事件，從而影響腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移。Yoon 等[2]使用MUC 型O-糖基化特異性抑制劑芐基-α-GalNAc 處理MUC 高表達(dá)的HM7 結(jié)腸癌細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞與內(nèi)皮白細(xì)胞黏附分子1 的結(jié)合活性和對基質(zhì)膠涂層多孔過濾器的侵襲性均顯著降低。內(nèi)皮白細(xì)胞黏附分子1作為識別MUC表面的唾液酸Lea和唾液酸Lex結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，在血管內(nèi)滲和（或）外滲中起重要作用。這一發(fā)現(xiàn)提示了異常的MUC 型O-聚糖具有促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的潛力，同時驗證了另一發(fā)現(xiàn)，即黏液性CRC 患者的預(yù)后較非黏液性CRC更差[3]。

不同于異常MUC 型O-糖基化中其他O-聚糖延伸酶的表達(dá)下調(diào)，Hung 等[4]的研究發(fā)現(xiàn)MUC 型O-糖基化核心1 結(jié)構(gòu)的限速酶，即C1GalT1 在CRC 中通常過表達(dá)，且高表達(dá)C1GalT1 的CRC 患者5 年存活率較低表達(dá)者低20%。一方面，C1GalT1 過表達(dá)能修飾成纖維細(xì)胞生長因子受體2 上的O-聚糖并增強其磷酸化，促進(jìn)了結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲行為和癌癥干細(xì)胞樣特性。另一方面，癌細(xì)胞中C1GalT1過表達(dá)可能破壞糖基轉(zhuǎn)移酶之間的競爭平衡，促進(jìn)與核心1相關(guān)碳水化合物結(jié)構(gòu)的形成，如sTn 抗原和T 抗原。前者可以破壞半乳凝素與末端半乳糖殘基的相互作用，促進(jìn)單個細(xì)胞從原發(fā)性腫瘤塊中釋放，便于腫瘤細(xì)胞的進(jìn)一步擴散和種植[1]。后者可以通過增強腫瘤細(xì)胞與半乳凝素3的相互作用，促進(jìn)CRC的發(fā)生和血行傳播，具體機制包括促進(jìn)腫瘤細(xì)胞栓子的形成與存活、腫瘤細(xì)胞-內(nèi)皮異型黏附和上皮癌細(xì)胞表皮生長因子受體的二聚化，促進(jìn)其活化與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[5-6]。

一項基于3 個基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫（GEO）的數(shù)據(jù)集（GSE37182、GSE39582、GSE103512）和癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫的研究[7]發(fā)現(xiàn)，CRC 組織中核心3 合酶的mRNA 和蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)，是與CRC 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良相關(guān)的潛在生物學(xué)標(biāo)志物。通過向多種結(jié)腸癌細(xì)胞株內(nèi)重新轉(zhuǎn)染核心3合酶后發(fā)現(xiàn)，表達(dá)生成的核心3 O-聚糖可能通過MUC1/p53/miR-200c 依賴性信號級聯(lián)促進(jìn)CRC 細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的逆轉(zhuǎn)，這進(jìn)一步表明了核心3 O-聚糖調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的可塑性以及控制癌癥轉(zhuǎn)移的潛力[8]。

作為調(diào)節(jié)C1GalT1 活性的特異性分子伴侶，Cosmc 在人類CRC 中的病理作用則存在較多爭議。部分體外實驗發(fā)現(xiàn)，Cosmc低表達(dá)通過O-糖基化機制增強了癌細(xì)胞的惡性行為，如細(xì)胞生長、黏附、遷移和侵襲[9]。然而，Huang 等[10]通過HCT116 結(jié)腸癌細(xì)胞株的研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)的Cosmc 可以誘導(dǎo)異常的O-糖基化，促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的惡性表型。由此可見，Cosmc在CRC中的差異表達(dá)無法單純用異常O-糖基化理論進(jìn)行解釋[11]。多種CRC 細(xì)胞株中Cosmc的表達(dá)上調(diào)，且與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激之間呈現(xiàn)出很強的相關(guān)性。因此，Cosmc 在CRC中的病理作用機制可能是通過激活上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化增強腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，而與異常的O-糖基化無關(guān)[12]。這項研究為未來探索Cosmc與CRC之間的關(guān)系提供了新的思路。

