液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法和電化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測(cè)25-羥維生素D的一致性評(píng)價(jià)

趙 柯,任偉丹,劉玉霞,岳文兵,韓雪瑩,丁利霞

鄭州金域臨床檢驗(yàn)中心有限公司,河南鄭州 450000

維生素D是一種脂溶性甾體激素前體,主要包括維生素D2(麥角鈣化醇)、維生素D3(膽鈣化醇),其主要功能為促進(jìn)小腸黏膜細(xì)胞吸收磷及鈣離子,還可減輕炎癥反應(yīng),調(diào)控免疫系統(tǒng)功能及幫助控制血糖水平[1]。25-羥維生素D[25(OH)D]是維生素D在人體內(nèi)的主要作用形式,其在血液中的濃度較高且半衰期較長(zhǎng),是監(jiān)測(cè)體內(nèi)維生素D水平及營(yíng)養(yǎng)狀況的可靠指標(biāo)[2]。

隨著臨床實(shí)驗(yàn)室維生素D檢測(cè)的大范圍開(kāi)展,不同檢測(cè)方法間結(jié)果不一致的情況愈來(lái)愈多,甚至部分結(jié)果差異會(huì)影響臨床對(duì)維生素D缺乏的診斷。故本研究使用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)和電化學(xué)發(fā)光免疫分析法(ECLIA)這兩種方法檢測(cè)臨床血清標(biāo)本中的25(OH)D,并對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行分析和比較,評(píng)價(jià)這兩種方法檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性和差異性,以期指導(dǎo)臨床選擇合適的項(xiàng)目,合理解讀這兩種方法結(jié)果差異的原因。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源 收集本實(shí)驗(yàn)室臨床血清標(biāo)本94例,分別用ECLIA與LC-MS/MS兩個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)25(OH)D濃度,并對(duì)結(jié)果相關(guān)性進(jìn)行分析,入組的所有標(biāo)本均為單純隨機(jī)抽樣的方法挑選。

1.2儀器與試劑 LC-20ADXR 液相色譜儀(日本島津公司)、API3200質(zhì)譜儀(美國(guó)AB公司)、Milli-Q Gradient超純水機(jī)、默克Ascentis Express C18(5.0 cm×2.1 mm×2.7 μm)色譜柱、電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(羅氏E602)。甲醇、乙腈、正己烷均為色譜純,購(gòu)自德國(guó)默克公司;甲酸(分析純)購(gòu)自廣東光華化學(xué)廠有限公司;25(OH)D2和25(OH)D3標(biāo)準(zhǔn)品、色譜純購(gòu)自西格瑪中國(guó)有限公司;d6-25(OH)D2和d6-25(OH)D3內(nèi)標(biāo)品購(gòu)自美國(guó)Medical Isotopes公司;25(OH)D檢測(cè)試劑盒購(gòu)自羅氏診斷產(chǎn)品有限公司。

1.3方法 (1)25(OH)D檢測(cè)采用ECLIA:使用電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀和配套試劑盒,依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)的標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行標(biāo)本的處理和檢測(cè)。檢查儀器清洗液、反應(yīng)杯、緩沖液等是否足夠使用,開(kāi)機(jī)后在儀器試劑盤(pán)中加入平衡至室溫的相應(yīng)試劑(避免產(chǎn)生氣泡),儀器將自動(dòng)按照設(shè)定程序進(jìn)行檢測(cè)。LC-MS/MS,色譜條件:色譜柱柱溫50 ℃;流速:0.55 mL/min;進(jìn)樣量為40 μL;流動(dòng)相A相為含0.1%甲酸的去離子水,B相為含0.1%甲酸的甲醇,采用梯度洗脫模式。質(zhì)譜參數(shù):采用正離子電噴霧電離離子化的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式,25(OH)D2和25(OH)D3定量離子通道質(zhì)荷比分別為413.3∶395.4和401.3∶383.4;定性離子通道質(zhì)荷比分別為413.3∶355.4和401.3∶365.4;內(nèi)標(biāo)離子通道質(zhì)荷比分別為416.3∶398.4和407.3∶389.4。離子源溫度:550 ℃,離子源電壓5 500 V,氣簾氣20,霧化器55,輔助氣55。實(shí)驗(yàn)步驟:吸取200 μL血清標(biāo)本至2 mL離心管中,加入400 μL的內(nèi)標(biāo)工作液[含50.0 ng/mL的d6-25(OH)D2、50.0 ng/mL的d6-25(OH)D3及1.00 μg/mL雌三醇的乙腈溶液],充分震蕩5 min,加入800 μL正己烷震蕩10 min后,室溫10 000 r/min離心10 min;吸取700 μL上清液60 ℃加熱氮?dú)獯蹈?加入100 μL復(fù)溶液,可得待測(cè)標(biāo)本,轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶后上機(jī)檢測(cè)。進(jìn)樣順序?yàn)榭瞻讟悠?標(biāo)準(zhǔn)工作曲線-空白樣品-質(zhì)控-空白樣品-待測(cè)血清標(biāo)本-空白樣品-質(zhì)控-空白樣品,查看標(biāo)準(zhǔn)曲線及質(zhì)控是否在控,查看質(zhì)譜圖峰形、出峰時(shí)間及分離度是否正常,確認(rèn)后導(dǎo)出數(shù)據(jù)。(2)維生素D營(yíng)養(yǎng)狀況判定:根據(jù)血清25(OH)D濃度,將血清25(OH)D<20.0 ng/mL判定為維生素D缺乏,20～<30.0 ng/mL判定為維生素D不足。

