沙門菌藥敏結(jié)果與質(zhì)譜離子峰的關(guān)系分析*

何鳳媛,譚 博,黎 明,袁齊武,梅麗敏,趙 琳

1.成都市郫都區(qū)疾病預(yù)防控制中心,四川成都 611730;2.重慶醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科,重慶 400000;3.成都市疾病預(yù)防控制中心,四川成都 610051

沙門菌是一類普遍分布在自然環(huán)境中的革蘭陰性桿菌,隸屬于腸桿菌科,可分為傷寒和非傷寒兩類。沙門菌血清學(xué)分型眾多,根據(jù)菌體抗原(O)和鞭毛抗原(H)作為血清學(xué)分型的分類依據(jù),全球發(fā)現(xiàn)的血清學(xué)分型約有2 659種[1],而且還在不斷出現(xiàn)新的致病性血清學(xué)分型。沙門菌每年在全世界引起93萬例的腸道感染和15.5萬例的患者死亡[2]。在我國,每年因沙門菌感染引起的疾病占食源性疾病的70%～80%[3],可見沙門菌感染是一個(gè)特別值得關(guān)注的公共衛(wèi)生問題。沙門菌的分型方式有血清學(xué)分型、分子分型等。四川省成都市近幾年的沙門菌血清學(xué)分型主要為腸炎血清學(xué)分型、鼠傷寒[4],這與研究中流行的優(yōu)勢血清學(xué)分型主要有腸炎血清學(xué)分型、鼠傷寒和紐波特等一致[5]。不同血清學(xué)分型和分子分型的沙門菌所致疾病、對藥物的敏感性各不相同。

近些年來,沙門菌的檢測方法從分離培養(yǎng)后的生化實(shí)驗(yàn)、血清學(xué)分型到脈沖場凝膠電泳(PFGE)、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)的運(yùn)用,越來越多的研究成果為預(yù)防沙門菌感染和感染后臨床用藥提供了技術(shù)支持[6-9]。但血清學(xué)分型、PFGE分型技術(shù)的檢測用時(shí)較長,特別是PFGE分型技術(shù)的操作過程繁瑣,影響因素多,為結(jié)果帶來了很多的不確定性。使用MALDI-TOF MS對沙門菌的研究主要用于沙門菌株型別的鑒定,采用數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行其他分析利用的研究很少。本研究初次嘗試采用用時(shí)較短,操作簡便的MALDI-TOF MS儀器對標(biāo)本進(jìn)行檢測,分析得出的數(shù)據(jù)圖譜以推測沙門菌與抗菌藥物種類使用之間的關(guān)系,為臨床早期用藥提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1菌株來源 菌株來源于2017-2020年成都市疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室收集的患者標(biāo)本和食品樣品中分離的保存菌株共19株。18份標(biāo)本來自哨點(diǎn)醫(yī)院送檢的患者糞便標(biāo)本分離鑒定陽性株,1份標(biāo)本來自食物風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測項(xiàng)目送檢食品標(biāo)本。標(biāo)本選取的標(biāo)準(zhǔn)為患者每日排便3次及以上,且大便有水樣、黏液、稀便或膿血便等性狀改變。

1.2儀器與試劑 Auto/Ultraflex MALDI-TOF MS質(zhì)譜儀(美國布魯克公司),VITEK-ⅡCompact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)(法國生物梅里埃公司),全自動(dòng)藥敏檢測儀(Thermo Fisher Scientific公司VIZION),小型液體處理工作站(Assist plus),沙門菌相關(guān)培養(yǎng)基(青島海博公司),診斷血清(寧波天潤公司),HCCA、Portioner基質(zhì)溶液(BRUKER公司),甲酸、乙腈、三氟乙酸(色譜純,美國Sigma公司)。

1.3方法

1.3.1分離鑒定 將分離得到的沙門菌保存株進(jìn)行復(fù)蘇后,挑選純菌落參照GB 4789.4-2016[10]及沙門菌的診斷血清說明書進(jìn)行分離鑒定檢測。

