腫瘤原位熒光標記技術設計和探索虛擬仿真實驗

宦雙燕，李珂，張曉兵，羅偉平，王玉枝，尹霞，任天兵，高紅霞，梁志武

1湖南大學化學化工學院，長沙 410082

2 中南大學化學化工學院，長沙 410083

分子影像學(molecular imaging，MI)近年來發(fā)展迅速，借助特定的分子探針與成像技術可以探查細胞或分子水平的化學信息差異，進而實現(xiàn)分子水平上的無損、實時成像和定性、定量研究[1,2]。醫(yī)學上借助電子計算機斷層掃描(CT)、核磁共振成像等技術只能觀測到發(fā)生結構解剖學改變的圖像，而借助分子成像技術能夠獲取尚無結構解剖學改變之前的異?；瘜W信息，為生命和疾病過程研究、早期診斷和療效評價提供新的研究手段[3,4]。

其中，基于熒光成像技術的有機小分子探針具有結構設計性強、響應迅速、易代謝、樣本損傷小等優(yōu)勢，是細胞和活體水平生化信息獲取的強有力手段。然而，現(xiàn)有的熒光分子探針大多是基于水溶性或脂溶性的熒光染料構建而成，其在生理應用過程中因溶解性較大而容易從反應位點擴散開，難以實現(xiàn)目標物的原位檢測以及真實反映目標物局部濃度的變化[5,6]。此外，基于該類染料構建的小分子探針在活體腫瘤等重大疾病的精準成像上存在明顯缺陷，無法明確區(qū)分正常組織和病變組織的界限，難以為此類疾病的手術切除提供可靠指導。本研究團隊發(fā)展的固態(tài)發(fā)光熒光探針能夠實現(xiàn)細胞膜上靶標分子的長時間原位熒光標記[7]，該技術還能進一步用于腫瘤的原位精準成像和成像指導的手術切除。

該科研成果屬于化學與生物學交叉前沿領域，即發(fā)展新型化學研究工具，解決生物學領域關鍵科學問題的研究。將具有原創(chuàng)性的重要科研成果轉化為本科教學項目，服務“知識、素質、能力”培養(yǎng)，促進科研思維和創(chuàng)新能力提升，也契合新時代對高校本科人才培養(yǎng)的新要求[8]。但該科研實驗存在周期長、成本高、消耗大的困難，需要系列昂貴儀器設備，涉及大量細胞和活體操作以及生物成像實驗，并且需要豐富的分子設計、合成和生物學實驗經驗，屬于大型綜合訓練，在真實實驗條件下難以引入本科教學。

基于U3D三維虛擬現(xiàn)實技術平臺，將固態(tài)發(fā)光原位熒光成像機理、標記探針的設計與合成、結構表征與多參數(shù)性能測試、細胞原位熒光成像、小鼠和模擬人體腫瘤原位成像與切除等過程采用可視化的虛擬仿真手段展現(xiàn)，開發(fā)了“腫瘤原位熒光標記技術設計和探索虛擬仿真實驗”，該實驗包含三個模塊：(1) 腫瘤原位熒光標記探針的設計；(2) 腫瘤原位熒光標記探針的合成及性質測試；(3) 原位熒光成像與導航手術切除腫瘤。虛擬仿真實驗中設計了17個步驟、37步交互操作，幫助學生深入理解分子結構與光譜性質、成像性能的關系，通過探究理解如何獲得一個高性能分子成像工具。該虛擬仿真實驗項目解決了上述科研引入本科教學的難題，在項目設計上體現(xiàn)了科學思維訓練的高階性、創(chuàng)新性和挑戰(zhàn)度，為“互聯(lián)網+”化學化工本科創(chuàng)新人才培養(yǎng)提供了有力平臺。

1 實驗目標

通過該虛擬仿真實驗訓練，希望學生能夠理解原位熒光標記技術及腫瘤原位精準成像基本原理，掌握有機合成實驗基本技能與操作，探究基于構效關系的抗擴散固態(tài)發(fā)光染料分子設計與優(yōu)化的原理與方法，理解探針響應性能研究的實驗設計思路和性能評價，了解細胞、活體水平原位熒光成像及成像指導手術切除的基本操作，在探究基礎上初步形成高性能化學分子工具設計與應用的創(chuàng)新研究思路。實驗的關鍵是理解分子結構設計的基本思路，學會結構與光譜性質、成像性能之間關系的分析，能夠從實驗探索中總結規(guī)律。

