犬羊膜有效成分的測(cè)定及保存條件的篩選

張佳韌，李 慧，王瑛琪，張 備，薛沾枚，趙 燦，生樹(shù)新，鄔立剛*

（ 1. 黑龍江農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)系，黑龍江 佳木斯 154002；2. 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江 齊齊哈爾 161005 ）

羊膜是一種起源于胚胎外胚層的多功能組織，位于胎膜最內(nèi)層，具有抗炎、抗新生血管生成、免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗纖維化、組織相容性良好等特性。羊膜是具有運(yùn)輸功能的上皮細(xì)胞，常作為上皮基底膜替代物廣泛應(yīng)用于眼部上皮組織修復(fù)，特別是眼表化學(xué)燒傷的治療[1-4]。人羊膜中存在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）、神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、堿性成纖維生長(zhǎng)因子等潛在的有效成分[5-7]。同時(shí)，人羊膜中存在的羊膜上皮干細(xì)胞和人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞具備分化成成纖維細(xì)胞的能力[8]，生物羊膜具備廣闊的臨床應(yīng)用背景[9]。新鮮羊膜由于不易獲取、難以長(zhǎng)期保存、手術(shù)縫合操作復(fù)雜等因素限制了其在眼病治療領(lǐng)域的應(yīng)用。因此，羊膜上清液成為新鮮羊膜重要的替代產(chǎn)品。羊膜上清液對(duì)角膜損傷具有良好效果。蔣愛(ài)華[10]研究證明，羊膜提取液治療鼠角膜堿燒傷與羊膜覆蓋效果相當(dāng)。也有研究發(fā)現(xiàn)，羊膜上清液可促進(jìn)犬角膜潰瘍后角膜愈合，減少角膜瘢痕，但羊膜有效成分還未進(jìn)行進(jìn)一步測(cè)定[11]。本研究從3種羊膜上清液的制備方式中篩選最佳制備條件，同時(shí)從不同的保存條件中篩選最佳保存條件，并通過(guò)試驗(yàn)檢查羊膜的一些有效成分，以期為揭示羊膜作用機(jī)制提供思路，為進(jìn)一步利用羊膜及羊膜制品奠定基礎(chǔ)，為羊膜上清液制備及動(dòng)物臨床試驗(yàn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 新鮮犬羊膜

試驗(yàn)所用的10 份新鮮羊膜（健康犬剖腹產(chǎn)的胎盤(pán)組織）來(lái)自校外實(shí)訓(xùn)基地動(dòng)物醫(yī)院。術(shù)前對(duì)所有孕犬進(jìn)行血液常規(guī)檢查、血液生化檢查、犬瘟熱抗原檢測(cè)、犬細(xì)小病毒抗原檢測(cè)、犬冠狀病毒抗原檢測(cè)和犬布魯氏桿菌抗體檢測(cè)，檢查結(jié)果均未見(jiàn)異常。

1.1.2 儀器與試劑

臺(tái)式高速離心機(jī)、低溫多樣品組織研磨儀、微量組織勻漿研磨儀均購(gòu)自天根科技有限公司；超凈工作臺(tái)購(gòu)自中國(guó)檢測(cè)儀器；酶標(biāo)儀購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司。

慶大霉素、兩性霉素購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；DMEM 液購(gòu)自?？寺∩锘瘜W(xué)制品（北京）有限公司；生理鹽水購(gòu)自青州堯王制藥公司；犬血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子-1（TIMP）、肝細(xì)胞生長(zhǎng)（HGF）、TGF-β1 ELISA試劑盒以及BCA法蛋白含量測(cè)定試劑盒均購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 犬羊膜上清液制備

