探究濾泡輔助性T細(xì)胞在潰瘍性結(jié)腸炎中的作用

黃偉航，林艷芬

1.廣州市番禺區(qū)沙灣鎮(zhèn)社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，廣東 廣州 511483；

2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗科，廣東 廣州 510260

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）作為一種累及結(jié)直腸黏膜及黏膜下層為主的慢性炎癥性腸道疾病，近年來發(fā)病率逐年上升，主要誘因包括環(huán)境因素、飲食結(jié)構(gòu)、微生物影響及心理因素等，然而該病的發(fā)病機(jī)制尚不明確［1］。目前UC 的治療基本以局部直腸給藥為主，然而這種治療方式只能部分緩解病情，且存在疾病容易復(fù)發(fā)和藥物響應(yīng)個體差異大的缺點，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量［2-3］。因此，挖掘潰瘍性結(jié)腸炎特異性免疫標(biāo)志物，尋找有效干預(yù)靶點，對于疾病的早期診斷與針對性治療具有重要意義。據(jù)文獻(xiàn)［4］報道，濾泡輔助T細(xì)胞（Tfh）作為一群獨立的CD4+T效應(yīng)細(xì)胞亞群，定位于淋巴濾泡，主要功能是輔助B 細(xì)胞增殖產(chǎn)生抗體，參與體液免疫應(yīng)答。該群細(xì)胞的表型特征為高表達(dá)濾泡歸巢趨化因子受體CXCR5，高表達(dá)細(xì)胞因子白介素（IL-21）和轉(zhuǎn)錄因子Bcl6。IL-21 可誘導(dǎo)Tfh 的分化并促進(jìn)細(xì)胞表面CXCR5 的表達(dá)，Bcl6 對于Tfh 轉(zhuǎn)移到淋巴濾泡和B細(xì)胞生發(fā)中心（GC）的形成不可或缺［5］。已有研究［6］表明，Tfh 在SLE 等自身免疫性疾病患者中呈現(xiàn)上調(diào)，同時，狼瘡發(fā)病小鼠過程中也伴隨著Tfh 細(xì)胞數(shù)量的增加［7］?；谏鲜霭l(fā)現(xiàn)，Tfh 被認(rèn)為在多種自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色，為疾病治療提供靶向Tfh 細(xì)胞的新思路［8-9］。盡管如此，關(guān)于Tfh 細(xì)胞在UC 疾病中的作用相關(guān)報道仍較少。因此，探究Tfh 在潰瘍性結(jié)腸炎中的作用，將為闡述UC 的免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制與疾病的針對性治療提供新的思路和靶點，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018 年1 月—2019 年12 月廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院25 例UC 患者臨床外周血標(biāo)本作為實驗組。參考2018年中華醫(yī)學(xué)會消化病學(xué)分會對潰瘍性結(jié)腸炎診斷與治療的共識意見中的診斷標(biāo)準(zhǔn)，納入以下患者：（1）年齡和性別不限；（2）結(jié)腸鏡檢、黏膜活檢后可確診為潰瘍性結(jié)腸炎的人群。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其它系統(tǒng)嚴(yán)重疾病。再選取25 名同年齡組健康成人（HC）外周血標(biāo)本作為對照組，兩組受試者之間年齡、性別等一般資料具有可比性（P＞0.05）。本研究經(jīng)廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 主要實驗試劑

Anti-human 流 式 抗 體 CD45 （APC-Cy7）， CD3（BV421），CD4（FITC），CXCR5（PE），Bcl6（PE-Cy7）均購自美國Biolegend 公司； Trizol，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，qRT-PCR 試劑盒，ELISA 試劑盒（IL-21）購自Invitrogen公司；人淋巴細(xì)胞分離液Ficoll購自GE公司。