2 虛擬實驗儀器試劑和功能設計

虛擬實驗涉及的儀器有旋轉蒸發(fā)儀、通風櫥、無菌操作臺、細胞培養(yǎng)箱、激光共聚焦顯微鏡、紫外分光光度計、熒光光譜儀、X射線單晶衍射儀、基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀、核磁共振波譜儀、小動物多模式成像系統(tǒng)等。使用到的耗材包括離心管、移液槍、比色皿、細胞培養(yǎng)瓶、96孔板、共聚焦培養(yǎng)皿，以及稱量、取液、有機合成與分離的玻璃儀器。使用的虛擬試劑除了常見有機溶劑、緩沖溶液、培養(yǎng)基、有機試劑外，還有毒性較強的三光氣、細胞膜和細胞核定位試劑，以及肝癌、卵巢癌等細胞系。

該虛擬實驗采用全三維建模，虛擬實驗室應包括實驗中所需要的各類實驗場景，如實驗室、虛擬儀器設備以及仿真室內工作場景，可實現(xiàn)多場景室內自由漫游。虛擬仿真實驗系統(tǒng)采用B/S構架設計，基于網絡實驗中心管理系統(tǒng)平臺運行。系統(tǒng)采用數(shù)據(jù)層、支撐層、仿真層和應用層的四層架構。

實驗采用Win7以上操作系統(tǒng)的電腦，只使用鍵盤鼠標操作，無需外加設備、無需安裝客戶端的情況下，可以通過瀏覽器順利打開該虛擬仿真軟件進行實驗，有效鏈接網址為：http://hnuygbj.dlvrtec.com。學生用手機外網登錄該虛擬仿真實驗平臺，用瀏覽器可以打開進行實驗，無需安裝客戶端，從校外互聯(lián)網網絡鏈接地址可直接指向實驗項目。

虛擬實驗軟件提供虛擬實驗的演示、學習和考核等不同模式，并且在整個實驗過程中可以在不同模式之間無縫自由切換。在演示模式中，系統(tǒng)自動執(zhí)行虛擬實驗演示操作方法。在學習模式中，通過打開提示，可以根據(jù)詳細的步驟提示、3D物體上的紅光閃爍引導對于實驗操作步驟進行學習，在引導下完成虛擬實驗。在考核模式下，操作者在沒有提示的情況下獨立完成整個實驗。

虛擬實驗通過W、A、S、D控制前進、后退、左移和右移，Z、X控制放大、縮小，鼠標右鍵控制角度，鼠標左鍵控制選取物品。實驗配備了語音系統(tǒng)，操作過程通過語音系統(tǒng)，朗讀操作步驟提示，操作過程中可以聽到操作步驟說明。朗讀內容可以通過平臺自由修改，并且與實驗中所顯示的文字提示內容可以分別獨立修改。在實驗過程中可以在不同的大步驟之間自由切換，可以隨時跳轉到其他大步驟。

3 虛擬仿真實驗內容與設計思路

腫瘤原位熒光標記技術設計和探索虛擬仿真實驗設計了三大模塊17個步驟，包含37步學生可交互操作的實驗過程。

3.1 模塊一：腫瘤原位熒光標記探針的設計

結合開場動畫演示，首先引入兩個問題，為什么傳統(tǒng)膜靶向探針難以實現(xiàn)原位分析？已報道固態(tài)熒光探針可以釋放疏水熒光染料，用于活細胞中原位成像生物標記物，但它們難以實現(xiàn)長時間原位分析，為什么？由此引入本虛擬仿真實驗的設計目標(圖1)，基于傳統(tǒng)的固態(tài)熒光染料HPQ (2-(2-羥苯基)-4(3氫)-喹唑啉酮)，設計一個強疏水性和低親脂性的熒光染料，并將其發(fā)射波長從遠紅外延長到近紅外區(qū)域。