1.3.2藥敏試驗(yàn) 根據(jù)美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)推薦的藥敏試驗(yàn)檢測方法[11],以大腸桿菌ATCC25922作為質(zhì)控菌株。先用無菌接種環(huán)從培養(yǎng)基上刮取適量的新鮮菌落,轉(zhuǎn)移入2 mL無菌生理鹽水中制成均勻混懸液,然后用細(xì)菌比濁儀比濁,調(diào)整菌懸液的濃度至0.5～0.6個(gè)麥?zhǔn)蠁挝?。采用儀器配套的GN13藥敏卡,將質(zhì)控菌株和待測菌株上機(jī)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。本研究測定待檢菌株對2類別17種抗菌藥物的耐藥情況,藥敏結(jié)果用WHONET5.1軟件進(jìn)行分析。多重耐藥株是指對3類及以上類別抗菌藥物均耐藥的菌株。

1.3.3質(zhì)譜分析鑒定 使用接種環(huán)挑取適量純菌落均勻涂布在MALDI靶板上,同時(shí)記錄標(biāo)本編號(hào)及對應(yīng)的靶板位置。將1 μL 70%的甲酸水溶液仔細(xì)涂敷在標(biāo)本上在室溫下晾干,隨后在30 min以內(nèi)將1 μL HCCA基質(zhì)溶液涂敷在標(biāo)本上,待晾干后使用MALDI-TOF MS質(zhì)譜儀對標(biāo)本菌落進(jìn)行上機(jī)檢測。使用MALDI Biotyper Compass Explorer軟件系統(tǒng)采集相對分子質(zhì)量為2 000～20 000的正線性模式圖譜。使用MALDI Biotyper軟件對軟件自帶不能識(shí)別的標(biāo)本數(shù)據(jù)庫進(jìn)行標(biāo)本的自建庫,再使用MALDI Biotyper3.1軟件對得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析和主成分分析(PCA)。使用Flexanalysis軟件導(dǎo)出19株沙門菌的離子峰圖譜,在 2 000～12 000 m/z中進(jìn)行峰的篩選,判別峰的標(biāo)準(zhǔn):將峰±0.05%的偏差范圍內(nèi)視為同一離子峰。選取信噪比>20的離子峰,將所得離子峰結(jié)合沙門菌分型數(shù)據(jù)做差異性分析。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析,計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分率表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn)和Fisher 確切概率法,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1血清學(xué)分型 分離鑒定結(jié)果。19株菌株共鑒定出4種血清學(xué)分型,分別為傷寒沙門、甲型副傷寒沙門菌、乙型副傷寒沙門菌、丙型副傷寒/豬傷寒,占比分別為5.26%、21.20%、21.20%和52.34%。

2.2沙門菌的耐藥結(jié)果 抗菌藥物耐藥敏感性的判定參照文獻(xiàn)[12]推薦方法。對分離得到的19株沙門菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)所有菌株均對氨曲南耐藥,耐藥率為100.00%,對哌拉西林他唑巴坦也高度耐藥,耐藥率為94.74%。藥敏試驗(yàn)測試的抗菌藥物中,β-內(nèi)酰胺類除了頭孢吡肟、頭孢替坦和厄他培南,其他8種藥物耐藥率均超過50.00%,非β-內(nèi)酰胺類只有環(huán)丙沙星的耐藥率均超過了50.00%。見表1。

表1 沙門菌對17種抗菌藥物的耐藥狀況(%)

19株菌株對非β-內(nèi)酰胺類中的慶大霉素、阿米卡星高度敏感,敏感率均為100.00%。其次對左氧氟沙星、妥布霉素也表現(xiàn)出高敏感性,敏感+中度敏感率在85.00%以上。在測試的11種β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物中,19株菌株對厄他培南、頭孢替坦敏感率較高,敏感率+中度敏感率也超過了85.00%。

2.3沙門菌的聯(lián)合耐藥結(jié)果 19個(gè)菌株全部為多重耐藥株,耐藥率為100.00%,最多耐受13種抗菌藥物。其中同時(shí)耐10種藥物的菌株有5株,其耐藥譜占比最高為26.32%。見表2。