2.MUC 型O-糖基化與CRC 細(xì)胞的抗凋亡和增殖：聚糖在各類腫瘤中通過死亡受體影響信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，其表達(dá)水平和結(jié)構(gòu)在腫瘤進(jìn)展過程中發(fā)生顯著變化，且在腫瘤類型中高度可變，提示聚糖是各種癌細(xì)胞對自我程序性死亡敏感性不同的重要原因之一。

在O-聚糖延伸酶中，C1GalT1 及其分子伴侶Cosmc 具有促進(jìn)腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（tumor necrosis factorrelated apoptosis-inducing ligand,TRAIL）誘導(dǎo)O-糖基化死亡受體DR5 寡聚化，進(jìn)而起到維持死亡受體穩(wěn)定的作用。TRAIL屬于腫瘤壞死因子超家族的死亡配體，在各種細(xì)胞類型中表達(dá)為Ⅱ型跨膜蛋白，包括細(xì)胞毒性T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞。這些細(xì)胞上的TRAIL 通過與TRAIL 受體、O-糖基化死亡受體DR4 和DR5 結(jié)合來觸發(fā)細(xì)胞凋亡。然而，關(guān)于Cosmc 突變的CRC 細(xì)胞株研究發(fā)現(xiàn)，截短的O-GalNAc 聚糖、Tn 抗原和sTn 抗原的過度表達(dá)會損害O-糖基化死亡受體DR4 和DR5 的同源寡聚化和穩(wěn)定性，削弱TRAIL 誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡對CRC 腫瘤細(xì)胞的清除能力，給腫瘤細(xì)胞提供了極大的存活優(yōu)勢[13-14]。

此外，Bagodonaite 等[15]觀察到多肽N-乙酰半乳糖氨基轉(zhuǎn)移酶6 在結(jié)腸腺癌中表達(dá)上調(diào)。為進(jìn)一步明確該酶在結(jié)腸腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，有研究[13]利用表達(dá)Tn抗原的人類LS174T 結(jié)腸癌細(xì)胞株構(gòu)建了多肽N-乙酰半乳糖氨基轉(zhuǎn)移酶6 的缺失模型，結(jié)果顯示腫瘤細(xì)胞增殖減少且分化增強，表型也更接近正常結(jié)腸上皮細(xì)胞。另有研究發(fā)現(xiàn)MUC2 蛋白、C1GalT1 和Cosmc 在LS174T 結(jié)腸癌細(xì)胞株中表達(dá)均受損，進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞中的Cosmc 基因發(fā)生高甲基化。采用野生型Cosmc 轉(zhuǎn)染LS174T 細(xì)胞可恢復(fù)成熟的O-糖基化，從而下調(diào)CRC 細(xì)胞的增殖和抗凋亡能力。提示異常的O-糖基化可以通過直接誘導(dǎo)CRC 細(xì)胞的致癌特性，促進(jìn)CRC 的發(fā)展[9]。

3.MUC型O-糖基化與CRC的免疫逃逸：一般情況下，機體可以通過先天性和獲得性免疫識別和殺傷突變細(xì)胞，并最終在形成腫瘤之前將其清除，即機體具有免疫監(jiān)視的功能。盡管如此，仍有一定比例的腫瘤細(xì)胞可通過修飾自身表面抗原和改變腫瘤組織周圍微環(huán)境等途徑來逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)控、識別和攻擊，從而繼續(xù)分裂生長，即腫瘤的免疫逃逸。有研究結(jié)果指出，人結(jié)腸癌細(xì)胞中異常的MUC 型O-糖基化可誘導(dǎo)Tn 抗原、sTn 抗原等過度表達(dá)，參與了腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸[16]。