圖1 模塊一腫瘤原位熒光標記探針的設計操作界面

通過動畫演示和互動操作，能夠初步理解傳統(tǒng)易擴散熒光探針和本實驗擬合成的沉淀型固態(tài)發(fā)光熒光探針的本質區(qū)別，了解HPQ類染料的結構特點和ESIPT (激發(fā)態(tài)分子內質子轉移)的固態(tài)發(fā)光機理，理解探針設計時為什么要降低親脂性和提高疏水性，以實現(xiàn)在細胞膜上長時間的原位成像，以及為什么要將波長移動到近紅外區(qū)，增加探針的組織穿透深度，以實現(xiàn)活體應用。

通過在HPQ分子的R位置引入不同的取代基團(圖2)，學生可以鍵盤操作拖拽19個不同的取代基到R取代基位置，獲得相應化合物結構，選定某化合物后可以進入結構分析?？梢垣@得每個化合物溶解和過濾后的熒光光譜對比，熒光比色皿中過濾前后肉眼可見的顏色變化對比，以及結構分析的說明。如果過濾前是強熒光，而過濾后幾乎無熒光，則說明化合物幾乎完全不溶，而過濾后依然保持熒光則說明化合物溶解性很好。從熒光光譜的發(fā)射波長可以看出化合物是否接近近紅外區(qū)。學生需要通過不同化合物之間熒光光譜的比較，具有強疏水性、低親脂性和近紅外發(fā)射的沉淀型熒光染料HYPQ，同時了解結構設計中的一些竅門，如通過給電子基團(D)-吸電子基團(A)相互作用和π-共軛體系的組合，使熒光發(fā)射波長有效紅移；良好的平面性可以促進分子間π-π堆疊相互作用，從而降低溶解度并實現(xiàn)抗擴散成像。進一步在HYPQ染料中引入水溶性的谷氨酸基團，提高其生物相容性，設計GGT (γ-谷氨酰轉肽酶)激活型原位成像熒光探針，同時可以點擊查看其余對比分析探針的結構。

圖2 R位不同取代基化合物結構及光譜性質示意圖

模塊一設計了交互操作(1)-(3)，完成相應的分步實驗操作，獲得相應的賦分，模塊一的總賦分為20分，側重于對固態(tài)發(fā)光原位熒光探針基本原理的理解和探針的設計。

保存試驗時間2014年9月9日至2015年1月14日。保存試驗材料，按D配方生產羊全混合顆粒飼料D1～D3，D1、D2在湖北天越牧業(yè)有限公司羊場采用平模制粒，D1直接冷制粒（KL-150型顆粒機，壓縮比6∶1）；D2冷制粒（KL-150型顆粒機，壓縮比4.7∶1），適當加水調質（由少到多逐漸增加水分）到成型效果良好，眼觀不到明顯粉料。D3委托羊場周邊某規(guī)模飼料廠制粒（年單班產量10萬噸以上，420型環(huán)模制粒機，蒸汽調質）。選擇育肥豬商品料D4(與D3加工方式相同)和某公司送場試用的全混合顆粒飼料D5(加工方式不清楚)作對照。

3.2 模塊二：腫瘤原位熒光標記探針的合成及性質測試

學生可根據(jù)對實驗的掌握情況，自主選擇進行腫瘤原位熒光標記探針的合成或性質分析實驗，點擊選擇不同的近紅外(NIR)沉淀型熒光染料或探針，然后進入合成路線界面(圖3)，虛擬仿真實驗中提供了8種探針的合成步驟，其中HYPQ和抗擴散的GGT原位成像探針HYPQG兩個探針可以進一步進入實驗合成操作步驟。

圖3 模塊二實驗流程界面及8種探針結構示意圖

合成步驟中首先對實驗用到的試劑耗材和反應裝置有一個簡單介紹，操作界面提供了多種視角，如初始視角、實驗視角、儀器視角和輔助視角等，學生可以操縱鼠標進行360度的漫游觀察整個虛擬實驗室的場景，如通風櫥、實驗臺、所有儀器設備等(圖4)，增加沉浸式實驗感受。

圖4 虛擬實驗室場景及功能鍵界面示意圖

實驗中點擊對應的試劑即可加入反應瓶，搭建反應裝置，進行化合物的合成。儀器設備完全復原了探針合成的實驗場景，反應時間可以加速。反應完成后，對合成產物進行后處理和純化，然后測試核磁共振氫譜、碳譜和質譜(圖5)。合成HYPQ后可進一步合成HYPQG探針。合成步驟設計了交互操作(4)-(7)，賦分19分。

