錳超氧化物歧化酶的催化原理與酶活性調(diào)節(jié)機(jī)制*

張旭 張蕾 許鵬琳 李天然 晁瑞青 韓正好

（1）鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，鄭州 450001；2）鄭州大學(xué)體育學(xué)院，鄭州 450001；3）鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科，鄭州 450001；4）鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，鄭州 450001；5）鄭州大學(xué)化學(xué)學(xué)院，鄭州 450001；6）河南應(yīng)用技術(shù)職業(yè)學(xué)院，鄭州 450042）

錳超氧化物歧化酶（manganese superoxide dismutase，MnSOD）定位于真核細(xì)胞的線粒體和原核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，在植物細(xì)胞的葉綠體也有表達(dá)。其存在的廣泛性以及特殊的定位表明MnSOD在生命活動中的重要作用。線粒體是細(xì)胞能量代謝中心。除了提供>90%的細(xì)胞ATP外，線粒體也提供了熱源以維持和調(diào)節(jié)生物體體溫［1-2］。MnSOD催化2分子超氧自由基歧化為分子氧（O2）和過氧化氫（H2O2），而被認(rèn)為是一種重要的抗氧化酶。但是，目前大部分學(xué)者認(rèn)為活性氧（reactive oxygen species，ROS，主要包括超氧自由基和H2O2等）可以調(diào)控細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)和蛋白質(zhì)等生物大分子的功能，可以作為信號分子產(chǎn)生生理學(xué)效應(yīng)，比如其介導(dǎo)衰老、神經(jīng)退行性疾病、代謝病、腫瘤等許多生理和病理過程［3-4］。但是ROS具體介導(dǎo)了什么信號，目前沒有定論。MnSOD酶活性受到化學(xué)修飾與變構(gòu)調(diào)節(jié)等多種形式的快速調(diào)節(jié)，這些調(diào)節(jié)直接改變該酶的活化狀態(tài)，進(jìn)而可能改變超氧自由基和H2O2的代謝速度和方向。因此，研究MnSOD的催化原理與調(diào)節(jié)機(jī)制無疑可以揭示MnSOD的生理作用和ROS的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。MnSOD基因的表達(dá)調(diào)控已經(jīng)有很多文章報道，但是從來沒有人報道過其快速的酶活性調(diào)節(jié)模式。以前的研究提出MnSOD受溫度調(diào)控的變構(gòu)調(diào)節(jié)模式，該模式提示，錳超氧化物酶是特異性地被低溫激活的酶，并且可能是生物體和細(xì)胞中原始的和普遍的溫度感受器［5］。本綜述首先論述MnSOD催化反應(yīng)的基本原理，然后討論MnSOD溫度依賴性的酶促動力學(xué)特征，及其酶促動力學(xué)特征的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和分子機(jī)制。最后闡述幾種MnSOD的化學(xué)修飾模式，如乙?；拖趸揎棧?-7］，說明MnSOD受到多種形式的調(diào)節(jié)，這些調(diào)節(jié)可以改變細(xì)胞中的ROS水平和流量，為揭示ROS的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用提供幫助。

1 MnSOD催化反應(yīng)的基本原理

MnSOD通過快循環(huán)和慢循環(huán)的兩種途徑催化超氧自由基（superoxide radical，）歧化為O2和H2O2［8-11］。定性地描述該催化機(jī)理如方程式（1）~（4）。第一個超氧自由基分子被氧化成O2的過程是一個在快循環(huán)和慢循環(huán)中都以相同的速率常數(shù)k1進(jìn)行的反應(yīng)，其速度接近于擴(kuò)散速度。第二個超氧自由基分子被還原為H2O2的反應(yīng)可以通過快循環(huán)（2）或者慢循環(huán)（3）和（4）兩條途徑平行進(jìn)行。在慢循環(huán)途徑中，MnSOD與超氧自由基形成一種叫產(chǎn)物抑制（product inhibition）復(fù)合物的中間產(chǎn)物，然后中間產(chǎn)物被質(zhì)子化而緩慢釋放出H2O2。反應(yīng)速率常數(shù)k3描述了抑制復(fù)合物的形成速率，k4是抑制復(fù)合物的質(zhì)子化和酶的復(fù)活速率。在快循環(huán)途徑中，直接被轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物H2O2，Mn2+與之間的電子轉(zhuǎn)移與質(zhì)子化反應(yīng)同步完成，其反應(yīng)速率為k2?？煅h(huán)途徑有助于產(chǎn)物釋放和酶的快速周轉(zhuǎn)（turnover）與復(fù)活。反應(yīng)速度k2/k3的比值被命名為門控比（gating ratio）。門控比衡量了MnSOD進(jìn)入快循環(huán)通路和慢速循環(huán)通路的相對速度，高的門控比表示這個酶更快地進(jìn)入快循環(huán)通路催化反應(yīng)、減少產(chǎn)物抑制復(fù)合物的形成［12］。

2 雙相催化反應(yīng)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)

