儀器分析課程中綠色度概念的引入

張紅醫(yī)，何珺瑤，石志紅,2

1 河北大學化學與環(huán)境科學學院，河北 保定 071002

2 河北大學化學教學研究所，河北 保定 071002

1 前言

在分析化學各版本教科書上[1-5]，我們很容易找到從功能性角度對分析方法進行評價的指標，諸如精密度、準確度、靈敏度、檢出限和定量限等。在分析化學相關學術期刊中，由這些基本概念延伸而來的評價指標更是隨處可見，例如，以日內(nèi)精密度[6]和日間精密度[6]等來表征分析方法的精密度；以加標回收率[7]來表征分析方法的準確度。這些功能性評價指標極大地推動了人們?nèi)ヌ剿骱徒⒏€(wěn)定、更可靠、更靈敏的分析方法。

近年來隨著綠色化學[8]、綠色分析化學[9]和綠色液相色譜[10]等理念逐漸興起，對分析方法的評價在原有功能性評價指標的基礎上，又增加了綠色度的評價指標[11]。然而現(xiàn)在的分析化學教材中還沒有綠色度的概念。分析化學教材承載著培養(yǎng)未來化學工作者的重任，綠色化學思想理應在分析化學教材中有所體現(xiàn)。為此，我們嘗試著在儀器分析課程的色譜分析部分，對綠色分析化學、綠色液相色譜等進行了簡單介紹，并引入了兩種可對液相色譜綠色度進行定量評價的方法。為了引起教學同行對綠色度概念的重視，讓綠色度概念盡早進入教材、進入課堂，被更多的學生(未來的化學工作者)掌握和運用，特將我們的做法呈現(xiàn)給大家。

2 綠色度引入到儀器分析課程的步驟

通過以下幾個主要步驟將綠色度計算的兩種方法引入到儀器分析課堂中(共51學時)，在色譜分析部分占用2個學時進行講述。

第一步，闡述綠色度引入到儀器分析課程中的重要意義。通過文獻調(diào)研的方法讓學生認識到發(fā)展綠色分析化學的必要性和重要性，強調(diào)綠色分析化學研究與國家發(fā)展及分析化學學科發(fā)展間的一致性。

第二步，簡要講解綠色化學、綠色分析化學和綠色液相色譜的發(fā)展脈絡，并提供原文獻供學生課下進一步學習。

第三步，向?qū)W生提出問題：綠色化學和綠色分析化學還只是停留在理念上嗎？難道它不可以進行定量量度嗎？由于分析對象和分析方法的多樣性，樣品基質(zhì)的復雜性，以及對分析方法的特殊要求(準確度、精密度和檢出限等)，因此在綠色化學視閾下對分析方法進行全面的評價并不是一件容易的事情。因此，適于各類分析手段綠色度評價的方法還不多。綠色度研究的初期，僅能提供定性的評價結(jié)果，其中較有代表性的是National Environmental Methods Index (NEMI)[12]。這種方法用象限圖表征綠色度，四個象限分別代表分析方法所用溶劑和產(chǎn)生廢物的四個性質(zhì)：1) PBT (表示持久性、生物累積性和毒性)；2) 危害性；3) 腐蝕性(pH ＞ 12或pH ＜ 2)；4) 廢物的體積或質(zhì)量(是否大于50 mL或50 g)。NEMI價方法可以直接給出各種分析方法綠色度的圖像，非常形象和直觀。但這種方法只能提供綠色度的定性比較，不能給出綠色度的定量結(jié)果。針對分離氨氯地平、阿托伐他汀、瓜林多普利和吲達帕胺等藥物的8種液相色譜分析方法，文獻[11]用NEMI方法以象限圖的方式直觀顯示了不同方法的綠色度。作為一個選作的作業(yè)，我們也鼓勵學生模仿文獻[11]的做法，通過文獻調(diào)研查找水樣中氨基甲酸酯的測定方法(我校自編教材的實驗內(nèi)容)，并用NEMI方法以象限圖方式比較我們實驗方法和文獻方法的綠色度。在初期的綠色度定性評價的基礎上，近年來又出現(xiàn)了綠色度的定量評價方法。

