水中構(gòu)筑物表面生物膜形成物理化學(xué)過(guò)程*

申鍇 高飛 黃須強(qiáng) 盧小鵬 周慧敏 李衛(wèi)榮 鐵鏑**

（1）大連交通大學(xué)，連續(xù)擠壓教育部工程研究中心，大連 116028；2）東北大學(xué)，材料科學(xué)與工程學(xué)院，沈陽(yáng) 110819）

水系統(tǒng)中的罐體、管道、過(guò)濾裝置等構(gòu)筑物，長(zhǎng)時(shí)間使用后微生物附著在設(shè)備表面或內(nèi)壁，容易形成生物膜，生物膜會(huì)加速構(gòu)筑物的腐蝕并可能造成水體二次污染，進(jìn)而影響到水系統(tǒng)生態(tài)平衡和人類的日常生活。水中有機(jī)和無(wú)機(jī)化合物吸附在構(gòu)筑物表面形成薄膜，為細(xì)菌、原生動(dòng)物、真菌和放線菌、藻類等微生物的附著提供了條件，其中單細(xì)胞細(xì)菌黏附在表面是形成生物膜的第一步，也是最關(guān)鍵的一步。

在自然環(huán)境中，細(xì)菌生長(zhǎng)的主要模式是附著在表面形成生物膜［1］，生物膜是一種結(jié)構(gòu)化的群落，由細(xì)菌和胞外多聚物共同組成［2］。關(guān)于生物膜發(fā)育周期的探索起源于對(duì)銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）在表面附著行為的研究，發(fā)現(xiàn)了生物膜發(fā)育過(guò)程是一個(gè)有序的、高度調(diào)節(jié)的過(guò)程［3-4］。本文在現(xiàn)有研究的基礎(chǔ)上，將水中構(gòu)筑物表面生物膜發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期分為5個(gè)階段（圖1）：薄膜形成、細(xì)菌黏附、胞外聚合物（extracellular polymeric substances，EPSs）產(chǎn)生、群體感應(yīng)（quorum sensing，QS）調(diào)節(jié)、生物膜成熟，每個(gè)發(fā)育階段對(duì)應(yīng)于蛋白質(zhì)產(chǎn)生和基因表達(dá)的獨(dú)特模式。本文將比較研究生物膜形成的不同階段所涉及的物理化學(xué)過(guò)程的最新研究進(jìn)展，闡明水中構(gòu)筑物表面生物膜的形成機(jī)理和影響因素，為后續(xù)生物膜的控制和清除策略提供指導(dǎo)。

Fig. 1 Schematic diagram of the biofilm formation process［5］圖1 生物膜形成過(guò)程示意圖［5］

1 薄膜形成階段

1.1 表面薄膜的形成

在20世紀(jì)70年代就有報(bào)道稱溶解性和膠體性有機(jī)物在與自然水接觸的表面吸附并形成薄膜，這種薄膜的厚度為納米級(jí)別［6］。近年來(lái)的研究表明，吸附在表面的化合物分子主要是水生生物代謝活動(dòng)的產(chǎn)物，包括如糖蛋白、脂類、核酸、離子、多糖、蛋白質(zhì)等有機(jī)化合物、芳香族氨基酸、腐殖質(zhì)物質(zhì)和如糖醛酸、丙酮酸、硫酸鹽、胞外多糖等可吸收的碳水化合物［7］。由于化合物分子的來(lái)源、水域和季節(jié)等環(huán)境因素的不同，薄膜的組成及其化學(xué)特征千差萬(wàn)別［8］。

在水環(huán)境中，化合物分子在表面沉降形成薄膜是生物膜形成的第一步［9］。薄膜通過(guò)改變電荷、電位和表面張力來(lái)改變表面的理化性質(zhì)，這些表面屬性的不規(guī)則變化導(dǎo)致局部黏附效率的變化，進(jìn)而影響細(xì)菌與表面的黏附［10］。

1.2 薄膜對(duì)細(xì)菌黏附的影響

薄膜對(duì)細(xì)菌黏附的影響具有兩面性。首先，表面吸附的化合物薄膜可能支持黏合劑的形成，從而增強(qiáng)細(xì)菌黏附力。Lorite等［10-11］通過(guò)研究苛養(yǎng)木桿菌（Xylella fastidiosa）對(duì)非生物表面的黏附性表明，調(diào)節(jié)膜中存在的特定磷酸鹽基團(tuán)可以影響表面黏附過(guò)程和生物膜的發(fā)育，不僅可以促進(jìn)表面-細(xì)菌相互作用，還可以作為細(xì)菌細(xì)胞信號(hào)通路的調(diào)節(jié)因子，并進(jìn)一步證明了調(diào)節(jié)膜是降低硅和玻璃表面親水性和玻璃粗糙度的主要原因；Wolfe等［12］證明，磷酸乙酰基的存在可以作為一個(gè)信號(hào)，使生物膜形成中細(xì)菌可逆黏附與不可逆黏附之間進(jìn)行有序切換。