MnSOD是由相同的亞基組成的二聚體或四聚體，每個亞基含有1個Mn離子。從微生物到人類的所有MnSODs具有高度的同源性，其活性中心由保守的氨基酸組成并且表現(xiàn)出幾乎相同的空間結(jié)構(gòu)。為方便起見、除非另外特別注明，本文使用人類MnSOD（HuMnSOD）氨基酸序列號。Mn離子嵌入在酶活性位點中，并且與4個氨基酸殘基（His26、His74、His163、Asp159）和1個游離的含氧分子（H2O或OH-（WAT1），位于His26的對位，圖1）形成5個配位鍵［13-14］。這5個配體形成了酶活性位點的“內(nèi)球（inner sphere）”。His30和Tyr34以及其他幾個氨基酸殘基形成了控制底物進(jìn)入和產(chǎn)物（O2和H2O2）釋放出“內(nèi)球”的通道。His30和Tyr34之間大約有5 ?的間隙（室溫），該間隙是底物進(jìn)入和產(chǎn)物釋放進(jìn)出“內(nèi)球”的“門”，1個水分子（WAT2）通常在門口與Tyr 34形成氫鍵（圖1）。Gln143、Tyr34、WAT2和His30形成了“外球（outer sphere）”，并與WAT1一起共同形成一條延伸的氫鍵鏈，該氫鍵鏈被認(rèn)為參與歧化反應(yīng)中的質(zhì)子轉(zhuǎn)移［15］。

Fig. 1 Structure of the active site of HuMnSOD (PDB 7KKS, oxidized type)圖1 HuMnSOD的活性位點結(jié)構(gòu)圖（PDB 7KKS，氧化型）

由于超氧自由基的半衰期很短，在晶體學(xué)和光譜學(xué)的研究中往往使用疊氮化物（N3-）和氟化物（F-）作為超氧自由基的類似物來研究底物或產(chǎn)物與Mn之間的相互作用［14］。已發(fā)表的結(jié)構(gòu)顯示，疊氮化物在Asp159殘基的對位與Mn形成第6個配位鍵（例如HuMnSOD，PDB 5T30）。盡管疊氮化物和超氧自由基的分子大小不同，但是基于疊氮化物與Mn相互作用的研究表明，MnSOD催化的歧化反應(yīng)有內(nèi)球途徑和外球途徑兩種反應(yīng)機(jī)制。在內(nèi)球反應(yīng)途徑中，進(jìn)入內(nèi)球并作為第6配體與Mn離子配位結(jié)合，然后釋放出O2和H2O2。超氧自由基氧化成分子氧伴隨著Mn3+的還原，是接近于擴(kuò)散速度的反應(yīng)。超氧自由基還原為H2O2伴隨著Mn2+SOD的氧化是整個歧化反應(yīng)關(guān)鍵的限速步驟，如果超氧自由基結(jié)合的還原態(tài)錳（Mn2+）轉(zhuǎn)化氧化態(tài)錳（O22-Mn3+），并且O22-不能快速地被質(zhì)子化而釋放，活性的酶就轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物抑制復(fù)合物［16-20］。在外球途徑中，超氧自由基不與Mn配位而直接轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物，還原為O22-的過程同時伴隨著質(zhì)子的轉(zhuǎn)移，而一步釋放出H2O2。外球途徑有利于產(chǎn)物釋放并且有助于酶的快速復(fù)活。疊氮化物浸泡的MnSOD的結(jié)構(gòu)表明疊氮化物也與WAT2相互作用，并且在這種情況下Mn的第6配位鍵位置是空的，這可以解釋為該催化反應(yīng)也可能在內(nèi)球以外發(fā)生，并且通過外球的氫鍵網(wǎng)絡(luò)傳遞質(zhì)子［21-22］。

快速循環(huán)是通過外球途徑進(jìn)行的氧化還原反應(yīng)，k2是快速的外球途徑反應(yīng)的速率常數(shù)。慢速循環(huán)是內(nèi)球反應(yīng)途徑，k3表征進(jìn)入內(nèi)球反應(yīng)的速率常數(shù)，并可以解釋為產(chǎn)物抑制復(fù)合物的形成速率。速率常數(shù)k4是過氧化物離子從內(nèi)球體釋放出來的速率［9-10］。當(dāng)進(jìn)入內(nèi)球并配位Mn離子時，酶很容易形成抑制復(fù)合物而難以解離。本文認(rèn)為MnSOD的活性主要是通過控制門控比來調(diào)節(jié)的，調(diào)節(jié)產(chǎn)物抑制復(fù)合物的解離速度是低效率的，干擾進(jìn)入內(nèi)球以利于減少產(chǎn)物抑制是保持高酶活性的更有效策略［5］。

3 溫度對MnSOD活性的調(diào)節(jié)

有人提出MnSOD進(jìn)入快循環(huán)可能是調(diào)節(jié)線粒體或者細(xì)胞中過氧化氫流通量的機(jī)制。然而，對MnSOD雙相催化過程的確切化學(xué)原理及其生理學(xué)意義目前尚不清楚。不同物種來源的MnSODs有一項保守特征，即其在高溫下迅速形成產(chǎn)物抑制復(fù)合物。在低溫下MnSODs較少被抑制，并且在形成產(chǎn)物抑制復(fù)合物之前經(jīng)歷更多的快速循環(huán)途徑催化反應(yīng)。筆者認(rèn)為溫度是控制MnSOD進(jìn)入慢速或者快速循環(huán)途徑催化的重要因素。