第四步，講述HPLC-EAT[13]和CHEMS-1[14]法的基本原理，以及HPLC-EAT軟件的安裝與使用。

第五步，為了練習使用HPLC-EAT和CHEMS-1法，首先指導學生結(jié)組合作查閱一些關于液相色譜實驗的SCI文獻；然后引導學生快速找到文獻中有關液相色譜流動相組成和比例、流速等信息，并將這些信息制作成表格以便計算時引用；最后，用兩種方法分別計算液相色譜方法的綠色度。

第六步，對兩種方法綠色度計算結(jié)果進行比較和分析。

3 綠色度引入課程的意義

發(fā)展綠色分析化學是相關從業(yè)者的社會責任。與化學其他專業(yè)實驗室相比，分析化學實驗室給人的第一印象是干凈，因此有些學生會錯誤地認為沒有必要發(fā)展綠色化學。為此，我們通過文獻數(shù)據(jù)來證明這種觀點的錯誤性。眾所周知，氣相色譜的分析對象一般只限于低沸點化合物，約占有機物總量的20%，而占有機物總數(shù)近80%的高沸點及熱不穩(wěn)定性物質(zhì)普遍要采用液相色譜進行分析[15]。由此可見液相色譜在色譜分析中的重要地位和作用。然而，液相色譜在運行中會產(chǎn)生很多有毒有害的有機物廢液。根據(jù)Welch等人的測算[16]，一臺配備了傳統(tǒng)尺寸色譜柱的傳統(tǒng)液相色譜儀器每天至少產(chǎn)生1 L的廢液。如果按照全世界擁有13萬臺液相色譜儀來估算，那么全世界每年將因液相色譜的運行至少要產(chǎn)生3.4 × 107L化學廢液。

發(fā)展綠色分析化學工作符合我國的發(fā)展理念。將綠色度引入到儀器分析課程中，不僅可達成課程專業(yè)目標，還能在一定程度上達成德育目標，實現(xiàn)知識傳播與育人培養(yǎng)有機結(jié)合。早在2002年Science[17]上就刊文“Green Chemistry: Science and Politics of Change”，對綠色化學研究給予了高度肯定。綠色化學[8]和綠色分析化學[9]的研究，已經(jīng)成為世界化學研究的潮流和重要方向之一。在我國的五大發(fā)展理念(“創(chuàng)新、協(xié)調(diào)、綠色、開放、共享”)中，“綠色”發(fā)展的理念占有重要地位。實現(xiàn)綠色生態(tài)文明是我國“五位一體”總體布局的重要方面，是新時代中國特色社會主義思想的重要組成部分。

4 綠色度的兩種評價方法

蔡衛(wèi)權(quán)等[18]對綠色化學原則的發(fā)展進行了綜述。從源頭上減少或消除化學污染是綠色化學的理想，而綠色化學原則是對綠色化學內(nèi)涵最好的詮釋。自Anastas等在1998年提出12條綠色化學原則以來，Anastas本人和Winterton又從技術、經(jīng)濟和商業(yè)等角度出發(fā)，分別提出了另外12條綠色化學補充原則[17]。近年來，綠色化學[8]、綠色分析化學[9]和綠色液相色譜[10]的研究工作越來越多。那么一個化學過程的綠色度到底能不能量度呢？回答當然是肯定的。例如，美國綠色化學研究所運用Green Profile對環(huán)境分析方法進行綠色化學評價，但這種方法只能實現(xiàn)半定量評價[19]。Eissen等人提出了用于有機合成的環(huán)境評價工具(Environmental Assessment Tool for Organic Syntheses，EATOS)[20]。接下來我們介紹兩個液相色譜綠色度表征的方法：HPLC-EAT[13]和改進的CHEMS-1[14]。