樹突細(xì)胞（dendritic cell,DC）在免疫反應(yīng)的啟動過程中起關(guān)鍵作用。未成熟的DC 表達(dá)各種C 型凝集素受體攝取抗原，啟動免疫抑制或免疫耐受。從人結(jié)腸癌組織中分離的MUC1-Tn 抗原可被DC 和巨噬細(xì)胞表達(dá)的半乳糖C 型凝集素識別并與其結(jié)合，使這些細(xì)胞能夠抑制T 細(xì)胞免疫并促進(jìn)血管生成，從而促進(jìn)癌癥的進(jìn)展[17]。此外，使用敲除C1GALT1 基因的小鼠MC38 結(jié)腸癌細(xì)胞株研究發(fā)現(xiàn)，Tn 抗原的過度表達(dá)會增加骨髓來源的抑制細(xì)胞并減少CD8+T 細(xì)胞浸潤，促進(jìn)免疫抑制腫瘤微環(huán)境，有助于腫瘤實現(xiàn)免疫逃逸[18]。另一項CRC 模型研究表明，CRC 細(xì)胞中Tn 抗原的表達(dá)與錯配修復(fù)缺陷狀態(tài)和免疫抑制的微環(huán)境之間存在正相關(guān)性[19]。

此外，研究發(fā)現(xiàn)sTn 抗原通過多種途徑在惡性腫瘤中發(fā)揮免疫抑制作用，包括抑制自然殺傷細(xì)胞的功能，抑制DC成熟和刺激FOXP3+T 細(xì)胞分化[16，20]。進(jìn)一步使用抗聚糖單克隆抗體阻斷sTn 抗原，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其可以逆轉(zhuǎn)癌細(xì)胞誘導(dǎo)的DC 成熟缺陷[20]。研究Tn、sTn 抗原與CRC 之間的相互作用為將來規(guī)避腫瘤誘導(dǎo)的耐受機制和藥物研發(fā)提供了新的可能，有望使腫瘤細(xì)胞對抗癌療法更敏感。

4.MUC 型O-糖基化與CRC 的耐藥：盡管目前關(guān)于腫瘤的研究已取得了重大進(jìn)展，但化療的耐藥性仍然是一個持續(xù)的挑戰(zhàn)，嚴(yán)重影響治療效果，也是化療失敗的重要原因之一。研究表明，MUC 表達(dá)模式的改變在誘導(dǎo)或減輕化療耐藥中發(fā)揮重要作用，具體機制包括調(diào)控藥物轉(zhuǎn)運與吸收、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡途徑和DNA損傷修復(fù)等。

已有研究發(fā)現(xiàn)，MUC1 基因在密碼子600 纈氨酸被谷氨酰胺取代的BRAF（V600E）突變的CRC 中表達(dá)上調(diào)，前者可以通過激活酪氨酸磷酸酶2 和誘導(dǎo)受體酪氨酸激酶-Ras 蛋白-絲裂原活化蛋白激酶通路發(fā)揮CRC 對于BRAF 抑制劑的耐藥機制[21]。高度O-糖基化的MUC1 還可以通過減少DNA 損傷來介導(dǎo)HCT116 結(jié)腸癌細(xì)胞的順鉑耐藥性[22]。然而，抑制MUC13 的表達(dá)則可以通過抑制核因子-κB 信號通路加重化療藥物誘導(dǎo)的DNA 損傷，從而提高結(jié)腸癌細(xì)胞的藥物敏感性[23]。此外，由GCNT3基因編碼的MUC型核心2 1,6-N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶作為一類催化MUC 核心2 O-聚糖、核心4 O-聚糖形成的糖基轉(zhuǎn)移酶，在早期CRC 中表達(dá)下調(diào)，并與CRC 預(yù)后呈正相關(guān)。有關(guān)作用機制的研究表明，該MUC 型核心2 酶的過表達(dá)有助于降低轉(zhuǎn)移性CRC 細(xì)胞中的5-氟尿嘧啶耐藥性[24]。因此，研發(fā)針對O-糖基化的靶向藥物有可能克服耐藥性的困擾，提高CRC化療的療效。