3.1 低溫激活MnSOD

20世紀(jì)70年代對來自大腸桿菌（Escherichia coli）的MnSOD（EcMnSOD）和嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillus stearothermophilus，生長溫度大于65oC）的MnSOD（BsMnSOD）的研究發(fā)現(xiàn)：MnSOD通過快循環(huán)和慢循環(huán)的兩種途徑催化超氧自由基歧化［9-11］。對于BsMnSOD來說，在溫度為25oC和pH為9.4的情況下，其反應(yīng)速率常數(shù)值k1（≈k2）=5.6×108mol-1·L·s-1、k3=4.8×107M-1·L·s-1、k4=70 s-1、kcat=4×104s-1。最初發(fā)現(xiàn)MnSOD雙相催化機(jī)制的McAdam等［9-10］同時還分析了H2O2、pH、溫度和其他可能參與調(diào)節(jié)BsMnSOD酶活性的因素，他們發(fā)現(xiàn)該酶的門控比主要受溫度調(diào)節(jié)。還發(fā)現(xiàn)反應(yīng)常數(shù)k1和k2在10~60oC之間幾乎不隨溫度變化而變化，因此BsMnSOD催化的快速循環(huán)反應(yīng)速率在這個溫度范圍內(nèi)與溫度變化無關(guān)。另一方面，慢循環(huán)的反應(yīng)常數(shù)k3和k4隨著溫度（在5~55oC之間）的增高而加快。在25oC時，BsMnSOD催化的快速與慢速反應(yīng)的門控比為12∶1，而在55oC時其門控比僅為3∶1。與高溫導(dǎo)致k3的快速增加相比，溫度僅引起k4值微小的變化。由于反應(yīng)（4）的效率低下，伴隨著k3隨溫度升高，抑制復(fù)合物的形成速率（k3）遠(yuǎn)低大其解離速率（k4）。隨著反應(yīng)的繼續(xù)，每進(jìn)行一次循環(huán)，就有更多的酶分子轉(zhuǎn)化為抑制復(fù)合物而不能及時復(fù)活。最終在高溫下，酶不能及時周轉(zhuǎn)與復(fù)活而導(dǎo)致所有反應(yīng)都會進(jìn)入以k4速率進(jìn)行的慢循環(huán)途徑。

隨著生理范圍內(nèi)的溫度升高，MnSOD催化反應(yīng)的門控比反而降低，因而生理范圍內(nèi)的升高溫度反而促進(jìn)該酶更快地進(jìn)入慢速反應(yīng)途徑。當(dāng)k2/k3在較高溫度下下降到一定的低比率范圍時，反應(yīng)更快地進(jìn)入慢循環(huán)途徑，這時在反應(yīng)中幾乎觀察不到快循環(huán)反應(yīng)。在較低的溫度下，酶更快地進(jìn)入快循環(huán)通路催化反應(yīng)而減少抑制復(fù)合物的形成。在足夠低的溫度下，當(dāng)k2遠(yuǎn)大于k3時，自由的酶會迅速再生而復(fù)活，所有反應(yīng)都將轉(zhuǎn)向高效的快速循環(huán)途徑（圖2）。這個足夠低的溫度點是所有反應(yīng)切換到快速循環(huán)的閾值溫度，或者是“設(shè)定點”溫度。這一特性意味著MnSOD是一種特異性地被低溫活化的酶。

Fig. 2 MnSOD catalyzes the disproportionation of superoxide radicals in two parallel pathways of fast- or slow-cycle depending on temperature圖2 MnSOD依賴于溫度變化通過快循環(huán)或慢循環(huán)兩種平行途徑催化超氧自由基的歧化反應(yīng)

3.2 MnSOD是受溫度調(diào)控的變構(gòu)酶

室溫下采集的MnSOD晶體結(jié)構(gòu)活性中心的Mn是一個五配位的結(jié)構(gòu)［23-25］。Borgsdahl等［26］在低溫（100 K）條件下捕獲到了EcMnSOD的六配位晶體結(jié)構(gòu)，Mn的第6配位鍵配體是1個水分子（WAT2或OH-）（圖3，PDB 1D5N）。低溫俘獲的晶體與一般晶體之間的不同反映了MnSOD活性位點的配位狀態(tài)是溫度依賴性的。在低溫冷卻過程中，WAT2從外球“門”的位置移動到內(nèi)球并作為第6配體與Mn配位，這表明MnSOD是一種受溫度調(diào)控的變構(gòu)酶。人們早就知道，配體與Mn之間的相互作用是壓力和溫度依賴性的，因為配位鍵的形成對Mn與配體之間距離敏感［13，26］。隨著溫度的降低，Tyr34氨基酸殘基改變其與錳的角度和距離，并在空間上調(diào)節(jié)其氫鍵伴侶（WAT2）與Mn的距離。在足夠低的溫度（100 k）下WAT2接近甚至與Mn形成配位鍵。而在室溫下隨著活性位點的受熱膨脹或者水分子熱運(yùn)動加劇，WAT2脫離Mn，這可能就是為什么在室溫下采集的一般晶體中沒有觀察到六配位WAT2-Mn的原因。變構(gòu)配位表明WAT2和Mn之間的距離受溫度控制，在生理溫度范圍內(nèi)WAT2和Mn之間的距離變化可能與MnSOD的生理學(xué)功能相關(guān)。在活性位點遇冷收縮時，WAT2更接近Mn，WAT2可能會在空間上干擾進(jìn)入內(nèi)球并迫使反應(yīng)進(jìn)入更快的外球循環(huán)通路，從而導(dǎo)致更高的門控率和酶活性以及較低的產(chǎn)物抑制水平。