4.1 HPLC-EAT

HPLC-EAT[13]是一款由瑞典隆德大學Gaber團隊開發(fā)的免費的軟件，軟件和使用手冊可以從網(wǎng)頁[21]的右側(cè)區(qū)域免費下載。軟件名稱中的EAT是環(huán)境評價工具的英文縮寫(Environmental Assessment Tool)。該軟件通過統(tǒng)籌考慮液相色譜方法對環(huán)境E、健康H和安全S的影響來實現(xiàn)方法綠色度的評價。EAT的計算原理如下：

式中下角標的數(shù)字表示所使用溶劑的編號；m代表各溶劑的質(zhì)量；S、H和E分別是安全因子、健康因子和環(huán)境因子，它們?nèi)∽杂贙oller等人所建立的EHS法[22]。HPLC-EAT方法可對樣品前處理、液相色譜等度洗脫、梯度洗脫等方面進行定量評價。圖1為該軟件的截圖。軟件提供了13種可作流動相的有機溶劑。對于前處理步驟需要選擇溶劑、填寫使用溶劑的量；對于液相色譜等度洗脫方式，需要輸入流動相的組成、流速和運行時間等實驗數(shù)據(jù)；對于液相色譜梯度洗脫方式，需要填寫梯度程序和運行時間等數(shù)據(jù)。運行結(jié)果可通過柱狀圖和數(shù)據(jù)表的形式展現(xiàn)出來。HPLC-EAT值越低則表示方法的綠色度高；反之，其值越高則表示方法的綠色度越差。為了強調(diào)有機溶劑的影響，該軟件將作為流動相組成部分的純水、改性劑和緩沖溶液等的E、H和S當做0來處理。

圖1 HPLC-EAT軟件的主界面

4.2 改進的CHEMS-1

CHEMS-1模型是由Swanson等人[23]于1997年提出的，主要用于工業(yè)中化學品的風險評價。總危害評價的算法是毒性相關的危害值之和與暴露相關參數(shù)值之和的乘積：

式中tHV為總危害值；HVORAL為口服毒性危害值；HVINH為吸入毒性危害值；HVCAR為致癌性危害值；HVHE為其他危害效應值；HVFA為水生動物急性毒性危害值；HVFC為水生動物慢性毒性危害值；HVBOD為生物降解能力參數(shù)；HVHYD為水解參數(shù)；HVBCF為生物濃縮參數(shù)。評價所需的毒理學和生態(tài)毒理學的數(shù)據(jù)取自于化學品安全技術說明書(MSDS)，并經(jīng)過轉(zhuǎn)化和權(quán)重相似度的處理。

為了將CHEMS-1模型用于評價分析化學實驗室的溶劑，2015年Tobiszewski等人[14]在原有模型計算方法的基礎上進行了兩點改進(一是引入了揮發(fā)性參數(shù)HVVOL，二是假設各危害是同等重要，因而忽略了權(quán)重的影響)，提出了總分析危害值taHV，具體計算如下：

式中HVVOL為揮發(fā)性參數(shù)，且規(guī)定HVVOL按照三種方式賦值：

為了接下來使用改進的CHEMS-1模型做進一步的計算，將計算出的分析實驗中常用的有機溶劑的tHV和taHV列于表1。

表1 常用試劑的總危害值(tHV)和總分析危害值(taHV) [14]

過程危害值pHV是評價總分析過程的危害得分，計算如下：

式中vtaHV1表示第1種溶劑的taHV (可從表1中獲得)與其消耗體積(mL)的乘積；vtaHV2為第2種溶劑的taHV (可從表1中獲得)與其消耗體積(mL)的乘積；vtaHVn為第n種溶劑的taHV (可從表1中獲得)與其消耗體積(mL)的乘積。pHV值的大小代表著化學過程的綠色度。pHV值越大過程的綠色度越差，反之則越好。