1.3 外周血單個核細(xì)胞PBMC 的分離與Tfh 細(xì)胞的流式檢測

使用含EDTA 抗凝管采集UC 患者與健康對照的外周血標(biāo)本，離心后對上層血漿進(jìn)行分離凍存，剩余血液中加入等體積的磷酸鹽緩沖液（PBS），充分混勻。隨后緩緩加入到人淋巴細(xì)胞分離液Ficoll 的上層（保持清晰分層界面），進(jìn)行離心（離心條件為20 ℃， 升速為5 降速為0，時間20 min）。離心結(jié)束后，吸取中間白膜層細(xì)胞至50 mL離心管中，往其中加入10倍體積的PBS后進(jìn)行離心，棄上清，收集細(xì)胞沉淀，此沉淀即為所需的外周血單個核細(xì)胞（PBMC）。通過流式細(xì)胞儀對獲得的PBMC 細(xì)胞進(jìn)行如下檢測： Tfh的流式染色使用1×106細(xì)胞；Bcl6的流式染色使用2×106細(xì)胞，在Tfh染色的基礎(chǔ)上進(jìn)行破核與核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子染色。隨后進(jìn)行抗體孵育，將標(biāo)有抗體的細(xì)胞置于4 ℃孵育30 min，后加入PBS 進(jìn)行終止。染色完成后，將吹打好的單個細(xì)胞進(jìn)行流式上機(jī)檢測，最后將采集到的數(shù)據(jù)使用分析軟件Flowjo10.0進(jìn)行詳細(xì)分析。

1.4 qRT-PCR實驗檢測

采集分離獲得的PBMC 樣品，使用Trizol 試劑進(jìn)行總RNA 提取。按照Invitrogen 公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒與qRT-PCR試劑提供的使用說明書進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化操作。檢測基因序列如下： GAPDH （Forward: 5'-TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3'；Reverse：5'-ACACCATGTATTCCGGGTCAAT-3'）；Bcl6（Forward：5'-GGAGTCGAGACATCTTGACTGA-3'，Reverse：5'-ATGAGGACCGTTTTATGGGCT-3'）。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t 檢驗。計數(shù)資料以例數(shù)和百分比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 UC患者外周血中Tfh的比例呈顯著增加

據(jù)文獻(xiàn)報道，人外周血中Tfh 細(xì)胞的特征性表面分子標(biāo)記為CD45+CD3+CD4+CXCR5+，在系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫病患者外周血中，Tfh 細(xì)胞數(shù)量較正常人顯著增加，且伴隨Tfh 相關(guān)功能分子如ICOS、IL-21 等表達(dá)上調(diào)［10］。采集外周血分離PBMC 后，利用流式細(xì)胞術(shù)對PBMC 進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，實驗組外周血PBMC 中Tfh 水平出現(xiàn)顯著上升，對照組（2.886±0.557 1），實驗組（10.35±1.833）。統(tǒng)計結(jié)果顯示，實驗組中Tfh細(xì)胞水平顯著上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。

研究表明，Bcl6 是促進(jìn)Tfh 細(xì)胞發(fā)育與功能最為關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子［5,11］。獲取兩組外周血PBMC 細(xì)胞后，提取細(xì)胞總RNA并進(jìn)行mRNA水平的檢測，發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Bcl6在UC組中表達(dá)增高，采用管家基因GAPDH作為內(nèi)參進(jìn)行均一化數(shù)據(jù)處理。使用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行Tfh 細(xì)胞染色，并破核對Bcl6進(jìn)行染色，檢測結(jié)果顯示，Bcl6的表達(dá)明顯右移，平均熒光強(qiáng)度顯著增高，這一結(jié)果說明UC 患者中Bcl6的表達(dá)同樣增加，與mRNA水平的結(jié)果相一致。

在Tfh 發(fā)揮調(diào)節(jié)功能的過程中，Bcl6 轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)受IL-21 的調(diào)控［12］。因此，研究者使用ELISA 試劑盒對血漿中的IL-21 進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)與對照組的血漿相比，結(jié)腸炎患者血漿中IL-21 的含量呈大幅度增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000 3）。此外，血漿中IL-21 與外周血中Tfh的細(xì)胞比例有顯著的相關(guān)性（R2=0.549，P=0.005 8）。這一結(jié)果提示，IL-21的含量或許可用于評估患者體內(nèi)Tfh細(xì)胞的表達(dá)水平。