相反的，細(xì)菌群落中自然產(chǎn)生的非抗生素分子，包括分泌信號(hào)分子或表面活躍的生物表面活性劑，也可能干擾生物膜的形成，調(diào)節(jié)微生物與界面的相互作用。Valle等［11］研究表明，大腸桿菌分泌的ⅠⅠ型莢膜由高分子質(zhì)量和帶負(fù)電荷的多糖聚合物組成，可以通過(guò)削弱初始細(xì)菌-表面相互作用和減少細(xì)菌-細(xì)菌的相互作用來(lái)干擾和抑制生物膜的形成。并證明了用ⅠⅠ型莢膜多糖處理非生物表面會(huì)持久地影響表面的分子間作用力，可以顯著抑制并阻止革蘭氏陽(yáng)性（Gram-positive）和革蘭氏陰性（Gram-negative）細(xì)菌形成生物膜。

此外，有研究表明，具有界面活性的兩親性分子——鼠李糖脂（Rhamnolipids），對(duì)細(xì)菌黏附和生物膜形成的影響取決于其分子濃度。鼠李糖脂是主要由銅綠假單胞菌產(chǎn)生的具有表面活性的細(xì)胞外次生代謝產(chǎn)物，鼠李糖脂具有改變細(xì)胞與表面和細(xì)胞與細(xì)胞相互作用的能力，鼠李糖脂的濃度不同，結(jié)果可能不同［13］。Raya等［14］表明，低濃度鼠李糖脂通過(guò)導(dǎo)致細(xì)胞表面釋放脂多糖從而增加細(xì)胞疏水性來(lái)影響細(xì)胞表面特性，從而增加細(xì)胞最初附著在表面的親和力。Davey等［15］認(rèn)為鼠李糖脂可作為抗黏合劑和破壞劑，如過(guò)量生產(chǎn)會(huì)抑制生物膜的發(fā)育，以對(duì)抗由幾種細(xì)菌和真菌形成的生物膜。

2 細(xì)菌黏附階段

2.1 細(xì)菌黏附過(guò)程

細(xì)菌需要主動(dòng)或被動(dòng)接近物體表面才能開始附著，有鞭毛的細(xì)菌可以利用基于鞭毛的運(yùn)動(dòng)，對(duì)化學(xué)信號(hào)、光、溫度、磁場(chǎng)和氧等環(huán)境線索作出反應(yīng)，主動(dòng)向表面方向游去［16］，而有些不運(yùn)動(dòng)的細(xì)菌通過(guò)液體流動(dòng)、布朗運(yùn)動(dòng)、重力等被動(dòng)運(yùn)輸靠近表面［17-18］。相比之下，主動(dòng)運(yùn)動(dòng)是到達(dá)表面的最有效的方法。如圖2所示，當(dāng)細(xì)菌向表面靠近時(shí)，在范德華力、布朗運(yùn)動(dòng)和靜電力等非特定力作用下首先發(fā)生可逆黏附［19］，細(xì)菌通過(guò)感知與表面的接觸及時(shí)調(diào)整蛋白質(zhì)、聚合物刷層和胞外多糖等疏水成分的表達(dá)，從而促進(jìn)穩(wěn)定的細(xì)菌-表面相互作用［20］，一旦細(xì)菌足夠接近表面（<1 nm），黏附素和細(xì)菌的鞭毛、菌毛等可以與固體表面相互作用，并在黏附中起直接或間接的作用，最終實(shí)現(xiàn)從可逆黏附到不可逆黏附的過(guò)渡。在發(fā)生不可逆黏附后，來(lái)自基底表面的黏附力引起細(xì)菌細(xì)胞壁的納米級(jí)變形，直到細(xì)胞壁的剛性肽聚糖層的彈性和細(xì)胞質(zhì)的胞內(nèi)壓力產(chǎn)生的反作用力達(dá)到平衡。細(xì)胞壁變形不僅增加了與基底表面的接觸面積，呈現(xiàn)出另一種物理化學(xué)鍵強(qiáng)化機(jī)制，而且還伴隨著膜表面張力的變化［21］。

Fig. 2 Schematic diagram of single cell attachment process［22］圖2 單細(xì)胞附著過(guò)程示意圖［22］

在細(xì)菌黏附過(guò)程中，細(xì)菌-表面界面存在復(fù)雜的細(xì)胞外電子轉(zhuǎn)移（extracellular electron transfer，EET），近年來(lái)，人們對(duì)其轉(zhuǎn)移機(jī)制和有效調(diào)控進(jìn)行了探索。Zhang等［23］通過(guò)模擬電活性細(xì)菌在各種代謝條件下的黏附行為，建立了細(xì)菌黏附力與電場(chǎng)強(qiáng)度之間的非線性模型，證明了電活性細(xì)菌（electroactive bacteria，EAB）在代謝過(guò)程中可以通過(guò)EET與細(xì)胞外環(huán)境交換電子，為利用表面電位和電子流動(dòng)方向及通量精確調(diào)節(jié)細(xì)菌黏附力提供了理論基礎(chǔ)。Logan等［24］探討了細(xì)胞外電子傳遞的潛在原因主要包括細(xì)胞呼吸使用固體金屬氧化物和可能作用于細(xì)胞與細(xì)胞間通信。Gong等［25］指出電活性細(xì)菌可以進(jìn)行雙向的EET，與細(xì)胞外環(huán)境交換電子和能量。此外，一些學(xué)者致力于從細(xì)菌到表面的EET改進(jìn)策略的研究：Apetrei等［26］使用導(dǎo)電聚合物聚吡咯（polypyrrole，Ppy）修飾真菌細(xì)胞來(lái)改善真菌細(xì)胞膜和/或細(xì)胞壁的電荷轉(zhuǎn)移；Wang等［27］通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明了用FeS2納米顆粒修飾的石墨烯陽(yáng)極不僅有利于電極表面的細(xì)菌黏附和電化學(xué)活性地桿菌（Geobacter）的富集，而且還促進(jìn)了高效的胞外電子轉(zhuǎn)移。