Fig. 3 The six-coordinated crystal structure of EcMnSOD captured at a low temperature（100 K）圖3 低溫（100 K）條件下捕獲到的EcMnSOD六配位晶體結(jié)構(gòu)

上述晶體結(jié)構(gòu)的研究表明，EcMnSOD可以根據(jù)溫度的變化處于不同的配位狀態(tài)。要捕獲到MnSODs配位結(jié)構(gòu)發(fā)生轉(zhuǎn)變，需要很大的溫度變化（室溫到100 K）。光譜學(xué)研究表明，該酶活性位點的Mn在生理或者亞生理溫度范圍內(nèi)，處于五配位和六配位的動態(tài)平衡中。Whittaker等［27］最先報道了疊氮化物與Mn3+SOD的相互作用依賴于溫度的變化。他們在EcMnSOD觀察到，其發(fā)生六配位到五配位轉(zhuǎn)變的中位點溫度是220 K（≈-53oC），在生理溫度（300 K≈27oC）下完全轉(zhuǎn)變?yōu)槲迮湮唤Y(jié)構(gòu)。同時，來自嗜熱熱桿菌HB8（Thermus thermophilus）的MnSOD（TtMnSOD）表現(xiàn)出類似于EcMnSOD的變構(gòu)行為，但TtMnSOD在發(fā)生六配位到五配位轉(zhuǎn)變的中位點溫度在更高的溫度305 K（≈32oC）［28］。TtMnSOD和EcMnSOD兩種酶的活性位點結(jié)構(gòu)幾乎相同，但對溫度反應(yīng)的敏感點明顯不同，顯然每個生物體的生理生長溫度與MnSOD變構(gòu)的溫度敏感點有關(guān)。這些結(jié)果為MnSOD結(jié)構(gòu)的微妙變化在協(xié)調(diào)生物適應(yīng)極端物理環(huán)境中的作用提供了證據(jù)。

光譜和計算化學(xué)研究表明，MnSOD的活性位點處于無疊氮化物的五配位和加合疊氮化物的六配位之間的動態(tài)平衡之中，其動態(tài)平衡點依賴于溫度。在室溫環(huán)境中，伴隨著MnSOD活性位點的受熱膨脹，與Tyr34以氫鍵連接的疊氮化物脫離Mn3+，因此室溫下該酶的活性中心為五配位狀態(tài)［16，21-22］。如前所述，超氧自由基氧化成氧氣伴隨著Mn3+SOD還原為Mn2+SOD是一個與溫度變化無關(guān)的過程，在快循環(huán)和慢循環(huán)中都以相同的速率常數(shù)k1進(jìn)行。還原態(tài)的Mn2+SOD與陰離子（疊氮化物）的相互作用可以提供更多關(guān)于溫度依賴性Mn2+的氧化過程和產(chǎn)物抑制信息，但是Mn2+與陰離子的相互作用不同于Mn3+與陰離子的相互作用，因為Mn2+較低的表面電荷導(dǎo)致Mn2+SOD的活性中心趨向于靜電力平衡狀態(tài)。Mn2+SOD在低溫下更有可能不與陰離子配位，而是與水分子配位［29-30］。Tabares等［31］基于高場電子順磁共振譜（highfrequency and high-field electron paramagnetic resonance，HFEPR）的光譜分析表明，Mn2+SOD溫度依賴性地與H2O相互作用。他們檢測到天然（無陰離子）EcMn2+SOD的獨特六線HFEPR光譜，該六線光譜的強(qiáng)度隨著孵育溫度的降低而增加，而在高溫下完全逆轉(zhuǎn)。新檢測到的六線光譜是由于在MnSOD的五配位中心上添加了一個水分子（WAT2）。在室溫下WAT2位于外球的“門”處并且與Tyr34以氫鍵結(jié)合。天然（無陰離子）EcMn2+SOD的五配位中心添加水分子在結(jié)構(gòu)上類似于低溫條件下（100 K）捕獲的EcMnSOD蛋白晶體。五配位轉(zhuǎn)換到加合WAT2六配位EcMn2+SOD的熱力學(xué)參數(shù)與先前報道的疊氮化物加合物中EcMn3+SOD轉(zhuǎn)換的熱力學(xué)參數(shù)幾乎相同。

3.3 MnSOD是一種被低溫活化的變構(gòu)酶

本文認(rèn)為，MnSOD的配位方式主要受溫度調(diào)節(jié)，溫度變化導(dǎo)致其嚴(yán)格保守的內(nèi)外球網(wǎng)關(guān)氨基酸殘基Tyr34改變其與錳的角度和距離，并調(diào)節(jié)Tyr34的氫鍵伙伴與Mn的距離、甚至與錳形成配位鍵。水、疊氮離子、氟化物和都是Tyr34的氫鍵伙伴［16，21-22］。疊氮化物因為它的分子半徑足夠大可以作為第6配體直接與Mn配位。伴隨著MnSOD酶活性位點的遇冷收縮，疊氮化物可以在空間上接觸到Mn而與Mn配位。而相反，較小分子半徑的氟陰離子在低溫環(huán)境中不能接觸到（或連接）Mn，而是非常接近Mn離子。在低溫下，Mn3+SOD優(yōu)先配位疊氮化物，而Mn2+SOD的主要配體是WAT2。疊氮化物與Mn3+SOD的相互作用與MnSOD的生理學(xué)作用無關(guān)，因為Mn3+SOD還原成Mn2+SOD是在快循環(huán)和慢循環(huán)中以相同速率常數(shù)（k1）的過程。與溫度變化相關(guān)的WAT2/Mn2+SOD相互作用是門控比隨溫度降低而增加的結(jié)構(gòu)學(xué)基礎(chǔ)［29，31-32］。

