液體活檢技術(shù)在胰腺癌早期篩查和診斷中的應(yīng)用*

趙宇婷,楊宇晨 綜述,蔡智慧 審校

1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)內(nèi)蒙古臨床醫(yī)學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010110;2.內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科,內(nèi)蒙古呼和浩特 010017

近年來,胰腺癌發(fā)病率在國(guó)內(nèi)外都呈現(xiàn)上升趨勢(shì),胰腺癌雖然不是高發(fā)癌種,但卻是導(dǎo)致死亡的第7大癌種。胰腺癌的5年生存率約為10%,據(jù)有關(guān)數(shù)據(jù)顯示,胰腺癌占我國(guó)腫瘤發(fā)病率的第9位,死亡率占第6位[1],其中,約90%為起源于腺管上皮的導(dǎo)管腺癌(PDAC),PDAC的5年生存率不足1%。有研究表明,胰腺癌存在早期診斷率、手術(shù)切除率和藥物有效率低的“三低”特征,胰腺癌起病隱匿,早期癥狀不典型,常表現(xiàn)為消化不良、腹瀉、上腹部不適或腰背部疼痛等癥狀,易與其他消化系統(tǒng)疾病混淆而不能及時(shí)診治[2]。不過有研究表明,從胰腺癌發(fā)生病變到進(jìn)展為轉(zhuǎn)移性胰腺癌要近21年的時(shí)間[3],這為胰腺癌早期篩查提供了較長(zhǎng)的時(shí)間窗。

胰腺癌早期診斷的關(guān)鍵在于盡早確診小胰腺癌,但迄今尚無統(tǒng)一的診斷標(biāo)準(zhǔn),美國(guó)癌癥分期委員會(huì)將腫瘤最大徑≤2 cm且無區(qū)域淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的早期腫瘤稱為小胰腺癌,TNM分期為ⅠA期[4]。另外,還有學(xué)者將最大徑≤1 cm的胰腺癌定義為微小胰腺癌,術(shù)后5年生存率可達(dá)到67%[5]。臨床上胰腺癌早期診斷的目的就是發(fā)現(xiàn)早期胰腺癌或小胰腺癌,以便早期手術(shù)治療改善預(yù)后。若胰腺癌已非早期或最大徑>2 cm,則其生存率明顯降低[6]。有數(shù)據(jù)顯示,0期(原位)患者的5年生存率為85.8%,ⅠA期患者的5年生存率為68.7%[7],而發(fā)展到中、晚期,失去了最佳治療時(shí)機(jī),5年生存率僅為10%[8],生存時(shí)間差異明顯。因此及早篩查并診治胰腺癌至關(guān)重要。

1 常規(guī)胰腺癌篩查手段

在胰腺癌傳統(tǒng)檢測(cè)方法中,計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT)、血管造影聯(lián)合胸部和盆腔CT可用于評(píng)估血管解剖結(jié)構(gòu)和疾病分期,是診斷時(shí)的常規(guī)治療方法;磁共振成像和胰膽管造影可以用于判斷胰腺病變是否有轉(zhuǎn)移,并識(shí)別CT成像中可能表現(xiàn)不良的癌癥;內(nèi)鏡超聲檢查可以更直接地顯示胰腺腫塊,明確細(xì)胞學(xué)或組織學(xué)診斷,確定腫瘤血管受累程度,評(píng)估區(qū)域淋巴結(jié),并評(píng)估腫塊完全切除的可能性,在內(nèi)鏡超聲引導(dǎo)下對(duì)腫瘤進(jìn)行細(xì)針穿刺活檢,可以獲得組織學(xué)診斷并為分子檢測(cè)提供材料;糖類抗原(CA)199是胰腺癌公認(rèn)的生物標(biāo)志物,可用于監(jiān)測(cè)治療反應(yīng)[9]。

然而,傳統(tǒng)檢測(cè)方法都存在一定缺陷,而無法作為可靠的早期篩查方法。如CT伴隨著碘造影劑的腎毒性風(fēng)險(xiǎn)、輻射暴露風(fēng)險(xiǎn),且在獲得實(shí)質(zhì)增強(qiáng)方面也存在個(gè)體差異而無法保證可靠性;內(nèi)鏡超聲在某些國(guó)家或地區(qū)可用性較低,操作員技術(shù)差異較大,且無法檢測(cè)到遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移;磁共振成像因昂貴且禁忌使用某些金屬植入物[10],且磁共振由于靈敏度(80%)和特異度低(75%)[11],可與其他疾病包括梗阻性黃疸、急性膽管炎和慢性胰腺炎混淆,易出現(xiàn)假陰性結(jié)果[12],所以目前磁共振可能并不能作為早期胰腺癌常規(guī)篩查的手段。總之,胰腺癌總體發(fā)病率較低,篩查成本高,在無癥狀人群中用上述方法進(jìn)行篩查可能會(huì)帶來過度診斷和假陽性的風(fēng)險(xiǎn),因此需要更有效地富集高危人群使其在后續(xù)的監(jiān)測(cè)中獲益是胰腺癌篩查的關(guān)鍵,所以將液體活檢作為早期篩查胰腺癌的方法引起了廣泛討論。