2.2 細(xì)菌黏附的影響因素

細(xì)菌黏附會(huì)受到表面特征與周圍環(huán)境的影響。首先，表面粗糙度或形貌的改變會(huì)極大地影響細(xì)菌的黏附和保留［28］，這是因?yàn)椴煌谋砻娼Y(jié)構(gòu)為附著提供了不同的表面積，從而使細(xì)菌與表面產(chǎn)生不同的黏附力。在最近的研究中，在納米尺度制備表面微結(jié)構(gòu)已被證明是提高材料抗菌性能的有效策略。Dauben等［29］通過(guò)控制納米接觸點(diǎn)密度，成功量化了金薄膜上的固定化金納米顆粒（Au nanoparticles，AuNPs）與白色念珠菌（Candida albicans）之間的黏附力，得出AuNP結(jié)構(gòu)表面被白色念珠菌附著所需的黏附力約為非結(jié)構(gòu)表面的10倍。Spengler等［30］將干凈的硅片在氟酸、過(guò)氧化氫和水的混合物中分別刻蝕90 s、180 s、360 s，并對(duì)蝕刻硅表面進(jìn)行單細(xì)胞力光譜測(cè)量，證明了金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）對(duì)納米結(jié)構(gòu)基底的黏附力隨著表面結(jié)構(gòu)尺寸的增大而減小。Doll等［31］使用電子束光刻技術(shù)在硅表面制造了包括空白硅在內(nèi)的4種表面微結(jié)構(gòu)，并驗(yàn)證了金黃色葡萄球菌和放線菌聚集桿菌（Aggregatibacter actinomycetemcomitans）在具有不同微結(jié)構(gòu)的硅表面的附著力不同。表面疏水性也被認(rèn)為是細(xì)菌黏附的決定因素，疏水相互作用可以促進(jìn)蛋白質(zhì)折疊和聚集、膜融合和細(xì)胞黏附［32］。根據(jù)Van Oss等［33］的研究可知，疏水相互作用通常是生物系統(tǒng)中所有長(zhǎng)程非共價(jià)相互作用中最強(qiáng)的，兩個(gè)非極性分子之間或一個(gè)非極性分子和一個(gè)極性分子之間的疏水引力被認(rèn)為是圍繞這些分子的水分子氫鍵釋能的結(jié)果。Sheng等［34］證明了金屬表面疏水性的降低削弱了細(xì)菌黏附。

環(huán)境pH值在細(xì)菌初始附著過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。研究表明，中性pH值有利于細(xì)菌生長(zhǎng)和生物膜的形成，過(guò)度酸性或堿性的pH值可降低表面疏水性，減緩生物膜形成速度［35］。Nguyen等［36］進(jìn)一步證明了生物膜生物量在pH為5.5~10的范圍內(nèi)波動(dòng)較大，在pH值為7.5~8.0的范圍時(shí)變得相對(duì)穩(wěn)定。之后的Moraes等［37］通過(guò)與酸性環(huán)境的對(duì)比，也得出形成生物膜的細(xì)菌更喜歡pH值在7.5~8.0的中性環(huán)境，中性環(huán)境中的菌株可以消耗更多的能量來(lái)促進(jìn)生物膜基質(zhì)的合成。此外，表面剪切應(yīng)力隨位置和流體流動(dòng)而不斷變化，也是影響細(xì)菌初始黏附的關(guān)鍵因素。剪切應(yīng)力的增加促進(jìn)了細(xì)菌黏附素表達(dá)［38］，黏附素進(jìn)一步推動(dòng)和鞏固浮游細(xì)菌的表面黏附過(guò)程，加速后期微菌落結(jié)構(gòu)的形成和穩(wěn)定［39］。

3 胞外聚合物膜階段

3.1 胞外聚合物的組成

在生物膜形成的過(guò)程中，細(xì)菌通過(guò)一個(gè)獨(dú)特的信息交流網(wǎng)來(lái)調(diào)節(jié)基質(zhì)內(nèi)黏附因子的相互聯(lián)系，最終形成一個(gè)復(fù)雜的三維塔狀生物膜結(jié)構(gòu)。一旦細(xì)菌在表面成功定植，細(xì)菌開始繁殖并分泌各種細(xì)胞外物質(zhì)包裹自己。研究表明，生物膜的胞外聚合物主要由胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）、胞外DNA（extracellular DNA，eDNA）、蛋白質(zhì)、脂類等復(fù)雜的生物分子混合物組成［40-41］，它們有促進(jìn)細(xì)胞互連、控制生物膜與表面的黏附、維持生物膜的機(jī)械穩(wěn)定性等功能［42］。