圖5 HYPQ的質譜解析界面及HPQ單晶衍射分析界面示意圖

完成HYPQG的合成和結構表征后，進一步對單晶衍射、親脂性、抗擴散性、化學穩(wěn)定性、光穩(wěn)定性、探針對GGT的熒光響應性質進行分析。以親脂性研究為例，又分5個小步驟，對比HPQ、HTPQ、HYPQ在二氯甲烷中的熒光顏色差異，對比三者在薄層色譜板上展開后的熒光差異，用熒光光譜儀測試在溶劑中和過濾后的熒光差異，用紫外光譜儀比較三者在不同溶劑中、過濾前后的紫外光譜差異，通過紫外吸收法測定三者在不同溶劑中濃度與吸光度的曲線。再如在探針對GGT響應的熒光性質測試中，包括HYPQ和HYPQG在不同溶劑中的紫外光譜測試(圖6)，HYPQG隨GGT濃度增加的熒光發(fā)射光譜變化，反應后基質輔助激光解析-飛行時間質譜(MALDI-TOF/MS)的譜圖變化，在不同濃度GGT抑制劑作用下HYPQG的熒光響應變化，實時測定650 nm處熒光隨時間變化的情況，測試不同活性物種對反應的影響，對HYPQG與GGT反應轉化的沉淀顆粒進行激光粒度、透射電鏡、掃描電鏡等分析(圖7)。全部完成后，也可根據(jù)掌握程度選擇性地進入實驗再次學習。性能表征部分設計了交互操作(8)-(28)，賦分31分。

圖7 質譜儀、激光粒度分析儀、透射電鏡和掃描電鏡等高端儀器實驗界面

模塊二共設計25步交互操作，總賦分為50分，側重于對有機合成步驟與操作的掌握，以及對結構-性能關系的理解，通過模塊二的訓練，學習如何合成、表征一個原位熒光成像探針，研究其響應性能并驗證其內在響應機理，從而對分子結構設計和性能研究有了更深層次的理解，該模塊也是本虛擬仿真實驗的核心部分。

3.3 模塊三：原位熒光成像與導航手術切除腫瘤

獲得性能優(yōu)異的熒光成像探針HYPQG后，還要進一步研究其在細胞和活體層面的熒光成像性能，以及在腫瘤切除手術導航中的應用(圖8)。該模塊細胞層次的虛擬仿真實驗涉及到細胞培養(yǎng)、細胞活性測試、共聚焦熒光成像、細胞共定位實驗、細胞Z-軸掃描和3D重建、細胞膜長時間原位成像等研究?；铙w層次的實驗涉及小鼠腫瘤的長時間原位GGT成像、小鼠體內腫瘤切除和模擬人體內腫瘤切除實驗。該模塊設計了交互操作(29)-(37)，賦分30分。

圖8 模塊三原位熒光成像與活體導航手術切除腫瘤實驗示意圖

實驗完成后，實驗結果、成績能夠自動上傳至平臺，學生可以根據(jù)課程要求在線填寫實驗報告。

4 線上線下混合式教學設計與實施

本實驗采用三維虛擬仿真方式實現(xiàn)實驗過程全景漫游與動態(tài)實時交互設計，學生通過授權ID登錄使用本虛擬仿真實驗系統(tǒng)，不受時間空間限制，實驗中學習模式與考核模式可以無縫切換，為多樣化的教學方式提供了可行性。

課中通過互動了解學生對課前布置的調研問題的思考，針對實驗的核心原理邊演示邊講解，先引導學生對實驗設計有一個整體思路的理解，認識到固態(tài)發(fā)光熒光探針設計在活體原位精準成像和手術導航應用中的重要科學意義。再結合三大模塊的重難點問題，如HPQ染料固態(tài)發(fā)光和沉淀的機理是什么？分子結構設計中的官能團效應影響，結構表征與性能表征中譜圖如何分析？探針具備好的光譜性能后如何走向細胞和活體應用？同時對學生預習過程涉及的實驗操作問題進行答疑。線下課堂在虛擬仿真實驗中心機房進行，講解答疑完畢再進行線上虛擬仿真實驗的操作練習以及操作考核。學生操作中遇到問題既可以請教老師，也可以切換成學習模式，自主學習后再返回考核模式。但該過程系統(tǒng)會自動記錄，切換累積到一定次數(shù)時，系統(tǒng)會自動扣分。實驗后再進一步對實驗中的問題進行交流討論。