5 兩種綠色度表征方法的運用

5.1 高效液相色譜實驗的幾個實例

為了運用上述兩種方法進行綠色度的計算，從文獻中任意選擇了六個液相色譜實驗，將它們分別編號為I-VI，并將其流動相組成、流動相的消耗、梯度次數(shù)、流動相流速、運行時間以及參考文獻序號等信息列于表2。為了達到以下三個目的，本文從SCI文獻中任意選取了六個液相色譜實驗方法，當然它們可以換成其他任何液相色譜實驗方法，只不過為了達到下面第三條目標，選取的色譜實驗方法數(shù)量最好大于6個。第一，可作為綠色度計算的例題，便于讀者檢查自己是否掌握了綠色度計算方法。第二，說明兩種計算方法得出的綠色度數(shù)值存在較大的差異，因此在報告方法的綠色度時需要指明所采用的計算方法。第三，盡管兩種計算方法綠色度數(shù)值存在較大差異，但它們所給出的對應液相色譜方法綠色度順序卻是完全相同的，更重要的是兩者的綠色度數(shù)值間存在明顯的線性相關性，所以說兩種方法在揭示綠色度大小方面都具有同等的量度效果。

表2 幾個液相色譜實例中的溶劑消耗、梯度數(shù)目、流速和運行時間

5.2 計算結(jié)果的比較

表2的最后兩列為HPLC-EAT和CHEMS-1兩種方法計算所得的綠色度。單純從數(shù)值上進行比較，兩種方法計算出來的綠色度數(shù)值存在較大的差異性，但如果觀察它們計算結(jié)果的趨勢就會看出：HPLC-EAT法得到的較大數(shù)值，對應著CHEMS-1法得到較大的數(shù)值；反之亦然。圖2是兩種方法相關性的重要證據(jù)，其中橫坐標為CHEMS-1法計算的綠色度值，縱坐標為HPLC-EAT法計算的綠色度值。線性方程為y= (1.315 ± 10.83) + (0.1236 ± 0.01403)x，r2= 0.9508，表明兩種方法計算出的綠色度有較好的相關性。

圖2 兩種方法(HPLC-EAT和CHEMS-1)綠色度計算結(jié)果的相關性

HPLC-EAT綠色度的計算是通過軟件來完成。運行時只需要將流動相的組成、梯度程序和流速等信息輸入到軟件中就可算出對應的綠色度數(shù)值。這種方法具有計算快、計算過程簡單的優(yōu)點，但因為這種方法主要解決的是液相色譜方法綠色度評價的問題，可供選擇的溶劑只有13種：丙酮、乙腈、氯仿、二氯甲烷、乙醇、乙酸乙酯、己烷、辛烷、異丙醇、甲醇、硫酸96%、叔丁基甲基醚、四氫呋喃。如果使用了它所提供的溶劑庫之外的其他溶劑，這種方法就不能用于綠色度的計算了。

改進的CHEMS-1法[14]對分析方法綠色度的計算，實際上是通過式(7)計算過程危害值pHV來完成的。pHV由各溶劑的vtaHV加和而成，而vtaHV值是由查表1獲得的taHV與所消耗的該溶劑體積之積而求得。taHV是在改進原始的CHEMS-1法tHV基礎上而由Tobiszewski等人[14]提出的，具體計算詳見式(3)。表1列出了一些常用溶劑的taHV和tHV數(shù)據(jù)，便于以后查閱和計算使用。對于表1中沒有包含的溶劑，也可通過式(3)自行計算。因此，改進的CHEMS-1法計算綠色度(pHV)時，是需要查表手動計算的，但該方法不需要固定溶劑庫的限制(只是為了計算方便，把一些常用試劑的tHV和taHV列于表1中)，有較廣泛的適用性和靈活性。它不僅可以對液相色譜過程綠色度進行計算，也可用于樣品預處理過程的綠色度計算。