在生物膜的胞外聚合物中，EPS是生物膜中蛋白質(zhì)、脂類、核酸等其他物質(zhì)的黏附支架，也是生物膜最關(guān)鍵的組成部分，它由細(xì)菌在胞內(nèi)或胞外環(huán)境中合成并分泌到外部環(huán)境［43］。EPS的組成和結(jié)構(gòu)在不同的細(xì)菌群中也有很大的差異，比如銅綠假單胞菌EPS主要包括藻酸鹽、Pel和Psl。Pel和Psl也是成熟生物膜EPS的主要成分，在表面附著初始階段可以增加銅綠假單胞菌的黏附力［44］。eDNA是由細(xì)菌主動(dòng)凋亡或被動(dòng)自噬的方式產(chǎn)生的［45］，eDNA可以穩(wěn)定生物膜基質(zhì)，增強(qiáng)細(xì)菌之間的基因交換，甚至可能是促進(jìn)細(xì)菌基因突變的關(guān)鍵因素［46］。蛋白質(zhì)在生物膜形成過(guò)程中可以介導(dǎo)細(xì)菌黏附和信號(hào)通信，如金黃色葡萄球菌的表面蛋白Bap可構(gòu)建淀粉樣蛋白支架，使細(xì)菌穩(wěn)定積累［47］。一些細(xì)菌分泌淀粉樣卷曲蛋白，這種蛋白質(zhì)可以與eDNA結(jié)合，在生物膜內(nèi)形成堅(jiān)固的纖維狀聚合物［48］。磷脂可與肽聚糖共價(jià)偶聯(lián)形成墻磷壁酸（wall teichoic-acid，WTAs），通過(guò)與纖維連接蛋白或細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)合使細(xì)菌對(duì)表面的黏附力增強(qiáng)［5］。

3.2 胞外聚合物對(duì)生物膜形成的作用

液體環(huán)境中生物膜的形成與微表面特性有關(guān)，細(xì)菌表面EPSs中的部分官能團(tuán)可促進(jìn)細(xì)菌沉積并進(jìn)一步黏附在表面。在之前的研究中發(fā)現(xiàn)，去除EPSs后表面的黏附細(xì)菌減少了，且在相似的表面電荷條件下，富含EPSs的菌株比缺乏EPSs的菌株對(duì)細(xì)菌的黏附力更強(qiáng)。因此，EPSs對(duì)細(xì)菌-表面和細(xì)菌-細(xì)菌的黏附作用有助于生物膜的形成。為了證實(shí)這一結(jié)論，Harimawan等［49］通過(guò)對(duì)枯草芽孢桿菌和銅綠假單胞菌產(chǎn)生的EPSs的黏附性質(zhì)進(jìn)行比較，表明了多糖在EPSs層中的存在增加了其黏附強(qiáng)度，并且認(rèn)為蛋白質(zhì)對(duì)黏附影響較小。EPS中的外聚糖Psl（ePsl）是一種關(guān)鍵的生物膜基質(zhì)成分，可啟動(dòng)附著并保護(hù)生物膜內(nèi)的細(xì)菌，維持生物膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。Colvin等［50］和Jennings等［51］利用實(shí)驗(yàn)室常見的銅綠假單胞菌研究了Psl對(duì)生物膜發(fā)育的影響，表明Psl突變菌株會(huì)上調(diào)Pel多糖的表達(dá)，促進(jìn)生物膜完整發(fā)育。Wu等［52］研究了Psl蛋白PslA、PslD、PslG和PslE四種Psl蛋白之間的相互作用（圖3）， PslD是一種轉(zhuǎn)運(yùn)體，PslG分布在細(xì)胞內(nèi)膜和周質(zhì)，對(duì)Psl的生物合成至關(guān)重要，PslE可以與PslA、PslD或PslG相互作用。此外，EPSs中的凝集素樣序列（agglutinin-like sequence，Als）蛋白家族也是研究較多的一類調(diào)控細(xì)胞黏附作用的蛋白質(zhì)分子，為了研究Als蛋白在多大程度上介導(dǎo)整個(gè)細(xì)胞的黏附，Alsteens等［53］記錄了表達(dá)Als5p黏附蛋白的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）細(xì)胞與不同疏水基質(zhì)之間的多條力距曲線，證明了Als5p介導(dǎo)的黏附力隨著時(shí)間的推移而增強(qiáng)，從而促進(jìn)生物膜的形成。

Fig. 3 Interaction mechanism of Psl proteins［52］圖3 Psl蛋白相互作用機(jī)制［52］

EPSs的產(chǎn)生會(huì)受到環(huán)境溫度或額外碳源等因素的影響進(jìn)而改變生物膜的形成過(guò)程。溫度可以改變生物膜形成菌株的生理活性，可能會(huì)影響EPSs的產(chǎn)生和引起細(xì)菌表面電荷的變化已被Shen等［54］證明，Maurya等［55］在此基礎(chǔ)上指出菌株形成生物膜的最佳溫度在30~35℃范圍內(nèi)。額外的碳源反映了積累在生物膜外層的葡萄糖、果糖、甘露糖等代謝副產(chǎn)物的產(chǎn)生，此類碳源可以啟動(dòng)碳分解產(chǎn)物抑制（carbon catabolite repression，CCR）引導(dǎo)細(xì)菌優(yōu)先選擇最合適的碳源，從而促進(jìn)菌株的生長(zhǎng)［56］。Santos等［57］證明了額外碳源可以促進(jìn)微生物生長(zhǎng)；Boyd等［58］使用變形鏈球菌（Streptococcusmutans）在純鈦上培養(yǎng)形成生物膜，通過(guò)在培養(yǎng)基中添加不同濃度的蔗糖改變生長(zhǎng)條件，結(jié)果表明：當(dāng)蔗糖濃度為0~75 mmol/L時(shí)，生物膜-鈦的黏附強(qiáng)度隨蔗糖濃度的增加而增加，當(dāng)蔗糖濃度為大于75 mmol/L后，生物膜-鈦的黏附強(qiáng)度逐漸降低。此外，Zou等［59］以表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）生物膜的生長(zhǎng)為例，確定了培養(yǎng)環(huán)境中各碳源的最佳濃度為2.5 g/L，碳源濃度在0~2.5 g/L范圍內(nèi)會(huì)促進(jìn)生物膜的形成，碳源濃度大于2.5 g/L后，會(huì)抑制生物膜的形成。