通過(guò)剖腹產(chǎn)取出的新鮮胎盤(pán)被放置在無(wú)菌容器內(nèi)，在超凈工作臺(tái)內(nèi)使用含有抗生素的生理鹽水對(duì)新鮮胎盤(pán)進(jìn)行徹底清洗，反復(fù)進(jìn)行3次以去除胎盤(pán)及相關(guān)附屬組織，僅剩羊膜及絨毛膜組織。使用組織剪鈍性剝離羊膜及絨毛膜，剔除羊膜中間的血管，完成剝離后使用含有抗生素的生理鹽水對(duì)羊膜進(jìn)行反復(fù)沖洗3次。滅菌濾紙吸干羊膜上的水分，處理好的新鮮羊膜按照濕重5 g/份的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行統(tǒng)一剪切，隨機(jī)混合，為試驗(yàn)1和試驗(yàn)2提供羊膜樣品庫(kù)。

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.2.1 試驗(yàn)1：處理方式對(duì)羊膜有效成分的影響

試驗(yàn)分為常溫研磨組（C組）、低溫研磨組（D組）、干燥研磨組（G組）。每組均取10份羊膜樣本，C組和D組均使用高速組織研磨儀對(duì)每份羊膜樣本進(jìn)行研磨，其中C組常溫研磨，D 組研磨過(guò)程中加入液氮，保證低溫環(huán)境研磨；G組羊膜樣本在35 ℃下低溫烘干24 h后再進(jìn)行常溫研磨。高速研磨儀按照12 000 r/min 研磨5 min。充分研磨后加入離心管，按照質(zhì)量比1∶1加入PBS磷酸鹽緩沖液進(jìn)行稀釋。稀釋后樣本在搖床上充分振蕩20 min 后置于4 ℃高速離心機(jī)中8 000 r/min離心10 min，取上清液。

1.2.2.2 試驗(yàn)2：保存方式對(duì)羊膜有效成分的影響

試驗(yàn)分為DMEM研磨組、DMEM濕重組和凍干粉組，每組均取10份羊膜樣本。其中DMEM研磨組的新鮮羊膜均參考試驗(yàn)1 的低溫研磨組（D 組）方式進(jìn)行研磨，之后將新鮮羊膜直接制備成凍干粉；DMEM研磨組將凍干粉按質(zhì)量比1∶1與DMEM液混合，使用細(xì)菌濾膜過(guò)濾后封裝在無(wú)菌的0.5 mL離心管內(nèi)；凍干粉組未加DMEM液，其余步驟按照DMEM 研磨組無(wú)菌保存在離心管內(nèi)；DMEM 濕重組直接將新鮮羊膜儲(chǔ)存在DMEM 液中，使用時(shí)再進(jìn)行低溫研磨，開(kāi)展檢測(cè)或應(yīng)用。

1.2.3 犬羊膜上清液中相關(guān)成分含量檢測(cè)

將羊膜上清液制備當(dāng)天記為第0 d，試驗(yàn)1按要求每組隨機(jī)選3 份樣品，同試驗(yàn)試劑一同置于室溫自然回溫1 h。試驗(yàn)2于第0、20、40、80 d，每組分別隨機(jī)取出3份樣品，同試驗(yàn)試劑一同置于室溫自然回溫1 h。

1.2.3.1 犬羊膜上清液中的有效成分含量

將50 μL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品及試驗(yàn)樣品加入包被好的孔板中。之后在每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品孔和羊膜上清液孔添加辣根過(guò)氧化酶（HRp）100 μL，使用封板膜封板后，置于恒溫箱孵育60 min。去除孔板液體，拍干，使用350 μL 清洗液洗板5次。徹底洗凈后，添加底物A和底物B各50 μL，37 ℃避光孵育15 min。最后加入終止液50 μL，15 min 內(nèi)用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)為450 nm 測(cè)定各孔中的吸光度（OD）值，根據(jù)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品所測(cè)的OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再根據(jù)各樣品的OD值，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)算相關(guān)有效成分含量。

1.2.3.2 蛋白含量

配置工作液，根據(jù)需要量按要求將試劑A和試劑B按50∶1的比例混合，蓋緊后充分混合；酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)562 nm，蒸餾水調(diào)零。工作液60 ℃水浴預(yù)熱30 min。按照蒸餾水4 μL、標(biāo)準(zhǔn)品4 μL、待測(cè)液4 μL、工作液200 μL的劑量將對(duì)應(yīng)試劑添加到96孔板中測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS 20.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P＜0.01 表示差異極顯著，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 制備方法對(duì)犬羊膜上清液中有效成分含量的影響（見(jiàn)表1）