Fig. 4 MnSOD functions as an allosteric enzyme activated by low temperature圖4 MnSOD是一種被低溫激活的變構(gòu)酶

4 MnSOD的化學(xué)修飾調(diào)節(jié)

蛋白質(zhì)的翻譯后修飾調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的活化、失活或功能繼而來控制許多生物過程。MnSOD主要受到乙?；?、硝化和磷酸化等共價修飾調(diào)節(jié)，這些修飾普遍導(dǎo)致該酶活性降低。由于MnSOD的化學(xué)修飾已被證明可能具有可逆性，因此這些修飾可能與細(xì)胞中的氧化還原信號傳導(dǎo)過程有關(guān)，其中乙?；拖趸揎棻蛔C明與炎癥性熱疼痛的發(fā)生有關(guān)［36-39］。

4.1 乙?；揎?/h3>

HuMnSOD的特定賴氨酸殘基的乙酰化修飾導(dǎo)致該酶的活性降低和線粒體超氧化物水平增加。Benovic等［36］提出帶正電荷的賴氨酸通過靜電引導(dǎo)超氧化物陰離子進(jìn)入酶的活性中心，該觀點也得到認(rèn)可［40］，而賴氨酸的乙?；揎棇?dǎo)致MnSOD活性中心的靜電引力降低從而降低酶活性［41］。Sirt3（sirtuin-3，主要位于線粒體的NAD+依賴性去乙?；福┛梢匀コ齅nSOD的乙酰化修飾而維持MnSOD的酶活性［42-43］。線粒體Ca2+內(nèi)流導(dǎo)致NAD+/NADH比值下調(diào)，進(jìn)一步導(dǎo)致依賴NAD+的SⅠRT3去乙?；富钚越档投种芃nSOD的活性，導(dǎo)致ROS生產(chǎn)增多［44-48］。上述論文的結(jié)果提示，在NAD+/NADH平衡狀態(tài)下MnSOD是被乙酰化修飾的，氧化態(tài)NAD+增多導(dǎo)致MnSOD被去除乙酰化而活化。MnSOD乙酰化與去乙?；揎椏赡苁且环N在代謝壓力下（營養(yǎng)匱乏或缺氧）維持代謝平衡的反饋機(jī)制。

有研究表明，MnSOD的乙?；揎椗c炎癥性熱敏疼痛的發(fā)生有關(guān)。Lauro等［42］認(rèn)為，細(xì)胞中超過90%的ROS是在線粒體中產(chǎn)生的，過量的超氧化物可導(dǎo)致DNA、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)損傷，這些傷害性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)到神經(jīng)中樞引起小鼠對炎癥性熱疼痛的敏感。SⅠRT3活性降低導(dǎo)致MnSOD失活而不能維持超氧自由基和線粒體穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致動物對熱痛覺更敏感［43，45-46］。同時，MnSOD活性降低導(dǎo)致的氧化應(yīng)激會抑制SⅠRT3活性，進(jìn)而導(dǎo)致線粒體高乙?；降男揎椇脱趸瘧?yīng)激加劇。這些相互作用導(dǎo)致放大SⅠRT3作用的反饋回路，進(jìn)一步增強(qiáng)氧化損傷和炎癥過程的正反饋信號。已知的天然或化學(xué)合成的抗氧化劑具有抗熱痛覺過敏的作用， 如膳食多酚（如白藜蘆醇）具有抗氧化和持久的抗熱敏感作用。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇在體內(nèi)和體外均可以有效促進(jìn)SⅠRTs的去乙?；富钚裕邹继J醇通過維持SⅠRT3活性來清除內(nèi)源性超氧自由基，從而抑制炎癥性熱疼痛［47-48］。

4.2 硝化修飾

活性氮（reactive nitrogen species，RNS，包括?NO、過氧化亞硝酸鹽ONOO-和?NO2等）會引起蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、核苷酸和其他生物分子的硝化。體內(nèi)RNS的生物學(xué)作用是硝化蛋白質(zhì)中的酪氨酸而產(chǎn)生3-硝基酪氨酸，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能改變，如酶的催化活性失活、對蛋白水解酶的敏感性改變等。硝化修飾還可以阻礙酪氨酸被磷酸化修飾而影響酪氨酸蛋白激酶的生物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用［19，49-50］。MnSOD中的Tyr34是被過氧亞硝酸鹽硝化的主要氨基酸殘基，Tyr34殘基位于MnSOD活性位點中距離錳～5.5 ?的范圍內(nèi)， 硝基化修飾MnSOD足以導(dǎo)致MnSOD喪失了大部分酶活性［51-53］?？茖W(xué)家提出MnSOD的Tyr34殘基被硝基修飾而降低活性的3種可能機(jī)制：a.空間位阻干擾底物（）進(jìn)入酶的活性中心；b.減弱支持催化中質(zhì)子轉(zhuǎn)移的氫鍵網(wǎng)絡(luò)；c.由硝基的存在而引起的該酶活性中心的氧化還原電位變化和靜電效應(yīng)降低。