2 液體活檢的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)

液體活檢是一種基于血液、腦脊液、尿液、痰液、腹水和理論上任何其他體液采樣的微創(chuàng)手術(shù),正在成為用于早期癌癥診斷、治療、預(yù)后預(yù)測(cè)和隨訪的生物標(biāo)志物[13]。作為非侵入性工具,液體活檢可以從體液中獲取腫瘤相關(guān)的重要信息,大多數(shù)重要信息都是從循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)、循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)及細(xì)胞外囊泡的分析中收集的[14]。1994年首次報(bào)道了用等位基因特異性引物的PCR在胰腺癌患者的循環(huán)游離DNA(cfDNA)中檢測(cè)到突變序列[15],由此提出,液體活檢可應(yīng)用于胰腺癌的臨床應(yīng)用中。在癌癥早期篩查領(lǐng)域,液體活檢相較傳統(tǒng)檢測(cè)方法有諸多優(yōu)點(diǎn)。與傳統(tǒng)的組織活檢不同,液體活檢是非侵入性操作,易于重復(fù),并且可以方便地了解腫瘤負(fù)荷和治療反應(yīng)。此外,液體活檢可以給出原發(fā)腫瘤的分子快照,從而最大限度地減少由采樣偏重和腫瘤內(nèi)異質(zhì)性引起的活檢結(jié)果偏倚[16]。因此在實(shí)體腫瘤早期篩查、監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展等方面均有巨大前景。

2.1CTC的特性及相關(guān)應(yīng)用 CTC是血液中存在的惡性細(xì)胞,被認(rèn)為是轉(zhuǎn)移的“種子”。CTC從原發(fā)腫瘤脫落,通過血管系統(tǒng)到達(dá)第二個(gè)部位,若環(huán)境適宜,這些細(xì)胞便定居并增殖,從而形成轉(zhuǎn)移性腫瘤[17]。因此推測(cè)CTC可能成為癌癥轉(zhuǎn)移的可靠生物標(biāo)志物。目前CTC已被研究證實(shí)其可作為乳腺癌、前列腺癌和結(jié)直腸癌的預(yù)后生物標(biāo)志物[17]。但其在胰腺癌中的作用尚未得到廣泛探討。2004年CellSearch系統(tǒng)計(jì)數(shù)首次檢測(cè)到CTC的存在,美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局評(píng)估了此系統(tǒng)對(duì)胰腺癌的診斷,結(jié)果準(zhǔn)確度在11%～78.5%,檢出率差異很大[18];隨著新的功能測(cè)試模型的開發(fā),更多用于體內(nèi)檢測(cè)和捕獲CTC的設(shè)備為CTC研究開辟了新的途徑,這可能會(huì)克服傳統(tǒng)7.5 mL血液管(CellSearch系統(tǒng))中CTC計(jì)數(shù)低的限制,從而提高檢出率[19]。

早期CTC檢測(cè)可識(shí)別胰腺癌轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)增加的患者,可為手術(shù)或局部進(jìn)展PDAC患者提供定制輔助治療的機(jī)會(huì)。考慮到轉(zhuǎn)移階段通常發(fā)生在癌癥進(jìn)展的晚期,所以普遍認(rèn)為在PDAC的癌前和早期階段不會(huì)檢測(cè)到CTC。但有研究發(fā)現(xiàn),循環(huán)胰腺上皮細(xì)胞(CEC)僅在胰腺囊性病變和胰腺導(dǎo)管腺癌患者中發(fā)現(xiàn),在體檢健康者、PDAC患者和囊性病變患者中的CEC計(jì)數(shù)存在明顯差異[20]。另一項(xiàng)研究也表明,CEC有可能對(duì)不同級(jí)別的導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀黏液性腫瘤(IPMN)和其他良性囊腫進(jìn)行區(qū)別[17]。在PDAC的癌前階段可以檢測(cè)到CEC,因此提高了CTC作為早期診斷標(biāo)志物的可能性。LEE等[12]使用GEDI芯片,分別在3個(gè)不同的受試組:PDAC組、胰腺癌癌前囊性病變(IPMN或黏液性囊性腫瘤)組及無癌組,分別檢測(cè)CTC,結(jié)果顯示,胰腺癌癌前囊性病變組、PDAC組和無癌組的CTC檢出率分別為40%、73%和0%。但由于PDAC早期循環(huán)細(xì)胞數(shù)量較少且提取技術(shù)尚未完全成熟,CTC用于胰腺癌早期篩查仍需要更多的驗(yàn)證性研究。