3 討論

迄今為止，潰瘍性結(jié)腸炎的免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，治療效果并不理想。目前認(rèn)為，除了個人遺傳易感性、外部環(huán)境與腸道微生物外，免疫細(xì)胞與細(xì)胞因子等構(gòu)成的腸道局部免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的異常是UC 發(fā)病的重要因素［13］。其中，以Th17和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）亞群的研究最為常見。已有文獻(xiàn)［14-16］表明，UC 患者外周血與腸道黏膜中發(fā)現(xiàn)數(shù)量明顯增多的Th17 細(xì)胞，且該細(xì)胞浸潤水平與腸炎的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，一定程度上可作為反映腸炎的標(biāo)志物使用；而Treg 在UC 中的變化情況目前尚存在爭議，但發(fā)現(xiàn)其功能是減退的［17-18］。同時，炎性細(xì)胞因子IL-17 等在UC 中的表達(dá)整體出現(xiàn)上升趨勢，而IL-10 等抑炎因子的表達(dá)則出現(xiàn)明顯下降［19］。綜合上述結(jié)果，UC 患者中可能存在一定的免疫失衡，包括Th17 與Treg 之間、促炎因子與抑炎因子之間。最新研究［20］表明，免疫治療在UC 患者中，可作為一種對常規(guī)治療無效的新型治療方案?，F(xiàn)有免疫治療包括促炎因子相應(yīng)阻斷抗體、Treg 回輸?shù)?，但總的來說免疫治療的效果欠佳。導(dǎo)致這一現(xiàn)象的重要原因是目前人們對UC 相關(guān)免疫致病機(jī)理的理解還不夠充分，因此需要深入研究以闡明UC 發(fā)病相關(guān)免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。

Tfh 作為體液免疫的重要調(diào)控細(xì)胞亞群，其在潰瘍型結(jié)腸炎中的功能研究至今仍未明確。本研究從Tfh 細(xì)胞著手，主要探究了Tfh 在UC 中的表達(dá)及作用研究。結(jié)果顯示，UC 患者中呈現(xiàn)出Tfh 細(xì)胞水平的明顯上升，說明Tfh可能是影響UC 發(fā)病的重要因素之一。因此，本研究進(jìn)一步探索了其中的分子機(jī)制。Tfh 參與體液免疫應(yīng)答的方式主要為分泌細(xì)胞因子IL-21。IL-21 在Tfh 細(xì)胞的發(fā)生和發(fā)育中起關(guān)鍵作用，可誘導(dǎo)Tfh 的分化并促進(jìn)其表面CXCR5的表達(dá)［4］。而Bcl6 作為最關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，其對于Tfh 轉(zhuǎn)移到淋巴濾泡與生發(fā)中心的形成不可或缺。在本研究中，研究者運用流式細(xì)胞術(shù)檢測了Tfh 細(xì)胞核內(nèi)Bcl6 的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)其水平在患者中呈顯著升高。同時，檢測了PBMC 細(xì)胞中Bcl6 在mRNA 水平的表達(dá)，結(jié)果顯示與蛋白水平結(jié)構(gòu)一致。然而，由于PBMC 中Tfh 比例很低（約占PBMC 所有細(xì)胞的0.2%），流式分選難度較大，因此僅使用PBMC 細(xì)胞進(jìn)行檢測，這一結(jié)果雖不夠準(zhǔn)確，但也能夠在一定程度上與流式檢測的蛋白水平結(jié)果相互吻合。Bcl6 的轉(zhuǎn)錄表達(dá)主要受上游細(xì)胞因子IL-21 的調(diào)控，因此，下一步研究者檢測了UC患者血漿中IL-21的含量，結(jié)果顯示，細(xì)胞因子IL-21的含量呈顯著上調(diào)。此外， 研究者還發(fā)現(xiàn)在外周血中，IL-21的含量與Tfh的水平呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)。上述結(jié)果提示Tfh細(xì)胞可能通過細(xì)胞因子IL-21來影響B(tài)cl6的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)UC的發(fā)生。

綜上所述，本研究中，UC 患者Tfh 細(xì)胞顯著增加，且Tfh中Bcl6的表達(dá)水平上升，提示Tfh可能促進(jìn)了潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生，該種促進(jìn)作用可能與其胞內(nèi)產(chǎn)生的大量細(xì)胞因子IL-21密切相關(guān)。本研究中Tfh的相關(guān)發(fā)現(xiàn)可為臨床免疫治療提供潛在的應(yīng)用價值與新的思路。