1.4質(zhì)量控制

1.4.1LC-MS/MS 25(OH)D2和25(OH)D3檢出限分別為0.31 ng/mL、0.46 ng/mL,定量限分別為1.56 ng/mL、1.66 ng/mL。25(OH)D2重復(fù)性精密度為12.03%(低濃度)、9.57%(高濃度),25(OH)D2中間精密度為8.90%(低濃度)、8.78%(高濃度);25(OH)D3重復(fù)性精密度為4.64%(低濃度)、2.26%(高濃度),25(OH)D3中間精密度為4.76%(低濃度)、2.47%(高濃度)。該檢測(cè)通過(guò)國(guó)家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心(NCCL)組織的室間質(zhì)評(píng)及正確度驗(yàn)證。

1.4.2ECLIA 25(OH)D檢出限為3.00 ng/mL,定量限為4.39 ng/mL,重復(fù)性精密度為5.99%(低濃度)、4.58%(高濃度),中間精密度為7.98%(低濃度)、5.92%(高濃度),該檢測(cè)通過(guò)NCCL組織的室間質(zhì)評(píng)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Medcala11.0及SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。使用配對(duì)t檢驗(yàn)分析兩種方法檢測(cè)結(jié)果差異是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;使用Passing-Boblok回歸分析兩種檢測(cè)方法之間的相關(guān)性;Bland-Altman及Mountain plot進(jìn)行兩種方法的一致性檢驗(yàn);使用Kappa分析判斷兩種方法評(píng)估維生素D營(yíng)養(yǎng)狀況的診斷符合率。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1兩種方法的檢測(cè)結(jié)果 本實(shí)驗(yàn)室LC-MS/MS與ECLIA法均經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的方法學(xué)驗(yàn)證,并參與了NCCL的室間質(zhì)評(píng),使用LC-MS/MS與ECLIA檢測(cè)25(OH)D,當(dāng)日質(zhì)控結(jié)果均在控。使用LC-MS/MS與ECLIA檢測(cè)94例血清標(biāo)本25(OH)D濃度,兩種方法測(cè)定的25(OH)D濃度結(jié)果比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。LC-MS/MS系統(tǒng)檢測(cè)25(OH)D最低值為4.82 ng/mL,最高值為76.23 ng/mL。ECLIA系統(tǒng)檢測(cè)最低值為6.41 ng/mL,最高值為127.78 ng/mL。見(jiàn)表1。

表1 LC-MS/MS與ECLIA對(duì)94例血清標(biāo)本25(OH)D濃度的檢測(cè)結(jié)果比較(ng/mL)

2.2兩種方法的相關(guān)性和一致性 Passing-Bablok 回歸分析顯示兩種方法檢測(cè)25(OH)D濃度的回歸方程為YECLIA=-4.558 1+1.719 8XLC-MS/MS,斜率為1.719 8(95%CI1.586 3～1.828 4),不包含1,截距為-4.558 1(95%CI-7.692 2 ～ -2.122 1),不包含0,提示兩種方法存在系統(tǒng)差異或比例差異,見(jiàn)圖1。Bland-Altman圖顯示兩種方法差值的均值為-12.7,差值的95%CI為-35.7～10.4,有3個(gè)點(diǎn)[界外點(diǎn)數(shù)(比率)為3.19%]落在95%一致性界限以外,見(jiàn)圖2。山形圖的山頂值為-9.17 ng/mL,偏離0較多,見(jiàn)圖3。以上結(jié)果顯示兩種方法檢測(cè)的結(jié)果一致性較差。