實驗過程中通過三大模塊17個步驟的37步交互式操作，引導學生通過探究找到分子結構與光譜性質、成像性能之間的關系，理解如何獲得一個高性能的分子成像工具。

在模塊一中，以虛擬動畫演示傳統(tǒng)膜定位探針與固態(tài)發(fā)光原位熒光探針的區(qū)別，首先形成對原位成像探針的直觀理解。再通過動手操作在HPQ染料中引入不同取代基獲得19個不同類型的衍生化合物，每個化合物的熒光光譜和溶解性質都可以查看，學生通過結構與性質的比較，從中選擇出性質最優(yōu)的HPYQ，對構效關系有了初步理解。再進一步引入谷氨酸基團，提高探針的生物相容性，得到HYPQG探針。

在模塊二中，學生重點練習原位熒光成像探針的合成與性質測試。首先進行實驗中常用工具的熟悉和認知，再進行實驗裝置的搭建和相關化合物的合成、純化和初步表征，在此基礎上進行單晶結構解析。在加樣、裝置搭建順序、溶劑選擇等步驟均設置互動，讓學生了解每個實驗操作需要注意的關鍵點。通過實驗，學生對HYPQG探針的合成路線、合成方法、純化方式、結構表征手段有了直觀的理解。合成獲得所需探針后，能否進一步用于原位熒光成像，還需要對探針的親脂性、穩(wěn)定性、抗擴散性質、響應性能、抗干擾能力等進行測試，在模塊二的性質測試中，設計了相應的實驗，讓學生深入理解，如何設計對照實驗，選擇合適的對照探針來驗證探針的響應性能，并進一步理解分子結構與光譜性質之間的關系。

在模塊三中，學生重點探索HYPQG探針在細胞和活體原位熒光成像及導航手術切除腫瘤中的應用，該實驗側重生物醫(yī)學實驗和熒光成像實驗操作的訓練。合成的探針能否用于生物體系原位成像和手術導航，還需要進行細胞膜表面原位成像、抗擴散性能比較、長時間原位成像研究，然后才能進行小鼠等活體原位成像和成像指導的腫瘤切除實驗。學生通過這些實驗的操作，不僅對原位精準生物成像有了直觀理解，還從生物醫(yī)學應用的角度對分子結構與成像性能關系有了深入認識。

虛擬仿真實驗完畢后，一周內在線提交實驗報告，由于該系統(tǒng)有詳細的實驗過程和打分記錄，對學生實驗報告的要求進行了改革。針對三個模塊分別設計了5個拓展思考問題，學生對每個模塊任選2個問題來填寫實驗報告。設計的問題都需要結合實驗數(shù)據(jù)分析和思考歸納才能回答，如“要想獲得高性能的NIR沉淀型HPQ類固態(tài)熒光染料，有哪些重要的設計原則需要考慮？”“如何判斷設計的探針HYPQG對GGT能夠選擇性響應？需要設計什么實驗驗證？”“HYPQG與市售L-谷氨酸γ-(7-氨基-4-甲基香豆素) (AMCG)探針、以及細胞膜示蹤紅色探針Memb-Tracker Red的比較實驗能夠說明什么問題？可對你探索的這幾個實驗獲得的成像圖進行分析”。學生在實驗后結合拓展思考題，對三大模塊虛擬仿真實驗探究中的結果進行反思，從設計原則、光譜性質特點、驗證性實驗設計、譜圖區(qū)別、結構與光譜及成像性能關系等方面總結內在規(guī)律。

通過課前、課中、課后教學環(huán)節(jié)設計，以及線上線下混合式教學，學生在充分的交互操作體驗中，能夠從分子水平理解結構和譜學特征、響應性能的內在關系，加強對設計高性能分子成像工具創(chuàng)新思路的理解。同時在課后，感興趣的同學還可以借助實驗進行進一步的拓展研究，如進入分子成像實驗室了解該方向的最新進展，參與相關科研訓練等。本實驗總成績構成中，考勤和預習測試占20%，實驗操作考核占70%，在線實驗報告占10%，虛擬實驗的各個環(huán)節(jié)在總成績中均有體現(xiàn)。