4 群體感應(yīng)調(diào)節(jié)生物膜階段

4.1 群體感應(yīng)調(diào)節(jié)機(jī)理

群體感應(yīng)是細(xì)菌通過(guò)產(chǎn)生和釋放化學(xué)分子來(lái)調(diào)節(jié)自身基因的表達(dá)并使種群密度發(fā)生變化的過(guò)程［60］。這一過(guò)程最早是由Nealson等［61-62］在20世紀(jì)70年代描述肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）和費(fèi)氏弧菌（Vibrio fischeri）中的細(xì)菌相互作用時(shí)提出的。

生物膜的形成依賴于細(xì)菌群體感應(yīng)的調(diào)節(jié)，這是一種由交流系統(tǒng)介導(dǎo)的表型，它依賴于信號(hào)分子——自動(dòng)誘導(dǎo)劑（automatic inducers，AⅠs）的產(chǎn)生、釋放和響應(yīng)［63］。AⅠs的濃度與細(xì)菌數(shù)量成正比［64］，當(dāng)AⅠs的濃度達(dá)到一定的閾值水平時(shí)，與同源受體結(jié)合觸發(fā)下游基因的表達(dá)，從而控制生物膜的形成、毒力因子的分泌、生物發(fā)光、產(chǎn)孢、抗生素的產(chǎn)生等過(guò)程［65］。近年來(lái)研究最多的信號(hào)分子及其來(lái)源見表1。

Table 1 Typical quorum sensing signal produced by microorganisms and their sources［66］表1 微生物產(chǎn)生的典型群體感應(yīng)信號(hào)分子及其來(lái)源［66］

群體感應(yīng)系統(tǒng)中起到關(guān)鍵作用的信號(hào)分子有N-?；呓z氨酸內(nèi)酯（N-Acyl-L-homoserine lactones，AHL）、自誘導(dǎo)物ⅠⅠ（autoinducer-2，AⅠ-2）、寡肽（autoinducing peptide，AⅠP）、擴(kuò)散信號(hào)因子（diffusible signaling factor，DSF），它們的調(diào)節(jié)過(guò)程如圖4所示。AHL主要位于細(xì)胞外，其合成是LuxⅠ通過(guò)衍生內(nèi)酯部分來(lái)調(diào)控的；合成后的AHL分子進(jìn)入細(xì)胞與LuxR受體結(jié)合，LuxR激活后通過(guò)誘導(dǎo)胞外多糖、毒力因子和褐藻酸鹽等目的基因的表達(dá)，進(jìn)一步調(diào)節(jié)生物膜的形成［74］（圖4a）。AⅠP小分子作為通訊信號(hào)從細(xì)胞中主動(dòng)運(yùn)出，在達(dá)到閾值濃度時(shí)激活細(xì)菌表面由組氨酸激酶和響應(yīng)調(diào)控子組成的雙組分系統(tǒng)，通過(guò)磷酸化級(jí)聯(lián)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，激活目的基因的表達(dá)從而調(diào)節(jié)生物膜［75］（圖4b）。AⅠ-2是由luxS基因編碼合成并自發(fā)環(huán)化形成的一系列呋喃酮衍生物［76］，合成后的AⅠ-2可以被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外，并在濃度達(dá)到一定閾值時(shí)，通過(guò)一系列的級(jí)聯(lián)系統(tǒng)來(lái)調(diào)節(jié)群體感應(yīng)基因的表達(dá)并影響菌株的生理行為，包括生物被膜的形成和毒力基因的表達(dá)等［77-78］（圖4c）。DSF是細(xì)菌用于種內(nèi)和種間交流的一類重要信號(hào)分子。DSF的合成受rpfF基因的調(diào)節(jié)［79］，分子識(shí)別涉及傳感器RpfC和響應(yīng)調(diào)節(jié)器RpfG兩部分調(diào)節(jié)系統(tǒng)［80］。Rpf蛋白最早發(fā)現(xiàn)于黃單胞菌（Xanthomonasspp）中，且其同源蛋白質(zhì)廣泛地存在于黃單胞菌屬中，并控制著這些細(xì)菌毒力因子的合成、聚集行為和生物膜的形成［81］（圖4d）。

Fig. 4 The mechanism of the main quorum sensing signals［66］圖4 主要群體感應(yīng)信號(hào)的作用機(jī)制［66］