除了早期篩查,近年來發(fā)現(xiàn)了CTC與胰腺癌在其他方面的相關(guān)性:(1)與預(yù)后相關(guān),相對(duì)未檢測(cè)到CTC的患者,檢測(cè)到至少一種CTC的患者無進(jìn)展生存時(shí)間更短;(2)CTC可能在評(píng)估晚期PDAC患者的治療反應(yīng)方面具有積極作用,經(jīng)檢測(cè)PDAC患者化療后的CTC計(jì)數(shù)大幅減少[21];(3)判斷腫瘤復(fù)發(fā),CTC有上皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞兩種表型,且可表達(dá)波形蛋白,而波形蛋白是間充質(zhì)細(xì)胞的一種標(biāo)志物,與胰腺導(dǎo)管腺癌外科治療后的高復(fù)發(fā)率有關(guān)[22];(4)監(jiān)測(cè)化療效果進(jìn)而指導(dǎo)臨床治療,CTC計(jì)數(shù)在疾病晚期增加,所以如果檢測(cè)到PDAC患者血液中CTC計(jì)數(shù)增加,即使影像學(xué)檢查未檢測(cè)到轉(zhuǎn)移,也應(yīng)考慮全身化療而不是前期手術(shù)[23]。例如目前已有學(xué)者考慮采用分子生物標(biāo)志物來預(yù)測(cè)呋喹替尼針對(duì)結(jié)直腸癌的療效,未來應(yīng)該設(shè)計(jì)并實(shí)施利用分子生物標(biāo)志物預(yù)測(cè)免疫靶向治療在胰腺癌療效中的試驗(yàn)[24],并以此來指導(dǎo)、調(diào)整臨床用藥。

2.2ctDNA在胰腺癌中的應(yīng)用 在體液環(huán)境中,可檢測(cè)到一類游離的DNA片段,被稱為cfDNA,cfDNA起源于腫瘤微環(huán)境的腫瘤和非腫瘤細(xì)胞[25],ctDNA是特異性來源于原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性腫瘤cfDNA的一部分,雖然ctDNA在cfDNA中具有較大的波動(dòng)比例[26],但由于健康人群中大部分cfDNA的長(zhǎng)度在70～200 bp,而腫瘤患者的ctDNA長(zhǎng)度可能為200 bp甚至超過1 000 bp[27],這就可以對(duì)其進(jìn)行定量定性分析,從而用于腫瘤監(jiān)測(cè)。腫瘤DNA從原發(fā)腫瘤、CTC、微轉(zhuǎn)移或明顯轉(zhuǎn)移到癌癥患者的血液中釋放,與腫瘤相關(guān)的基因缺陷模式(如點(diǎn)突變、重排、擴(kuò)增、微衛(wèi)星改變、表觀遺傳修飾等)就可以在血清和血漿中檢測(cè)到,從而應(yīng)用于臨床腫瘤診治過程。

相較CTC而言,ctDNA具有較高的特異性,ctDNA的特異性遠(yuǎn)高于CTC。原因可能是:(1)ctDNA通常在大量腫瘤細(xì)胞壞死后檢測(cè),此時(shí)腫瘤負(fù)荷已經(jīng)很高;(2)PADC中的基因突變通常是特異性的[28]。

2.2.1ctDNA在胰腺癌早期篩查中的應(yīng)用 作為液體活檢的一種手段,ctDNA技術(shù)一般分為兩種:基因突變檢測(cè)和甲基化檢測(cè)。