除了對CRC 的直接影響，MUC 型O-聚糖作為微生物群的營養(yǎng)來源和結(jié)合位點，還能與細(xì)菌同源受體黏附素相互作用決定腸道微生物群的組成，間接改變宿主對CRC 易感性和臨床預(yù)后。如CRC 中過表達(dá)的Gal-GalNAc 可以被具核梭桿菌的Fap2蛋白識別，提高癌細(xì)胞周圍特定菌群的密度，促進(jìn)腫瘤的生長和存活[25]。

二、MUC型O-糖基化在CRC中的應(yīng)用現(xiàn)況

1.MUC 型O-糖基化在CRC 臨床篩查和預(yù)后中的應(yīng)用：預(yù)計2030年全球?qū)⒂?20萬CRC新病例和110萬死亡病例，加快探索簡便高效的CRC 生物學(xué)標(biāo)志物尤為重要。一直以來，改變的糖基化譜被普遍認(rèn)為是癌癥標(biāo)志，與癌癥發(fā)展和預(yù)后不良有關(guān)。目前常用的癌胚抗原和糖類抗原19-9 等生物學(xué)標(biāo)志物都是基于這些變化，常被用于CRC 的篩查和術(shù)后復(fù)發(fā)監(jiān)測。sTn 抗原、Tn 抗原和T 抗原等截斷的O-聚糖結(jié)構(gòu)，也與惡性腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)。在多種類型的腫瘤中均可檢測到高水平sTn 抗原（>38 U/mL），其表達(dá)水平與腫瘤的大小和轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性，而患者的總體存活率則取決于癌癥類型[26-27]。Tn抗原在多種腺癌中廣泛表達(dá)，其表達(dá)水平與癌侵襲性之間存在明顯的正相關(guān)性。研究表明，當(dāng)T 抗原表達(dá)時，高微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability, MSI）的CRC 患者的生存率高于微衛(wèi)星穩(wěn)定的患者，表明T抗原可能可以作為高M(jìn)SI的CRC 患者預(yù)后更好的生物學(xué)標(biāo)志物[28]。高M(jìn)SI 是一種由于DNA 錯配修復(fù)缺陷導(dǎo)致的分子表型，該分子表型與CRC 多種臨床和組織病理學(xué)特征相關(guān)并影響預(yù)后，是治療反應(yīng)的預(yù)測因素[29]。

Ogawa 等[30]檢測了679 例CRC 患者的GalNAc-T6 表達(dá)水平，結(jié)果顯示其表達(dá)水平隨著癌癥的進(jìn)展而降低，晚期癌癥病例更有可能表現(xiàn)出陰性或更低水平的GalNAc-T6 表達(dá)。單變量和多變量分析表明GalNAc-T6 表達(dá)缺失是一個獨立的風(fēng)險變量，可提示總生存期的降低。類似的，GalNAc-T3在CRC患者中的陽性表達(dá)也提示了更高的存活率[31]。

核心2 O-聚糖合成酶也是一種良好的預(yù)后生物學(xué)標(biāo)志物，其低表達(dá)可用于識別具有高復(fù)發(fā)風(fēng)險的早期結(jié)腸癌患者。有研究[32]發(fā)現(xiàn)3 種不同作用機制的化療藥物（5-氟尿嘧啶、硼替佐米和紫杉醇）均可顯著誘導(dǎo)癌細(xì)胞中的核心2 O-聚糖合成酶表達(dá)，這提示其也可能作為檢測腫瘤對化療反應(yīng)的生物學(xué)標(biāo)志物。驗證這些發(fā)現(xiàn)還需要進(jìn)一步完善前瞻性研究，并在更大規(guī)模的隊列中與其他分子標(biāo)志物（如Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物、癌胚抗原和糖類抗原19-9 等）進(jìn)行比較。