有證據(jù)表明，在熱刺激下，外周和中樞神經(jīng)中活性氧和活性氮的含量增加。而同時，去除ROS和RNS的藥物可以逆轉(zhuǎn)和預(yù)防與多種病因的熱疼痛相關(guān)的特征性表現(xiàn)，包括炎癥性疼痛、神經(jīng)性疼痛或嗎啡誘導(dǎo)的痛覺過敏和耐受性。熱刺激誘導(dǎo)ROS/RNS形成的增加，可能會促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)對熱刺激的敏感性。MnSOD被硝化而失活導(dǎo)致增加，對于炎癥和熱刺激誘導(dǎo)的痛覺過敏的發(fā)展至關(guān)重要［43-47］。

5 討論

生物能轉(zhuǎn)化的本質(zhì)是發(fā)生在線粒體中的氧化還原反應(yīng)。通過三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycling，TCA）產(chǎn)生的還原態(tài)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）和還原態(tài)黃素腺嘌呤二核苷酸（FADH2）與O2反應(yīng)是生物產(chǎn)生和利用能量的主要途徑［52，54］。O2包含兩個不成對的順磁電子，因此，分子氧的還原面臨自旋限制因而必須通過單電子還原步驟進(jìn)行，而不可避免地產(chǎn)生超氧自由基中間體。含有單電子輔因子（例如過渡金屬離子錳、鐵、銅等）的酶可以幫助分子氧克服自旋限制而避免產(chǎn)生氧自由基。高效的細(xì)胞色素c氧化酶（cytochrome c oxidase，一種血紅素-銅氧化酶）直接催化分子氧還原為水而避免產(chǎn)生超氧自由基。細(xì)胞色素c氧化酶是呼吸鏈 （respiratory chain，ETC）最終端的限速酶，它將質(zhì)子拉過線粒體內(nèi)膜（mitochondrial inner membrane，ⅠMM，在真核生物中）或細(xì)胞膜（在原核生物中）而形成跨膜的質(zhì)子梯度。存儲在跨膜的電化學(xué)質(zhì)子梯度中的自由能最終用于合成ATP，這個過程被稱為氧化磷酸化（oxidative phosphorylation，OXPHOS）。

從呼吸鏈泄漏的電子可以直接傳遞給分子氧而生成超氧自由基。SODs（MnSOD、FeSOD、Cu-ZnSOD、NiSOD）將單電子超氧自由基催化為O2和H2O2，H2O2被其他級聯(lián)的抗氧化酶（例如過氧化物酶、谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶，所有這些酶構(gòu)成級聯(lián)的抗氧化系統(tǒng)）轉(zhuǎn)化為水。級聯(lián)的分子氧被還原生成水的單電子過程釋放的能量只能通過熱量形式而被耗散［55-56］。從呼吸鏈泄漏的電子形成的超氧自由基主要產(chǎn)生在線粒體基質(zhì)中，只有兩個電子泄漏位點主要將超氧自由基釋放到線粒體內(nèi)膜與外膜的間隙（ⅠMM）［57-59］。超氧自由基以其高反應(yīng)性的不成對電子參與許多非特異性生物化學(xué)反應(yīng)而被認(rèn)為是有害的分子［60］。因為定位在線粒體基質(zhì)中，MnSOD是控制超氧自由基代謝方向（成為有害的自由基分子或者產(chǎn)熱性呼吸的中間分子H2O2）的主要的酶。由于底物（）被認(rèn)為有限，SODs也一直被認(rèn)為是一種為防止瞬時的超氧自由基爆發(fā)而備用的抗氧化酶。然而據(jù)觀察，過表達(dá)MnSOD會導(dǎo)致細(xì)胞中H2O2水平升高和水平降低，因此，MnSOD可作為調(diào)節(jié)超氧自由基和過氧化氫平衡的變阻器［61］。此外，動力學(xué)模型證明，在過表達(dá)MnSOD的線粒體中，降低的水平會“拉動”反應(yīng)CoQ-+O2→CoQ+向前進(jìn)行，從而導(dǎo)致更多電子從CoQ-位點泄漏出ETC?？偠灾?，MnSOD的活性不僅可以影響/H2O2的穩(wěn)態(tài)，還可以影響和H2O2在細(xì)胞或者線粒體里的流量。理論上來說，冷活化的特性表明MnSOD可以直接響應(yīng)溫度變化并主動調(diào)節(jié)/H2O2平衡和流通量。

在研究的初始階段（1970s年），MnSOD的主要生理功能被定義為抗氧化酶。但是目前的研究表明，MnSOD在維持細(xì)胞中ROS的平衡和調(diào)節(jié)細(xì)胞和線粒體的功能方面起著重要作用。雖然ROS被認(rèn)為是一類重要的信號分子，但是還沒有明確的理論闡明ROS信號作用的原理。在較高（或過高）的溫度下，MnSOD更容易在較慢的產(chǎn)物抑制途徑中催化反應(yīng)，并且導(dǎo)致不能被及時清除而過量。我們認(rèn)為，如果是一種有害分子，它更可能是由體溫過高引起的；如果是一種信號分子，它似乎會轉(zhuǎn)導(dǎo)身體（或環(huán)境）溫度過高的信號。在較低（或過低）的溫度下，MnSOD主要通過快速循環(huán)途徑催化反應(yīng)，因此，NADH和FADH2更容易與O2燃燒（通過級聯(lián)的單電子還原途徑進(jìn)行）而產(chǎn)生熱量。如果低溫下冷活化的 MnSOD活性高于過氧化物酶和谷胱甘肽過氧化物酶等H2O2清除酶的活性，則H2O2更有可能過量。如果H2O2是信號分子，它似乎是介導(dǎo)了低溫信號，并且可能誘發(fā)一系列生理反應(yīng)反饋低溫應(yīng)激［3，57］。MnSOD遇冷激活是對低溫的主動性反應(yīng)，冷活化的MnSOD的活性（k2）顯著超過細(xì)胞中超氧化物的穩(wěn)態(tài)水平。因此，MnSOD的冷活化不能解釋為其在低溫下應(yīng)對氧化應(yīng)激的適應(yīng)性反應(yīng)，而是為適應(yīng)溫度變化而做出的應(yīng)答，并且主動調(diào)節(jié)/H2O2的平衡和流量以反饋溫度變化。