圖1 ECLIA與LC-MS/MS檢測(cè)25(OH)D濃度的Passing-Bablok回歸圖

圖2 ECLIA與LC-MS/MS法檢測(cè)25(OH)D濃度的Bland-Altman 圖

圖3 ECLIA與LC-MS/MS法檢測(cè)25(OH)D濃度的山形圖

2.3兩種方法診斷維生素D缺乏的一致性評(píng)價(jià) 將94例血清標(biāo)本LC-MS/MS與ECLIA檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較,判斷受檢者維生素D營(yíng)養(yǎng)狀況。使用Kappa分析判斷兩種方法診斷維生素D營(yíng)養(yǎng)狀況的符合率。兩種方法判斷維生素D缺乏的符合率為94.68%,Kappa=0.875≥0.750,P<0.001,表明兩種方法診斷結(jié)果具有一致性,一致性較好[3]。兩種方法判斷維生素D不足的符合率為75.53%,Kappa=0.538,0.400

3 討 論

研究表明,維生素D不僅可以維持體內(nèi)鈣磷平衡及骨骼代謝,其在免疫調(diào)節(jié)、癌癥、抗炎及心血管健康等方面也起著至關(guān)重要的作用[5]。維生素D缺乏或不足易導(dǎo)致佝僂病及骨質(zhì)疏松癥等常見(jiàn)病的發(fā)生,過(guò)量也會(huì)導(dǎo)致高鈣血癥等相關(guān)疾病[6]。相關(guān)研究指出,血清25(OH)D濃度檢測(cè)已被公認(rèn)為反映維生素D狀態(tài)的最合理指標(biāo)[7]。因此,需要選擇合適的25(OH)D檢測(cè)方法以輔助臨床進(jìn)行疾病診斷及預(yù)防。

目前臨床實(shí)驗(yàn)室25(OH)D檢測(cè)方法主要有放射免疫法(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、ECLIA、高效液相色譜法(HPLC)及LC-MS/MS等[8]。不同檢測(cè)系統(tǒng)由于采用的方法學(xué)不同,抗干擾能力也不同,會(huì)出現(xiàn)同一標(biāo)本在不同檢測(cè)系統(tǒng)上得到不同的檢測(cè)結(jié)果,這種結(jié)果差異的出現(xiàn)可能會(huì)影響臨床對(duì)疾病的判讀。為了改變不同檢測(cè)系統(tǒng)結(jié)果差異的這種情況,有機(jī)構(gòu)成立了維生素D標(biāo)準(zhǔn)化項(xiàng)目,其宗旨是促進(jìn)全球所有實(shí)驗(yàn)室25(OH)D檢測(cè)方法(包括商業(yè)化和自建方法)的標(biāo)準(zhǔn)化,從而提高醫(yī)療安全,保障全民健康[9-10]。目前越來(lái)越多廠商及大型臨床實(shí)驗(yàn)室加入美國(guó)疾病控制和預(yù)防中心標(biāo)準(zhǔn)化認(rèn)證程序的行列中,參加實(shí)驗(yàn)室數(shù)與日俱增,但距離25(OH)D檢測(cè)結(jié)果一致的目的仍任重而道遠(yuǎn)[11]。因此,對(duì)不同檢測(cè)系統(tǒng)所得到的結(jié)果之間的相關(guān)性及一致性進(jìn)行評(píng)估是非常有意義的工作。

本研究采用LC-MS/MS與ECLIA這兩種方法檢測(cè)血清中25(OH)D濃度,LC-MS/MS測(cè)定25(OH)D濃度明顯低于ECLIA,統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示兩種方法一致性較差。引起這種結(jié)果差異的原因可能有以下幾點(diǎn):ECLIA原理為利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行有效結(jié)合,易受基質(zhì)及抗體狀態(tài)影響,特異性較差,而LC-MS/MS經(jīng)過(guò)對(duì)血清標(biāo)本前處理、色譜分離、串聯(lián)質(zhì)譜根據(jù)分子量進(jìn)行區(qū)分檢測(cè),可實(shí)現(xiàn)25(OH)D2、25(OH)D3的精準(zhǔn)檢測(cè),從方法學(xué)角度來(lái)分析,ECLIA較之LC-MS/MS測(cè)定結(jié)果偏高[7,12-13]。再者,ECLIA無(wú)法避免25(OH)D3的3-epi-25(OH)D3異構(gòu)體造成的影響,導(dǎo)致交叉反應(yīng),從而可能使得檢測(cè)結(jié)果較高[14]。25(OH)D與維生素D結(jié)合蛋白是否解離完全,也是影響其檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性的重要影響因素,受試者維生素D結(jié)合蛋白濃度差異也導(dǎo)致了其對(duì)維生素D代謝物的親和力不同,這也是ECLIA與LC-MS/MS產(chǎn)生檢測(cè)結(jié)果差異的可能原因[15]。