表2 沙門菌的多重耐藥結(jié)果

2.4蛋白質(zhì)指紋圖譜和離子峰分析結(jié)果 使用Flexanalysis軟件進(jìn)行峰分析后,獲得19株菌株4種不同血清學(xué)分型的蛋白質(zhì)指紋圖譜,將每株菌株的離子峰與峰值原始數(shù)據(jù)比對后得出19株沙門菌主要差異蛋白離子峰為2 181 m/z、2 207～2 234 m/z、2 649～2 690 m/z等28組。

本研究選用了分組比較的方式,以菌株不同耐藥型別來進(jìn)行分組,結(jié)合相應(yīng)分組的離子峰進(jìn)行分析。通過比較不同組別離子峰的靈敏度差異來篩選可能存在的特異性蛋白峰。計(jì)算公式:靈敏度=耐藥株具有某離子峰數(shù)目/耐藥菌的總數(shù)目,特異度=非某耐藥株不具有某離子峰數(shù)目/非耐藥菌的總數(shù)目[13]。

計(jì)算結(jié)果顯示,在不同耐藥型分組分析的結(jié)果中,離子峰在2 825、4 365、5 381、6 256、7 158、9 522 m/z的區(qū)分靈敏度較高,為100%。其中,選取靈敏度和特異度均高于50%的峰作為參考特異峰。3 128、3 158、5 144、6 094、6 484 m/z可能作為對亞胺培南耐藥的沙門菌具有的特異性蛋白峰。5 772 m/z可能作為對妥布霉素耐藥的沙門菌所具有的特異性蛋白峰;3 046 m/z可能作為對左氧氟沙星耐藥的沙門菌所具有的特異性蛋白峰;4 165 m/z可能作為對頭孢吡肟耐藥的沙門菌所具有的特異性蛋白峰;分析結(jié)果顯示,有少數(shù)峰靈敏度和特異度均高于50%,滿足了特異性蛋白峰的篩選要求,但因在幾種耐藥沙門菌中均有出現(xiàn),故只能作為耐不同藥物的沙門菌所共有的特征峰;10 957 m/z可能作為對亞胺培南、頭孢唑啉、頭孢他啶耐藥的沙門菌所共有的特征峰;5 710 m/z可能作為對妥布霉素、頭孢替坦耐藥的沙門菌所共有的特征峰;4 165 m/z為對亞胺培南、左氧氟沙星耐藥的沙門菌所共有的特征峰。

2.5蛋白質(zhì)指紋圖譜聚類分析和PCA 本研究將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Biotyper Compass Explorer 軟件,根據(jù)差異水平為300來進(jìn)行PCA和聚類分析,結(jié)果顯示19株沙門菌被分為4個(gè)MALDI-TOF MS型別,與本研究血清學(xué)分型的分類不一致。血清學(xué)分型判定為傷寒沙門的4株菌在PCA分類中被分到了3個(gè)組別中,血清學(xué)分型判定為丙型副傷寒的4株菌在PCA分類中被分到了3個(gè)組別中,PCA中同一組別的菌株也都不是同一血清學(xué)分型,提示血清學(xué)分型與質(zhì)譜蛋白質(zhì)指紋圖譜分類沒有關(guān)系。見圖1。