5 本虛擬仿真實驗的特色與創(chuàng)新

5.1 以學生核心能力培養(yǎng)為中心進行虛擬仿真實驗的設計

本虛擬仿真實驗將最新科研成果轉化為實驗教學內容，為學生提供與原位熒光標記探針設計篩選的核心過程進行全面交互的機會。

學生在本科學習中，使用單晶衍射儀、熒光共聚焦顯微鏡、質譜等高端儀器的機會少，將這些大型精密儀器轉換為虛擬仿真的形式，不僅實驗安全系數(shù)大大提高，學生能夠直觀了解和動手操作的機會大大增加。實際科研實驗周期長、成本高、消耗大，而且涉及大量細胞、活體實驗和生物成像，需要豐富的經驗才能完成，無法引入本科教學，而本虛擬仿真實驗對科研實驗的內容進行優(yōu)化重組，圍繞探針設計、合成與性能測試、成像與手術導航構建了三大模塊，每個模塊相對獨立又互為一體，使學生能夠循序漸進地理解科研實驗的原理與分子設計，合成表征與構效關系，原位成像與生物醫(yī)學應用。

在虛擬仿真實驗各模塊的設計中也體現(xiàn)了以學生為中心的理念，虛擬場景設計形象、生動、直觀，圍繞核心能力培養(yǎng)，設計了37步可交互操作的步驟，讓學生身臨其境地體會高性能分子工具的結構設計、合成、優(yōu)化和篩選過程，掌握結構解析與表征方法，探究結構與光物理化學性質之間的密切關系，了解其在細胞和活體腫瘤成像和手術導航中的應用潛力。通過深入探究，對腫瘤原位熒光標記技術達到深層次理解，逐步形成高性能化學成像分子工具設計的思路，加強了動手能力、高階思維和創(chuàng)新能力的培養(yǎng)。

本虛擬仿真實驗能夠服務于化學化工本科生的“知識、素質、能力”培養(yǎng)，極大地拓展了基礎實驗教學的深度和廣度，2021年獲評湖南省虛擬仿真實驗教學一流本科課程。

5.2 基于重要科學問題的探究式教學和育人元素融入

本虛擬仿真實驗的教學中采用基于重要科學問題的探究式教學。課前引導學生調研發(fā)現(xiàn)腫瘤手術切除中存在的問題，認識到精準標記與成像導航的重要性，并在線上觀看實驗指導相關視頻，完成預習練習題。課中引導學生發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有熒光成像技術的問題，了解如何以重要科學問題為導向進行分子結構設計，并依據(jù)響應性能優(yōu)化結構設計，解決細胞和活體原位熒光成像中的科學問題，實現(xiàn)腫瘤手術導航的應用。在三大模塊學習中借助插入性問題引導學生思考，同時完成虛擬仿真實驗的考核，在實驗結束后的報告填寫中，結合6個思考題的回答來引導學生課后的拓展思考。通過課前預習練習、實驗考核和問題回答，可以了解學生虛擬仿真實驗的操作技能和對科學問題的思考情況。

在教學中注重科學素養(yǎng)和科研價值觀的培養(yǎng)。在實驗原理的探究中，結合惡性腫瘤的精準診斷與治療這一面向國家重大需求和人民健康的科學問題，從減輕患者痛苦的角度考慮如何對分析方法進行改進與創(chuàng)新。通過虛擬仿真實驗探索，了解如何通過分子水平的結構設計賦予探針精準原位標記新功能，實現(xiàn)腫瘤邊界的精確界定，為精準診療提供研究工具。在37步交互操作細節(jié)中培養(yǎng)嚴謹?shù)目茖W態(tài)度和分析解決問題的科學探究精神。通過該虛擬仿真實驗的探究，理解科研如何面向國家需求，服務人民健康來解決科學難題，理解“精準”中蘊含的“求真”“求實”和“求新”思想，進一步實現(xiàn)科研價值觀的積極引導。