兩種方法在診斷維生素D缺乏時(shí)診斷符合率為94.68%,Kappa系數(shù)為0.875,一致性較好,診斷維生素D不足的診斷符合率為75.53%,Kappa系數(shù)為0.538,一致性中等,整體來(lái)看,依據(jù)營(yíng)養(yǎng)狀況診斷維生素D缺乏與不足的符合率較高。LC-MS/MS因其高靈敏度、特異度等優(yōu)勢(shì),被認(rèn)為是血清25(OH)D檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn),但目前質(zhì)譜儀器價(jià)格較高,且對(duì)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境條件及人員技術(shù)要求較高,在大型醫(yī)院及第三方醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用較多,在小型醫(yī)院暫未廣泛使用。而ECLIA自動(dòng)化程度高,成本較低,適用于小型醫(yī)院及健康體檢。這兩種方法在應(yīng)用和選擇時(shí),臨床應(yīng)考慮可能存在的干擾因素,根據(jù)實(shí)際情況選擇合適檢測(cè)系統(tǒng)。在進(jìn)行維生素D檢測(cè)時(shí),25(OH)D2雖檢出率較高,但大多數(shù)標(biāo)本濃度較低,對(duì)無(wú)LC-MS/MS檢測(cè)能力的實(shí)驗(yàn)室可選擇傳統(tǒng)免疫方法作為替代方法;當(dāng)受試者服用過(guò)25(OH)D2時(shí),LC-MS/MS是更可靠的檢測(cè)方法。在解讀維生素D報(bào)告時(shí),應(yīng)充分考慮所選用的檢測(cè)方法,建立本實(shí)驗(yàn)室所用方法檢測(cè)25(OH)D的參考范圍,并盡快實(shí)施維生素D檢測(cè)一致化計(jì)劃。

本研究尚有不足,僅比對(duì)了羅氏電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀與LC-MS/MS檢測(cè)25(OH)D的一致性,入組樣本量不大,后續(xù)可進(jìn)行其他平臺(tái)的比對(duì)。3-epi-25(OH)D3是25(OH)D3的同分異構(gòu)體,在結(jié)構(gòu)上僅有一個(gè)羥基空間方向上的差異,需高靈敏度質(zhì)譜儀器才能將其分離檢測(cè),它的存在會(huì)造成25(OH)D檢測(cè)結(jié)果的假陽(yáng)性,3-epi-25(OH)D3在一歲以下嬰幼兒中濃度較高,影響更為明顯。同時(shí)檢測(cè)25(OH)D2、25(OH)D3、3-epi-25(OH)D3的濃度有助于真實(shí)準(zhǔn)確地評(píng)估維生素D營(yíng)養(yǎng)水平,對(duì)于骨質(zhì)疏松、佝僂病的治療防治可提供有效診斷依據(jù),同時(shí)可為心血管及腫瘤疾病等提供輔助診斷。后續(xù)仍需繼續(xù)開(kāi)發(fā)可分離3-epi-25(OH)D3的LC-MS/MS檢測(cè)方法,助力實(shí)現(xiàn)25(OH)D的精準(zhǔn)檢測(cè)。同時(shí)提示檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)定期進(jìn)行比對(duì),保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。臨床在解讀報(bào)告時(shí)也應(yīng)考慮到不同檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。

綜上所述,ECLIA與LC-MS/MS檢測(cè)結(jié)果一致性較差,但依據(jù)營(yíng)養(yǎng)狀況診斷維生素D缺乏與不足的符合率較高。兩種檢測(cè)方法都可以應(yīng)用于臨床檢測(cè),臨床可根據(jù)實(shí)際需求選擇相應(yīng)檢測(cè)方法。