6 綠色度在建立綠色色譜分析中的指導作用

綠色度的數(shù)值對于人們選擇、使用和建立更加綠色的色譜分析方法具有明確的指導意義。(1) 它有助于綠色洗脫溶劑的選擇。在所介紹的兩種綠色度計算方法中，實際上都是計算的綠色度的罰點，就是說計算數(shù)值越大，越遠離綠色的要求。這種罰點的計算均是根據(jù)試劑的各單項危害罰點值(例如HPLC-EAT法是從安全、健康和環(huán)境三個角度去考慮)與各試劑用量的乘積然后再求和。因此，為了建立更加綠色的液相色譜方法，應該盡可能選擇罰點值低的溶劑。例如，從表1中可以看到甲醇、乙醇和丙酮的taHV值分別為15.7、7.2和2.6，顯然如果單純從綠色度的角度出發(fā)，丙酮和乙醇做流動相成分會優(yōu)于甲醇，這也恰恰是近年來綠色液相色譜發(fā)展的一個方向[10]。(2) 減少分析時間和降低洗脫劑的用量。綠色度的罰點總和等于試劑的單項罰點與試劑用量的乘積再求和。試劑用量在罰點總和計算中起到了重要作用。為了降低綠色度的罰點總和，需要盡可能地降低溶劑的消耗量。近年來，UHPLC (ultra high performance liquid chromatography)已開始被廣泛使用，它不僅可以顯著縮短色譜分析時間，而且流動相的流速也由傳統(tǒng)HPLC的0.8-1.2 mL·min-1減少到0.3-0.6 mL·min-1，從而顯著降低了有機溶劑的用量，UHPLC發(fā)展已成為綠色液相色譜方法發(fā)展的一個重要標志[13]。(3) 采用更加綠色的樣品前處理方法。由前所述，選用綠色度罰點值低的溶劑和使用更少量有機溶劑，是綠色分析化學的要求。對于復雜樣品的色譜分析往往需要一定的前處理步驟。在傳統(tǒng)的樣品前處理中，往往使用大量的有機溶劑，這種做法不符合綠色分析化學的要求。為此，近年來發(fā)展了多種符合綠色分析化學要求且與后續(xù)液相色譜分析相適應的新型樣品前處理技術[30]，諸如：單滴微萃取、分散液-液微萃取、懸浮固化分散液-液微萃取等，在這些處理過程中有機溶劑的消耗由傳統(tǒng)方法的幾十mL降低到幾個μL。這些微萃取技術的發(fā)展和使用，有力地保證了綠色液相色譜分析的快速發(fā)展。

7 結(jié)語

我們嘗試著將兩個綠色度的定量計算方法(HPLC-EAT和改進的CHEM-1)引入到“儀器分析”課程的液相色譜分析部分中，綠色度的大小是選擇、使用和建立液相色譜方法時需要考慮的一個新評價指標，它強化了分析方法開發(fā)和使用中所應考慮和承擔的社會責任，綠色度的引入有助于學生從專業(yè)課程角度理解綠色發(fā)展的重要性。所介紹的兩種計算方法均出自于近年來的重要學術期刊(GreenChemistry、EcotoxicologyandEnvironmentalSafety)，計算方法易于掌握，為儀器分析課程增加了新的知識點。學生對增加的綠色度內(nèi)容，抱有較高的學習熱情，知識掌握情況較好，收到了良好的教學效果，達到了傳授知識和技能以及育人的目的。

經(jīng)過課上講解和課下的作業(yè)練習，聽課的43名學生都完全理解了發(fā)展綠色化學，特別是發(fā)展綠色液相色譜的重要性和必要性。全部同學都掌握了定量表征分析方法綠色度的原理，可以運用CHEMS-1法計算綠色度。對于NEMI和HPLC-EAT法表征和計算綠色度，只有約1/3的同學反饋了作業(yè)。盡管HPLC-EAT是一款免費的軟件，課上我們已經(jīng)把下載地址甚至軟件直接提供給學生。但由于軟件和網(wǎng)站均是英文的，普通大學的大學二年級學生對完全英文的內(nèi)容還存在一些閱讀障礙，不少同學存在畏難情緒，有大約1/3的同學直接放棄了嘗試。約2/3的學生積極嘗試并安裝了HPLC-EAT軟件，但由于該軟件需要在Java環(huán)境下運行。該軟件建議下載的Java版本與學生計算機win10系統(tǒng)之間存在一些沖突，導致軟件不能正常運行，一些同學經(jīng)過幾次失敗的試運行后，也選擇了放棄。這樣最終掌握HPLC-EAT法計算綠色度的學生約占全班人數(shù)的1/3。教學實踐表明，相比于HPLC-EAT法和NEMI法，CHEMS-1法更易于學生掌握。