2.MUC 型O-糖基化在CRC 治療中的應(yīng)用：異常糖基化是癌癥的標(biāo)志，可能影響腫瘤行為的變化，其不同機制形成選擇性癌癥靶向治療的腫瘤相關(guān)糖類抗原（tumor-associated carbohydrate antigens,TACA）。截短的O-聚糖（Tn、TF 和sTn抗原）即屬于MUC 型O-糖基化TACA，除作為新型臨床生物學(xué)標(biāo)志物開發(fā)的來源，也為腫瘤免疫治療提供了一組特定目標(biāo)。起初研究人員在原發(fā)型乳腺癌患者體內(nèi)檢測到了抗sTn 抗體，之后在多種動物模型中也發(fā)現(xiàn)了sTn 疫苗和Tn 疫苗誘導(dǎo)抗體介導(dǎo)的抗腫瘤作用[33]。目前針對TACA 的腫瘤免疫治療策略包括不同的抗體開發(fā)、疫苗的生產(chǎn)，如sTn、Tn相關(guān)的乳腺癌疫苗和針對乳腺癌的T 抗原特異性抗體的臨床試驗[34-35]。有關(guān)CRC的研究包括抗sTn抗體相關(guān)藥物抗腫瘤相關(guān)糖蛋白-72 免疫脂質(zhì)體，結(jié)果表明其可以顯著抑制LS174T 人結(jié)腸癌細(xì)胞的體內(nèi)生長和腫瘤組織的血管生成。伽妥珠單抗（gatipotuzumab）作為一種人源抗Tn單克隆抗體，在對晚期結(jié)腸癌患者進(jìn)行的Ⅰ期臨床試驗中也顯示出良好的安全性和耐受性[35]。

為了提高腫瘤的藥物治療有效率，除應(yīng)加快抗腫瘤藥物的研發(fā)外，還應(yīng)增強藥物敏感性和降低腫瘤藥物的耐藥率。Semba 等[36]的研究篩選了數(shù)千種化合物，在對TRAIL 敏感和耐藥的結(jié)腸癌細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)強心苷海蔥次甙A 可以顯著增強TRAIL 誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。從機制上，其可特異性上調(diào)O-糖基化死亡受體DR4和DR5的表達(dá)并下調(diào)抗凋亡蛋白Mcl1的表達(dá)，同時顯著增強了參與O-聚糖生成的多肽N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶14、C1GalT1 及其分子伴侶Cosmc 的表達(dá)。這些酶對于O-聚糖的合成至關(guān)重要，可以使HT29 結(jié)腸癌細(xì)胞株對TRAIL 誘導(dǎo)的caspase-8 活化和細(xì)胞凋亡更敏感[13,37]。這些結(jié)果表明O-糖基化可以介導(dǎo)藥物對凋亡途徑的致敏作用。同時，海蔥次甙A 作為一種有潛力的協(xié)調(diào)抗癌藥物，將來或許可以用于CRC的免疫治療。

三、總結(jié)

總之，基礎(chǔ)和臨床研究的證據(jù)表明，MUC 是參與結(jié)腸良性和惡性疾病發(fā)病機制的重要分子。O-糖基化作為MUC 常見的翻譯后修飾之一，普遍存在于正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中。異常的MUC 型O-糖基化不僅可參與CRC 的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和浸潤，還與CRC 的免疫逃逸和耐藥密切相關(guān)。對MUC型O-糖基化的進(jìn)一步深入了解也將有助于剖析其在CRC 中的作用，為克服腫瘤耐藥，探索新型治療手段，以及尋找簡便高效的診斷篩查標(biāo)志物提供新的思路。