有研究記錄了已知胰腺癌驅(qū)動(dòng)基因的高突變頻率,如鼠類肉瘤病毒癌基因(KRAS)、腫瘤抑制蛋白基因(TP53)、信號(hào)通路通用調(diào)節(jié)因子4 (SMAD4)和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制基因(CDKN2A),其中KRAS突變被用于診斷監(jiān)測(cè)中[29]。在一項(xiàng)研究中,與腫瘤組織序列相比,在26例胰腺癌癥患者的ctDNA標(biāo)本中評(píng)估了54個(gè)基因的突變,此項(xiàng)研究結(jié)果是KRAS、TP53、腺瘤性息肉病基因(APC)、F框/WD-40域蛋白7(FBXW7)和SMAD4這5個(gè)基因的ctDNA突變應(yīng)該能夠準(zhǔn)確診斷PDAC[30]。KRAS是一種相對(duì)分子質(zhì)量為21×103的小GTP酶,可激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)信號(hào)傳導(dǎo)通路,從而控制與增殖、分化、遷移和存活相關(guān)的細(xì)胞過程[31]。1994年首次報(bào)道了用等位基因特異性引物的PCR在胰腺癌患者的血漿cfDNA中檢測(cè)到突變的KRAS序列,對(duì)于每個(gè)胰腺癌患者,在血漿中發(fā)現(xiàn)的KRAS突變與在患者腫瘤中發(fā)現(xiàn)的一致,從而可以確認(rèn)血漿中的突變DNA片段來自腫瘤,研究表明,cfDNA的突變是癌癥的高度特異性標(biāo)志物[15]。有數(shù)據(jù)顯示在14.8%的體檢健康者中也檢測(cè)到了突變KRAS[32],該結(jié)果表明單獨(dú)檢測(cè)血漿KRAS突變并不能作為診斷胰腺癌的可靠標(biāo)志物。有研究報(bào)道聯(lián)合檢測(cè)KRAS突變和CA199對(duì)胰腺癌的診斷靈敏度達(dá)91%,故與其他血清標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè),診斷靈敏度可明顯提高[33]。

腫瘤在早期階段其壞死和凋亡率較低,并且沒有足夠的ctDNA釋放到循環(huán)中,所以靈敏度比較低[28]。近年來研究顯示,cfDNA在癌變?cè)缙跈z測(cè)甲基化等表觀遺傳學(xué)改變方面具有很大的潛能。腫瘤發(fā)生早期DNA已經(jīng)出現(xiàn)了甲基化的趨勢(shì)或局部甲基化的改變,因此可以通過液體活檢檢測(cè)ctDNA的水平和甲基化特征來實(shí)現(xiàn)腫瘤的早期診斷及分期[34]。有研究通過評(píng)估cfDNA中兩個(gè)基因[血小板反應(yīng)蛋白基序1(ADAMTS1)、鋅指蛋白basonuclin-1(BNC1)]的甲基化狀態(tài),結(jié)果發(fā)現(xiàn)其靈敏度為0.95,特異度為0.92,這種基于血液的微創(chuàng)生物標(biāo)志物組合可以用作在選定的高危人群中進(jìn)行診斷和篩查的有前途的工具[35]。除此之外,在另外一項(xiàng)初步研究中,結(jié)合cfDNA中5-甲基胞嘧啶(5mC)和5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)變化的模型實(shí)現(xiàn)了0.94的靈敏度和0.95的特異度,診斷PDAC的曲線下面積(AUC)為0.99,結(jié)果顯示結(jié)合5mC和5hmC標(biāo)記的特征模型優(yōu)于兩個(gè)單獨(dú)的模型,特別是對(duì)PDAC的預(yù)測(cè)靈敏度有所提高,并且利用5hmC模型計(jì)算的加權(quán)診斷評(píng)分還可以區(qū)分Ⅰ期患者和Ⅱ～Ⅳ期患者[36]。一項(xiàng)針對(duì)靶向cfDNA甲基化的分析中,納入了不同階段的PDAC患者,發(fā)現(xiàn)Ⅰ期的靈敏度為0.63,Ⅱ期為0.83,Ⅲ期為0.75,Ⅳ期為1.00,cfDNA甲基化可能對(duì)監(jiān)測(cè)風(fēng)險(xiǎn)群體非常有用[7]。使用新開發(fā)的稱為珠子甲基化(MOB)的高度可靠的技術(shù),EISSA等[35]發(fā)現(xiàn)A崩解素和金屬蛋白酶與ADAMTS1、BNC1的甲基化及二者聯(lián)合對(duì)胰腺癌診斷的靈敏度分別為87.2%、64.1%和97.4%。對(duì)于Ⅰ/Ⅱ期胰腺癌,二者聯(lián)合檢測(cè)表現(xiàn)出94.8%的靈敏度和91.6%的特異度。