4.2 群體感應(yīng)中誘導(dǎo)劑的作用

細(xì)菌生物膜的形成和成熟生物膜的結(jié)構(gòu)控制、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的交換等過(guò)程均離不開群體感應(yīng)系統(tǒng)中信號(hào)分子的協(xié)調(diào)［82-84］。其中，AHL可以通過(guò)上調(diào)外排泵基因adeFGH，增加AHL在生物膜中的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而激活群體感應(yīng)系統(tǒng)，分泌大量EPS，促進(jìn)生物膜的形成［85］。Passos等［86］表明，由AHL系統(tǒng)調(diào)節(jié)的LecA和LecB蛋白組成的凝集素是外膜的可溶性蛋白，它們的黏附有助于胞外多糖在生物膜中的保留，在菌落的最初黏附階段形成細(xì)胞簇，LecB還通過(guò)與Psl結(jié)合促進(jìn)生物膜基質(zhì)蛋白的形成。Wang等［87］發(fā)現(xiàn)，外源添加AⅠ-2可以增加與變形鏈球菌的黏附生物膜相關(guān)的基因spaP、fruA、gtfB、gtfC和gtfD等的轉(zhuǎn)錄，AⅠ-2還在不同物種間共培養(yǎng)生物膜形成中扮演信使的角色。Laganenka等［88］也證明了共培養(yǎng)的糞腸球菌（Enterococcus faecalis）AⅠ-2可以促進(jìn)大腸桿菌生物膜的形成，這種共培養(yǎng)的生物膜對(duì)不利環(huán)境的抵抗力提高了17%。AⅠP傳感涉及與細(xì)菌膜中的傳感器激酶信號(hào)受體結(jié)合，然后使控制靶基因轉(zhuǎn)錄的細(xì)胞質(zhì)反應(yīng)調(diào)節(jié)器磷酸化。Nadell等［89］研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞外AⅠP濃度達(dá)到閾值時(shí)，可與膜受體激酶AgrC結(jié)合，磷酸化反應(yīng)調(diào)節(jié)劑AgrA同SarA相配合與P2啟動(dòng)子結(jié)合，促進(jìn)下游agrBDCA基因的表達(dá)，而后與相鄰的P3啟動(dòng)子結(jié)合，調(diào)節(jié)生物膜的形成和毒力因子的表達(dá)。DSF復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其所處環(huán)境的差異使其具有正、負(fù)調(diào)控的特點(diǎn)。DSF的合成途徑也是一個(gè)正反饋調(diào)控過(guò)程。Han等［90］研究表明，當(dāng)細(xì)胞外DSF積累到一定濃度時(shí)，被受體蛋白R(shí)pfC感知，引起其構(gòu)象變化，促進(jìn)DSF合成酶RpfF的釋放，從而形成更多的細(xì)胞外信號(hào)分子。Alcaraz等［91］等研究表明，AmpR可以介導(dǎo)生物膜的形成和毒力因子的表達(dá)；在嗜麥芽鏈球菌中，AmpR主要通過(guò)抑制DSF合成負(fù)調(diào)控RpfF來(lái)抑制群體感應(yīng)，而AmpR突變體比野生型表現(xiàn)出更多的生物膜生成。

5 生物膜的成熟與表征方法

5.1 生物膜的成熟

水中構(gòu)筑物表面在經(jīng)歷了薄膜形成、細(xì)菌黏附、胞外聚合物膜、群體感應(yīng)4個(gè)階段后形成了成熟穩(wěn)定的生物膜。生物膜的形成是一個(gè)復(fù)雜的多因素過(guò)程，受遺傳和環(huán)境因素的調(diào)控，生物膜的結(jié)構(gòu)是由內(nèi)在細(xì)菌調(diào)節(jié)和外部環(huán)境共同決定的［92］。隨著生物膜越發(fā)成熟，靠近基底的常駐細(xì)菌越來(lái)越多地與體液界面或營(yíng)養(yǎng)來(lái)源進(jìn)行物理分離，生物膜內(nèi)經(jīng)歷著由細(xì)胞擁擠、化學(xué)梯度和營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)驅(qū)動(dòng)的不斷變化的微環(huán)境，這導(dǎo)致了生物膜內(nèi)的分層和亞群體的產(chǎn)生［93］。因此，生活在成熟生物膜結(jié)構(gòu)中不同位置的細(xì)菌經(jīng)歷了養(yǎng)分資源、氧氣、分泌物和細(xì)胞外信號(hào)分子的濃度梯度［94］，這也促使部分細(xì)菌開始與生物膜分離。

有研究表明，分離在形成成熟生物膜的形態(tài)特征和結(jié)構(gòu)方面起著重要作用［95］。細(xì)菌被動(dòng)脫離生物膜有磨損、掠食、侵蝕和脫落4種機(jī)制［96］。磨損是由于與散裝液體中的顆粒碰撞而從生物膜中釋放細(xì)胞；而掠食是真核生物的掠食活動(dòng)去除生物膜細(xì)胞的行為；侵蝕是指在流動(dòng)系統(tǒng)中的流體剪切使生物膜發(fā)生的一小部分持續(xù)損失；剝落是指流體摩擦力使完整的生物膜碎片或整個(gè)生物膜被去除［97］。

此外，擴(kuò)散是細(xì)菌與生物膜的另一種分離方式，它的特征是一個(gè)主動(dòng)的表型開關(guān)，它允許細(xì)菌離開生物膜。具體來(lái)說(shuō)，擴(kuò)散通過(guò)某些信號(hào)或線索的感知以及調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的傳導(dǎo)，以實(shí)現(xiàn)促進(jìn)細(xì)菌從生物膜群落釋放的生理變化。擴(kuò)散根據(jù)觸發(fā)信號(hào)的來(lái)源可分為自然擴(kuò)散和環(huán)境誘導(dǎo)擴(kuò)散，自然擴(kuò)散在感知到自合成信號(hào)分子時(shí)發(fā)生，而環(huán)境誘導(dǎo)擴(kuò)散則由外部環(huán)境的因素和變化觸發(fā)。自然擴(kuò)散會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌轉(zhuǎn)移到新的地點(diǎn)進(jìn)行定殖，所以通常被認(rèn)為是生物膜發(fā)展的最后階段［98］。