表1 制備方法對(duì)犬羊膜上清液中有效成分含量的影響Tab.1 Effect of preparation methods on the concentrations of active ingredient in canine amniotic membrane supernatant

由表1 可知，D 組犬羊膜上清液中bFGF 含量為73.58 ng/L，G 組的bFGF 含量為69.36 ng/L，D 組極顯著高于G 組（P＜0.01）；D 組犬羊膜上清液中TIMP、HGF、TGFβ1的含量均顯著高于G組（P＜0.05）。

2.2 保存條件對(duì)犬羊膜上清液中有效成分的影響

2.2.1 保存條件對(duì)犬羊膜上清液中bFGF 含量的影響（見(jiàn)表2）

表2 保存條件對(duì)犬羊膜上清液中bFGF含量的影響Tab.2 Effect of storage conditions on bFGF concentrations in canine amniotic membrane supernatant 單位：ng/L

由表2可知，第0 d，3組羊膜上清液中的bFGF含量在兩個(gè)保存溫度下差異不顯著（P＞0.05）；第20 d時(shí)，在4 ℃和-18 ℃條件下，凍干粉組bFGF 含量顯著低于DMEM 研磨組和DMEM 濕重組（P＜0.05）；第40 d 時(shí)，在4 ℃和-18 ℃條件下，凍干粉組bFGF含量極顯著高于DMEM研磨組和DMEM 濕重組（P＜0.01）；第80 d，在4 ℃和-18 ℃條件下，凍干粉組bFGF 含量極顯著高于DMEM 研磨組和DMEM濕重組（P＜0.01）。在-18 ℃條件下，第80 d 時(shí)凍干粉組犬羊膜上清液中bFGF含量顯著高于4 ℃（P＜0.05）。

2.2.2 保存條件對(duì)犬羊膜上清液中TIMP 含量的影響（見(jiàn)表3）

表3 保存條件對(duì)犬羊膜上清液中TIMP含量的影響Tab.3 Effect of storage conditions on TIMP concentrations in canine amniotic membrane supernatant 單位：ng/L

由表3 可知，第0、20 d，3 組羊膜上清液中TIMP 含量在兩個(gè)保存溫度下差異不顯著（P＞0.05）；第40 d時(shí)，-18 ℃條件下，凍干粉組羊膜上清液中TIMP 含量顯著高于DMEM 研磨組和DMEM 濕重組（P＜0.05）；第80 d，凍干粉組羊膜上清液中TIMP 含量極顯著高于DMEM 研磨組和DMEM濕重組（P＜0.01）。

2.2.3 保存條件對(duì)犬羊膜上清液中HGF 含量的影響（見(jiàn)表4）

表4 保存條件對(duì)犬羊膜上清液中HGF含量的影響Tab.4 Effect of storage conditions on HGF concentrations in canine amniotic membrane supernatant 單位：μg/L

由表4 可知，第0 d，3 組羊膜上清液HGF 含量在兩個(gè)保存溫度下差異均不顯著（P＞0.05）；第20 d 時(shí)，相同保存溫度下，凍干粉組羊膜上清液HGF 含量極顯著低于DMEM研磨組和DMEM濕重組（P＜0.01）。

2.2.4 保存條件對(duì)犬羊膜上清液中TGF-β1 含量的影響（見(jiàn)表5）

表5 保存條件對(duì)犬羊膜上清液中TGF-β1含量的影響Tab.5 Effect of storage conditions on TGF-β1 in canine amniotic membrane supernatant 單位：μg/L

由表5 可知，第0、20 d，3 組羊膜上清液中TGF-β1 含量在兩個(gè)保存溫度下差異均不顯著（P＞0.05）；第40 d 時(shí)，-18 ℃條件下凍干粉組犬羊膜上清液中TGF-β1含量顯著高于4 ℃條件（P＜0.05）；第80 d 時(shí)，在相同保存溫度下，凍干粉組-18 ℃條件下均極顯著高于DMEM 研磨組和DMEM濕重組（P＜0.01）。