圖1 沙門菌蛋白質(zhì)指紋圖譜的PCA

3 討 論

細(xì)菌耐藥是一個(gè)全球性的問題,抗菌藥物的不規(guī)范使用和細(xì)菌自然變異與傳播使多重耐藥菌的數(shù)量增多,可能會(huì)嚴(yán)重威脅患者生命健康。本研究中的沙門菌株感染者居住地在成都地區(qū),實(shí)驗(yàn)室耐藥測試結(jié)果顯示,測試的沙門菌株對β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物普遍耐藥,除頭孢吡肟的耐藥率為21.05%、頭孢替坦的耐藥率為10.53%和氨曲南的敏感率為100.00%外,對其余抗菌藥物如氨芐西林、氨芐西林舒巴坦的耐藥率均在50.00%以上;測試的沙門菌株對非β-內(nèi)酰胺類藥物普遍敏感,除了對環(huán)丙沙星有一定耐藥以外,對其他藥物的敏感率均在85.00%以上,這與成都[14]和廣州地區(qū)[3]的研究有相似之處。第三、四代頭孢類藥物因其對沙門菌有較好的抗菌活性,而被臨床廣泛使用。本研究中發(fā)現(xiàn),測試的沙門菌株對第一代頭孢類藥物頭孢唑啉耐藥率為52.63%,對第三代頭孢類藥物頭孢曲松、頭孢他啶的耐藥率分別為73.68%、52.63%,表現(xiàn)出較高的耐藥性,而對第四代頭孢類藥物頭孢吡肟表現(xiàn)出較好的敏感性,提示在臨床用藥中應(yīng)慎重選擇頭孢類抗菌藥物。細(xì)菌耐藥是需要用藥者、制藥者和醫(yī)學(xué)研究者共同面對和解決的問題。這需要用藥者遵醫(yī)囑合理規(guī)范使用抗菌藥物;政府加強(qiáng)對抗菌藥物生產(chǎn)、使用的監(jiān)管;在臨床應(yīng)用中醫(yī)生可參考該區(qū)域內(nèi)最新藥敏統(tǒng)計(jì)結(jié)果,為沙門菌感染患者選擇針對性更強(qiáng)、更有效的抗菌藥物對患者進(jìn)行救治以減少耐藥的發(fā)生。

MALDI-TOF MS 本質(zhì)上是一種理化分析技術(shù),其原理是根據(jù)蛋白質(zhì)的不同質(zhì)量和質(zhì)荷比來進(jìn)行離子分離,使用不同質(zhì)荷比的蛋白質(zhì)飛行通過檢測器時(shí),需要時(shí)間的不同數(shù)值來量化數(shù)據(jù),這個(gè)技術(shù)已被廣泛應(yīng)用到細(xì)菌的鑒定和分析中。特別是對于數(shù)據(jù)庫中數(shù)據(jù)信息相對豐富的細(xì)菌種屬,如對金黃色葡萄球菌、克雷伯菌等菌的研究者越來越多。例如RODRIGUES等[15]用MALDI-TOF MS對肺炎克雷伯菌菌種的特異性生物標(biāo)志物的研究;WANG等[16]用MALDI-TOF-MS發(fā)現(xiàn)了耐甲氧西林金黃色葡萄球菌與甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌在2 435、5 285、6 905 m/z附近的特征峰有數(shù)量上的差異;陸文香等[17]用MALDI-TOF MS發(fā)現(xiàn)了耐萬古霉素腸球菌的4個(gè)特異性蛋白峰質(zhì)荷比為2 194.94、3 022.15、3 167.47、4 058.08 m/z;這些研究不依賴抗菌藥物而是直接檢測細(xì)菌的蛋白,快速省時(shí)且結(jié)果可靠。目前對于亞種和血清學(xué)分型均較多的沙門菌,也有研究者開始使用MALDI-TOF MS技術(shù)進(jìn)行研究。苗麗等[18]、湯英賢等[19]利用MALDI-TOF MS對沙門菌進(jìn)行了菌屬鑒別。本研究使用MALDI-TOF MS收集得到沙門菌的原始蛋白峰圖譜數(shù)據(jù),在Flexanalysis軟件分析中,選取可信度分值高于2的峰圖納入分析,利用耐藥菌和敏感菌的質(zhì)譜峰圖之間特征峰的坐標(biāo)差異推斷出對亞胺培南、妥布霉素、左氧氟沙星、頭孢吡肟等耐藥的沙門菌特異性蛋白峰,可為臨床沙門菌感染用藥提供指導(dǎo)方向,縮短臨床選擇針對性抗菌藥物的時(shí)間。