5.2 生物膜形態(tài)表征

在構(gòu)筑物表面形成成熟穩(wěn)定的生物膜需要多種因素發(fā)揮作用，通過(guò)對(duì)成熟的生物膜進(jìn)行表征有助于深入了解生物膜的形成過(guò)程及其影響因素，對(duì)后續(xù)生物膜的清除或利用也有指導(dǎo)意義。生物膜成熟穩(wěn)定后，它的平均厚度、最大厚度、總生物量、表面生物體積比、粗糙度系數(shù)等基本形態(tài)參數(shù)是首先要表征的。He等［99］用共聚焦激光掃描顯微鏡（confocal laser scanning microscope，CLSM）觀察樣品7 d后生物膜形成情況，逐層采集CLSM圖像，重建生物膜的空間結(jié)構(gòu)并對(duì)它的基本參數(shù)進(jìn)行了量化。Le Norcy等［100］在培養(yǎng)基的連續(xù)流速下培養(yǎng)微藻生物膜，在120 h內(nèi)定量測(cè)定微藻的生物體積，并測(cè)定其生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)。Cui等［101］對(duì)生物膜的微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征，并分析了細(xì)菌的轉(zhuǎn)錄組。

此外，基于流體的動(dòng)態(tài)測(cè)量系統(tǒng)在表征生物膜的形成研究中受到越來(lái)越多的關(guān)注。Guliy等［102］等以假單胞菌為例，在微流體系統(tǒng)中基于交變電場(chǎng)引起的細(xì)胞極化率變化的實(shí)時(shí)記錄，采用相襯顯微鏡和傳統(tǒng)微生物鍍膜法進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)，描述了細(xì)胞從浮游生物到生物膜生長(zhǎng)過(guò)程中傳感器信號(hào)的變化，證實(shí)了生物膜的形成。Lemos等［103］提出了一種基于動(dòng)態(tài)流體的測(cè)量圓柱形表面生物膜厚度和量化生物膜去除應(yīng)力的新方法。該裝置是將測(cè)試筒浸入液體中進(jìn)行試驗(yàn)操作，對(duì)生物膜厚度的測(cè)量精度為±19 μm，與流體動(dòng)力學(xué)計(jì)算模擬的結(jié)果吻合。

5.3 生物膜黏附力的表征

生物膜黏附力的表征一般是從單細(xì)胞黏附力的量化開始研究的。目前，許多技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于表征單細(xì)胞黏附過(guò)程和定量黏附力。其中，原子力顯微鏡（atomic force microscope，AFM）將表征細(xì)胞之間的機(jī)械接觸力下降到了單分子水平，并已被用于測(cè)量pN范圍內(nèi)的力。由于其在單個(gè)分子的拉伸/展開和測(cè)量分子鍵強(qiáng)度方面的強(qiáng)大作用而受到廣泛且深入的研究。Boyd等［104］使用AFM測(cè)量了細(xì)菌在拋光、未拋光和磨損3種經(jīng)過(guò)不同處理的樣品表面的黏附力在2~10 nN范圍。Sahoo等［105］制備了磷化銦（ⅠnP）納米線陣列，利用場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（field emission scanning electron microscope，F(xiàn)ESEM）觀察了細(xì)胞在原始平坦的ⅠnP表面和空間有序的納米線陣列的黏附情況，并且觀察到了納米線陣列與附著的細(xì)胞體直接接觸時(shí)發(fā)生的變形，通過(guò)納米線尖端位置在細(xì)胞附著時(shí)的位移，定量測(cè)量細(xì)胞黏附力可達(dá)45 nN。

在宏觀水平上定量評(píng)估生物膜黏附性時(shí)常采用微流體控制裝置，該類裝置提供了精確控制剪切應(yīng)力的方法來(lái)評(píng)估生物膜的黏附強(qiáng)度，常用的平臺(tái)有改良Robbins裝置、流動(dòng)室、旋轉(zhuǎn)生物膜裝置、微板和微流體裝置。Kozuka等［106］利用所設(shè)計(jì)的微流控裝置，借助微通道底壁上產(chǎn)生的1、2和3 Pa三個(gè)典型剪應(yīng)力值，表征了金黃色葡萄球菌在不同表面的黏附強(qiáng)度。Al-Kafaween等［107］使用96孔板和微板閱讀器測(cè)量了銅綠假單胞菌和化膿性鏈球菌形成的生物膜，并根據(jù)黏附強(qiáng)度公式將生物膜分為非黏附、弱黏附、中度黏附和強(qiáng)黏附4類。Finlay等［108］用玻璃和聚二甲基硅氧烷彈性體（PDMSe）作為“模型”表面發(fā)展生物膜，在人造海水循環(huán)系統(tǒng)產(chǎn)生0~2.4 Pa的不同剪切應(yīng)力，確定了生物膜的黏附性能。越來(lái)越多的研究表明，在微流控系統(tǒng)中引入傳感技術(shù)，如微傳感器或電化學(xué)探針，是在線生物膜檢測(cè)和微環(huán)境分析的重要發(fā)展方向。