環(huán)境溫度作為自然選擇關(guān)鍵的因素，在推動生命進(jìn)化中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。不同的生物體有不同的適應(yīng)生長范圍，比如，大腸桿菌的生長溫度范圍是15~46℃，而Thermus thermophilus是一種極端嗜熱的、好氧性的、棒狀的革蘭氏陰性菌，其生長溫度能夠達(dá)到85℃，具有75℃的最適生長溫度。這兩者生長溫度的差異與Whittaker等［27-28］報道的引起其MnSOD變構(gòu)的溫度敏感點具有相關(guān)性，說明每個生物體的生理生長溫度與其MnSOD的活化/抑制狀態(tài)有關(guān)。MnSOD在較高溫度下處于產(chǎn)物抑制狀態(tài)似乎指示該溫度點是有利生物體的生長的溫度。人類的MnSOD在25oC的門控比為1∶1，因而被認(rèn)為容易產(chǎn)生產(chǎn)物抑制［62］。Hsu等［63］發(fā)現(xiàn)在20oC時人類MnSOD的門控比為4∶1。說明25oC是界定人MnSOD進(jìn)入慢速循環(huán)或者快速循環(huán)的重要溫度結(jié)點。有趣的是，25oC這個所謂的室溫正是人體感覺舒適的溫度。人MnSOD在高于25oC時的酶促動力學(xué)特征沒有見到報道，但是基于合理的推測，人體的MnSOD在35~37oC的生理環(huán)境中處于產(chǎn)物抑制狀態(tài)，這可以很好地解釋為什么發(fā)生生物氧化的主要亞細(xì)胞器-線粒體，在35~37oC的生理環(huán)境中，人體線粒體里的H2O2水平反而處于比較低的狀態(tài)［55-56］。

恒定的體溫可能是哺乳動物獲得生存優(yōu)勢的關(guān)鍵因素，因為穩(wěn)定的體溫可以保持生物體的生物化學(xué)反應(yīng)在合適溫度范圍內(nèi)進(jìn)行。但是，對于哺乳動物恒定體溫的進(jìn)化機(jī)制及其深層次的控制機(jī)制仍未完全揭示。近年發(fā)現(xiàn)線粒體局部微環(huán)境溫度遠(yuǎn)高于哺乳動物體溫［64］，說明線粒體是維持體溫恒定的重要“熱源”，是控制體溫的最佳位點。已經(jīng)有大量文獻(xiàn)報道線粒體中的解偶聯(lián)蛋白通過誘導(dǎo)質(zhì)子回流泄漏到線粒體基質(zhì)中的生熱。我們創(chuàng)新地提出冷活化MnSOD的催化產(chǎn)物H2O2可以直接誘導(dǎo)解偶聯(lián)蛋白的活化而增加產(chǎn)熱［65］。哺乳動物在進(jìn)化過程中建立了多種溫度應(yīng)答體系，如神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)，而使得哺乳動物體溫穩(wěn)定在35~37oC。據(jù)報道，ROS可以提高溫度敏感型瞬時電位受體（transient receptor potential，TRP）對辣椒素誘導(dǎo)的熱痛覺和機(jī)械痛覺的敏感性［2，66-71］。因此不能排除MnSOD和ROS也參與了溫度敏感性TRPs離子通道的調(diào)控。MnSOD可能是所有細(xì)胞的基礎(chǔ)的和普遍的溫度感受器，因為所有的細(xì)胞都表達(dá)MnSOD并且都對溫度變化敏感。MnSOD的共價修飾導(dǎo)致其活性降低，從而導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞對熱刺激引起的疼痛更敏感。以上論述想說明，體溫恒定的基礎(chǔ)是細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)，因為細(xì)胞可以主動調(diào)節(jié)線粒體里（或者生物體里）的氧化還原反應(yīng)以維持體溫恒定。哺乳動物的神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)可以感知和放大細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)的信號而提醒哺乳動物回避溫度-氧化應(yīng)激引起的傷害，從而使哺乳動物的體溫穩(wěn)定在更狹窄的溫度范圍。