本研究中蛋白質(zhì)指紋圖譜聚類分析的結(jié)果采用樹狀圖顯示,圖表中的數(shù)值大小反映菌株的差異大小,即親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。根據(jù)所選擇的差異水平不同,沙門菌被分型的類別數(shù)目也不同[18]。本研究中的細(xì)菌標(biāo)本按血清學(xué)分型分為4種,在進(jìn)行PCA時(shí),將細(xì)菌也分成了4類,但MALDI-TOF MS 方法分型結(jié)果與血清學(xué)分型結(jié)果并不一致,在某些條件下兩種方法分型結(jié)果可能會(huì)有相似的部分,這與鄭秋月等[20]研究一致。造成兩種分析方法分型不同的原因在于兩種分析方法原理上的差別。血清學(xué)分型的區(qū)分是利用血清試劑通過抗原抗體結(jié)合原理來達(dá)到分離效果,參與結(jié)合實(shí)驗(yàn)中的目標(biāo)物質(zhì)為細(xì)菌的抗原蛋白;其分離結(jié)果好壞的影響因素眾多,包括血清試劑效價(jià)的高低,試劑純度等[19]。而MALDI-TOF MS 是將采集到目標(biāo)菌的靶位蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對,與數(shù)據(jù)庫中比對一致的保守蛋白峰用來確定細(xì)菌的種屬,特異性蛋白峰則用來區(qū)分細(xì)菌的亞型或者耐藥亞型[21],從而達(dá)到分離鑒別的目的。目標(biāo)蛋白包括了所有的細(xì)菌遺傳信息;細(xì)菌蛋白質(zhì)的各種變化受到自然或宿主環(huán)境改變的影響,其中包括使用藥物產(chǎn)生耐藥性的改變;除此之外,菌種鑒定指紋圖譜還可能受到菌種培養(yǎng)環(huán)境(培養(yǎng)的溫度、培養(yǎng)基成分、pH值等)和培養(yǎng)時(shí)間長短的影響。為了盡可能排除菌種本身特征之外其他可控因素的影響,可盡可能調(diào)整實(shí)驗(yàn)條件一致或是同時(shí)復(fù)蘇和培養(yǎng)目標(biāo)菌,再使用MALDI-TOF MS進(jìn)行分類鑒定。雖然兩種分型方式依賴的都是細(xì)菌體的蛋白質(zhì)成分,但因接受分析的蛋白質(zhì)受到多種因素影響而發(fā)生了變化,從而出現(xiàn)分析結(jié)果的差異性。

MALDI-TOF MS只能對菌種的蛋白質(zhì)進(jìn)行定性檢測,因蛋白質(zhì)離子峰的本質(zhì)是相對值,而非該特定蛋白質(zhì)物質(zhì)的量的絕對值[17],因此無法對菌種的特有蛋白水平進(jìn)行定量分析,無法證實(shí)離子峰的大小與某耐藥型的沙門菌相應(yīng)的蛋白物質(zhì)之間是否有數(shù)量關(guān)系。

綜上所述,本研究通過對沙門菌指紋圖譜進(jìn)行分析,找到了其中耐抗菌藥物的特異性蛋白峰,但因分離到的陽性菌株樣本量過少,標(biāo)本中沒有單一耐藥的菌株,難以確定特異性蛋白峰是單一離子峰還是多個(gè)離子峰共同產(chǎn)生的結(jié)果,對分析結(jié)果可能產(chǎn)生一定影響。再者,除去細(xì)菌本身蛋白質(zhì)成分對結(jié)果的影響,不同宿主、地域、細(xì)菌培養(yǎng)環(huán)境都會(huì)對細(xì)菌的蛋白質(zhì)成分產(chǎn)生影響,下一步需加大樣本數(shù)量和菌株的類別,進(jìn)一步細(xì)化宿主和地域因素、統(tǒng)一細(xì)菌培養(yǎng)條件為沙門菌數(shù)據(jù)庫補(bǔ)充更多數(shù)據(jù)和進(jìn)行驗(yàn)證分析。