6 總結(jié)與展望

水中構(gòu)筑物表面生物膜的形成是一個(gè)復(fù)雜的、動(dòng)態(tài)變化的過(guò)程，包括薄膜形成階段、細(xì)菌黏附階段、胞外聚合物膜階段、群體感應(yīng)調(diào)節(jié)生物膜階段、生物膜發(fā)育成熟階段。本綜述深入探討了在生物膜成熟的過(guò)程中各階段所發(fā)生的物理化學(xué)變化，以及各種變化對(duì)生物膜形成所產(chǎn)生的影響。

水中的化合物分子吸附在表面形成薄膜被證明是生物膜形成的第一步，而不同來(lái)源和環(huán)境中的化合物分子組成薄膜的化學(xué)特征也不盡相同，進(jìn)而導(dǎo)致薄膜對(duì)細(xì)菌初始黏附的調(diào)控機(jī)制千差萬(wàn)別。薄膜形成后通過(guò)改變電荷、電位和表面張力來(lái)改變表面的理化性質(zhì)，當(dāng)浮游細(xì)菌靠近表面時(shí)，會(huì)在范德華力、布朗運(yùn)動(dòng)和靜電力等作用下在表面發(fā)生可逆黏附，隨后，在表面化合物分子、EET、細(xì)菌鞭毛等共同作用下，細(xì)菌實(shí)現(xiàn)了從可逆黏附到不可逆黏附的轉(zhuǎn)變。本文分析近年來(lái)細(xì)菌-表面黏附的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，表面的粗糙度、形貌、疏水性和環(huán)境pH等因素在細(xì)菌黏附過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。在細(xì)菌成功黏附到表面后，細(xì)菌開始分泌胞外多糖、eDNA、蛋白質(zhì)和脂類等復(fù)雜的生物分子混合物，本文討論了主要的胞外聚合物對(duì)細(xì)菌黏附和生物膜形成的影響，發(fā)現(xiàn)多數(shù)胞外聚合物可以促進(jìn)細(xì)菌-細(xì)菌、細(xì)菌-表面相互作用，從而促進(jìn)生物膜的形成，然而，有研究發(fā)現(xiàn)胞外聚合物產(chǎn)生及其對(duì)生物膜形成的影響具有不確定性，要根據(jù)具體的溫度和碳源濃度范圍來(lái)確定。胞外聚合物膜階段后，表面開始出現(xiàn)三維網(wǎng)狀膜結(jié)構(gòu)，膜內(nèi)的細(xì)菌通過(guò)產(chǎn)生信號(hào)分子來(lái)調(diào)節(jié)自身基因的表達(dá)和加強(qiáng)與細(xì)菌之間的交流，這種現(xiàn)象稱為群體感應(yīng)。本文通過(guò)綜述近年來(lái)人們對(duì)中信號(hào)分子的研究，探討了其在生物膜發(fā)育到成熟階段的調(diào)節(jié)機(jī)制。生物膜在經(jīng)過(guò)群體感應(yīng)調(diào)節(jié)后發(fā)育為穩(wěn)定的三維立體結(jié)構(gòu)，此時(shí)的生物膜內(nèi)環(huán)境極其復(fù)雜，細(xì)菌之間存在著資源、氧氣、信號(hào)分子等物質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)，導(dǎo)致部分細(xì)菌與生物膜分離。本文闡明了細(xì)菌從生物膜被動(dòng)分離或主動(dòng)分離的方式和分離機(jī)制，其中涉及到流體動(dòng)力、分泌化合物等物理化學(xué)變化。在了解生物膜的成熟過(guò)程后，許多研究的重點(diǎn)放在了對(duì)生物膜的表征，包括形態(tài)的表征和黏附力的表征，相應(yīng)的表征方法和技術(shù)手段也受到越來(lái)越多的關(guān)注，其中原子力顯微鏡和基于微流體的表征方法被更多的應(yīng)用微觀單細(xì)胞黏附力和宏觀的生物膜黏附力的研究。

總之，本綜述的討論對(duì)研究生物膜防控和利用策略有一定指導(dǎo)意義，經(jīng)過(guò)對(duì)近年來(lái)相關(guān)研究的分析，本文總結(jié)出尚需深入研究的幾個(gè)關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題：a. 細(xì)菌細(xì)胞與表面接觸或感知周圍環(huán)境物理-化學(xué)變化的確切機(jī)制；b. 細(xì)菌在不斷變化的環(huán)境中與表面的黏附適應(yīng)性；c. 在多樣化環(huán)境中成長(zhǎng)的物種與生活在同質(zhì)環(huán)境中的物種黏附機(jī)制的差異。全面理解群體感應(yīng)機(jī)制并明確群體感應(yīng)出現(xiàn)的機(jī)理將是一個(gè)重要挑戰(zhàn)，未來(lái)研究需要重點(diǎn)關(guān)注基因表達(dá)模式、細(xì)胞間相互作用、生理特性和信號(hào)分子的分子水平細(xì)節(jié)等關(guān)鍵問(wèn)題。此外，細(xì)胞水平細(xì)菌行為表征新技術(shù)，以及生物膜微觀精確觀測(cè)新技術(shù)等微觀測(cè)試技術(shù)的演進(jìn)，將對(duì)研究水環(huán)境中生物膜的形成過(guò)程和影響因素產(chǎn)生重要意義。