6 結(jié)論

本文回溯了已經(jīng)確立的MnSOD門控動力學(xué)說，并且重點說明了溫度是影響其快速反應(yīng)與慢速反應(yīng)的門控比的關(guān)鍵因素。較高的溫度加快MnSOD與形成產(chǎn)物抑制復(fù)合物，從而使慢循環(huán)反應(yīng)成為催化反應(yīng)的主流。溫度降低反而誘導(dǎo)MnSOD進(jìn)入快速循環(huán)途徑，這是從微生物到人類的所有MnSODs的通用催化機(jī)制。MnSOD的門控動力學(xué)催化特性與該酶活性中心的構(gòu)象變化有關(guān)。在結(jié)構(gòu)上，MnSOD通過兩個獨立的、平行的途徑催化反應(yīng)，即慢速的內(nèi)球和快速外球反應(yīng)途徑。超氧自由基被氧化成O2的第一段反應(yīng)是與溫度變化無關(guān)的反應(yīng)，并且在快速的外球和慢速的內(nèi)球通路中以相同速率常數(shù)（k1）進(jìn)行。超氧自由基被還原為H2O2是歧化反應(yīng)循環(huán)中的關(guān)鍵的限速步驟，該步驟可能通過快速的外球或慢速的內(nèi)球兩條途徑平行進(jìn)行。當(dāng)進(jìn)入內(nèi)球并且配位Mn離子時，酶很容易形成抑制復(fù)合物而不能復(fù)活，這時方程式（4）中的質(zhì)子轉(zhuǎn)移就成為了超氧自由基歧化反應(yīng)的限速步驟。干擾進(jìn)入MnSOD活性中心的內(nèi)球而避免形成抑制復(fù)合物是維持歧化反應(yīng)在快速循環(huán)路徑中進(jìn)行的有效策略。結(jié)構(gòu)學(xué)和光譜學(xué)的研究表明，MnSOD活性中心中Mn的配位狀態(tài)是溫度依賴性，這可能是MnSOD遇冷活化的分子基礎(chǔ)。隨著MnSOD活性中心的遇冷收縮，一個水分子（WAT2）接近Mn（甚至與Mn形成配位鍵），從而競爭性地干擾超氧自由基與Mn配位、并且減少產(chǎn)物抑制的形成，因此該反應(yīng)在低溫下主要在較快的外球途徑中進(jìn)行。

變構(gòu)調(diào)節(jié)是酶活性調(diào)節(jié)方式中最靈活和快速的調(diào)節(jié)模式，因此，變構(gòu)調(diào)節(jié)往往與酶的生理學(xué)功能相關(guān)。MnSOD遇冷活化的特性說明該酶的生理學(xué)功能為：感受溫度變化進(jìn)一步調(diào)節(jié)/H2O2信號。MnSOD的溫度依賴性產(chǎn)物抑制為溫度應(yīng)激和氧化應(yīng)激之間關(guān)系的基本原理提供了全新的見解。在極端溫度下，由于高溫會導(dǎo)致MnSOD快速地形成產(chǎn)物抑制而不能有效清除超氧自由基，因此熱應(yīng)激可能與氧自由基不能被有效清除而過量有關(guān)。而于低溫下，MnSOD被過度活化而導(dǎo)致H2O2生成增加，因此冷應(yīng)激可能與H2O2過量相關(guān)。遇冷激活是MnSOD對溫度變化的最獨特的應(yīng)答，而不是對氧化應(yīng)激的被動適應(yīng)，因為MnSOD遇冷激活的抗氧化酶活性顯著超過細(xì)胞（或者線粒體）中的超氧自由基的水平。從生理學(xué)上講，MnSOD的冷活化是一種快速釋放過氧化氫的調(diào)節(jié)機(jī)制，過氧化氫可以作為第二信使誘導(dǎo)一系列針對冷應(yīng)激的生理反饋。越來越多的證據(jù)表明，ROS在許多與溫度相關(guān)的生理現(xiàn)象中發(fā)揮信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，例如解偶聯(lián)、適應(yīng)性產(chǎn)熱，以及溫度敏感瞬時受體電位通道、蛋白質(zhì)的折疊和熱休克蛋白的表達(dá)等［72-74］。

MnSOD主要受到乙?；?、硝化和磷酸化等共價修飾調(diào)節(jié)，這些修飾導(dǎo)致該酶活性降低。由于MnSOD的化學(xué)修飾已被證明可能具有可逆性，因此這些修飾可能與細(xì)胞中的氧化還原信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程有關(guān)，其中乙?；拖趸揎棻蛔C明與炎癥性熱疼痛的發(fā)生有關(guān)。主要位于線粒體的NAD+依賴性去乙?；窼irt3可以去除MnSOD的乙?；揎?，而調(diào)節(jié)細(xì)胞MnSOD的酶活性以適應(yīng)環(huán)境變化。白藜蘆醇等天然抗氧化劑通過增加SⅠRT3活性來促進(jìn)MnSOD的活化，從而高效清除而抑制炎癥性疼痛。MnSOD的乙酰化修飾一般是可逆的和可以調(diào)節(jié)的，該修飾因此理論上是生物體調(diào)節(jié)體內(nèi)ROS平衡和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式。亞硝酸鹽硝化修飾MnSOD活性中心的Tyr34氨基酸殘基，導(dǎo)致MnSOD喪失大部分酶活性和ROS失去平衡，而發(fā)出危險信號甚至引起細(xì)胞死亡。MnSOD被乙?；蛠喯跛猁}硝化修飾都與炎癥性熱疼痛的發(fā)生有關(guān)。過度的化學(xué)修飾會導(dǎo)致細(xì)胞中MnSOD的活性過低而產(chǎn)生過量的超氧化物，導(dǎo)致DNA、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)損傷，傷害性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)到中樞引起哺乳動物對炎癥性熱疼痛更加敏感。