2019年美國(guó)翰斯`·霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院開發(fā)了一種稱為DELFI(早期攔截片段DNA)的方法,通過片段模式的全基因組分析來檢測(cè)cfDNA中的異常[37]。該研究專注于cfDNA的片段大小,發(fā)現(xiàn)與非癌癥cfDNA相比,癌癥衍生的cfDNA片段長(zhǎng)度的變化更大。利用機(jī)器學(xué)習(xí)模型,結(jié)合全基因組片段特征,可以將早期癌癥檢測(cè)靈敏度提高到99%,特異度達(dá)到98%。DELFI方法與基于突變的cfDNA分析結(jié)合使用時(shí),其靈敏度可以達(dá)到91%,特異度為98%。這為利用cfDNA分析人類早期癌癥篩查和監(jiān)測(cè)提供了新的策略。液體活檢ctDNA主要代表死亡腫瘤細(xì)胞的基因組,但癌癥的進(jìn)展和治療過程中的耐藥性卻是由活的腫瘤細(xì)胞驅(qū)動(dòng),因此,選擇合適的ctDNA篩選時(shí)間點(diǎn)至關(guān)重要。目前的研究指出,如果在腫瘤活檢之前進(jìn)行液體活檢,ctDNA檢測(cè)可能會(huì)消除組織活檢的需要,但如果ctDNA分析為陰性,組織活檢仍可能提供有價(jià)值的基因組信息[27]。

2.2.2ctDNA在胰腺癌其他方面的應(yīng)用 (1)ctDNA與腫瘤預(yù)后。有研究表明,血漿中ctDNA水平與腫瘤大小和分期相關(guān),較高水平的ctDNA可能是胰腺癌患者生存率較差的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[15]。ctDNA可監(jiān)測(cè)腫瘤復(fù)發(fā),在進(jìn)行手術(shù)或治療后,即使在沒有任何其他臨床疾病證據(jù)的情況下,檢測(cè)到ctDNA也可能表明存在最小殘留病灶,故ctDNA的存在還可以識(shí)別可能具有較高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的患者[27]。(2)ctDNA用于療效評(píng)估。ctDNA可監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)移性胰腺癌的化療應(yīng)答,當(dāng)治療失敗時(shí),血漿中可檢測(cè)到耐藥胰腺癌細(xì)胞的DNA片段[38],且在一項(xiàng)關(guān)于總cfDNA水平的動(dòng)態(tài)變化與化療后的腫瘤負(fù)荷關(guān)系的研究中,提供了治療前ctDNA水平與PDAC腫瘤負(fù)荷相關(guān)的證據(jù),并且顯示連續(xù)cfDNA分析是監(jiān)測(cè)癌癥對(duì)化療反應(yīng)的可靠工具[39]。

2.3細(xì)胞外囊泡 PDAC中細(xì)胞外囊泡水平的診斷和預(yù)后評(píng)估價(jià)值已在研究中得到證實(shí)。即使在早期PDAC患者血清中,PDAC衍生細(xì)胞外囊泡中富集的磷脂肌醇蛋白聚糖-1也有較高的靈敏度和特異度[18]。同樣,細(xì)胞外囊泡中特征微小RNA的表達(dá)水平可用于PDAC的早期診斷[40]。

3 展 望

多維度評(píng)估基因組狀態(tài)或?qū)⒊蔀槟[瘤早篩技術(shù)趨勢(shì)。從上述研究不難看出,基于液體活檢技術(shù)所衍生出來的早篩對(duì)象不只局限于循環(huán)DNA層面甲基化標(biāo)志物,已有發(fā)展為多維度指標(biāo)聯(lián)合評(píng)估的趨勢(shì)。雖然國(guó)內(nèi)外已有部分研究腫瘤早篩的數(shù)據(jù),但多為處于單一檢測(cè)維度或體細(xì)胞突變聯(lián)合甲基化分析的方法,且大多處于起步階段,正在進(jìn)行檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)化、標(biāo)本的累積或前瞻性臨床試驗(yàn)的驗(yàn)證。胰腺癌早篩空間廣闊,對(duì)于液體活檢技術(shù)而言,其樣本前處理、提取方法和檢測(cè)靈敏度上還存在一些問題,當(dāng)前最重要的是找到合適的目標(biāo)分析物,提高早篩的靈敏度和特異度。為了進(jìn)一步提升早期胰腺癌的檢測(cè)能力,更好地篩選中國(guó)胰腺癌高危人群,目前部分研究正在納入基因組拷貝數(shù)變異、cfDNA片段組學(xué)等分析,并且基于多維度生物標(biāo)志物的大型胰腺癌早篩研究也陸續(xù)在開展中。隨著眾多學(xué)者對(duì)胰腺癌液體活檢更深入的研究,液體活檢正在得到越來越多的認(rèn)可。此外,隨著創(chuàng)新性檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展和檢測(cè)成本的降低,今后液體活檢有望普及,為胰腺癌的篩查和早期診斷提供更多的臨床幫助。