3 討論

羊膜制品作為羊膜組織制備得到的潛在治療藥物，已在犬、兔子、大鼠等動(dòng)物上進(jìn)行了大量的試驗(yàn)，研究顯示了羊膜制品安全性良好，具備促進(jìn)傷口愈合，特別是角膜愈合的能力。王艷[12]發(fā)現(xiàn)，采用羊膜移植術(shù)治療角膜堿燒傷，羊膜具有抑制炎癥反應(yīng)、抑制血管新生和瘢痕的形成、促進(jìn)角膜損傷愈合的作用，對(duì)犬角膜堿燒傷具有一定臨床療效。蔣愛(ài)華[10]發(fā)現(xiàn)，羊膜提取液治療鼠角膜堿燒傷，可以有效抑制炎癥和后期新生血管再生，促進(jìn)角膜上皮愈合，減少角膜混濁，對(duì)堿燒傷角膜具有綜合療效，效果與羊膜移植相當(dāng)。但是目前對(duì)羊膜有效治療成分的研究較少，作用機(jī)制尚不明確。

本試驗(yàn)采用3種不同制備方式對(duì)羊膜中潛在成分進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，羊膜中含有較高成分的蛋白，蛋白質(zhì)作為實(shí)現(xiàn)生物功能的重要物質(zhì)，為羊膜制品發(fā)揮治療效果提供了可能。同時(shí)，本試驗(yàn)檢測(cè)了羊膜上清液中bFGF、TIMP、HGF、TGF-β1 的含量，并顯示存在較高的組織濃度，與Dua等[13]和Choi等[14]的研究結(jié)論相符。

bFGF 是調(diào)控創(chuàng)面愈合的重要細(xì)胞因子，可增強(qiáng)細(xì)胞的有絲分裂活性，促進(jìn)細(xì)胞快速分裂增殖。羅文娟等[15]研究表明，相對(duì)濃度為10 μg/L的bFGF具有促進(jìn)貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用。本試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果已經(jīng)達(dá)到此濃度，因此，bFGF 可能在羊膜制品促進(jìn)傷口愈合過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。TIMP 作為基質(zhì)金屬蛋白酶的抑制劑，可有效降低基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）的濃度，改善創(chuàng)傷部位炎癥反應(yīng)，以避免出現(xiàn)“呼吸爆發(fā)”。趙平等[16]研究發(fā)現(xiàn)，羊膜移植治療角膜堿燒傷術(shù)后，角膜中MMP 含量降低，TIMP 升高，表明羊膜可能通過(guò)提高角膜表達(dá)TIMP 的水平抑制MMP。本試驗(yàn)繼續(xù)補(bǔ)充了這一結(jié)果，提示羊膜不僅能夠提高角膜中TIMP 的表達(dá)，羊膜上清液作為外用滴眼液還可以提供一定的補(bǔ)充，但檢測(cè)到的TIMP濃度較低，其在治療過(guò)程中發(fā)揮的作用還需繼續(xù)研究。

HGF作為一種多效生長(zhǎng)因子，能夠促進(jìn)角質(zhì)細(xì)胞的增殖和遷移，以劑量依賴的方式促進(jìn)毛細(xì)血管出芽生長(zhǎng)和創(chuàng)面的再上皮化，發(fā)揮促進(jìn)損傷修復(fù)的作用[17]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著保存時(shí)間延長(zhǎng)，HGF下降非常明顯，表明現(xiàn)有保存條件不足以維持HGF含量長(zhǎng)期穩(wěn)定，需要繼續(xù)尋找適宜保存條件。TGF-β1 是一種多效能生長(zhǎng)因子，具有促血管生成、調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞基因表達(dá)、增加包括膠原蛋白、纖維蛋白在內(nèi)的細(xì)胞外基質(zhì)形成等功能[18]。本試驗(yàn)在羊膜中檢測(cè)到了較高濃度的TGF-β1，側(cè)面證明了羊膜治療角膜損傷時(shí)早期出現(xiàn)大量新生血管，TGF-β1可能發(fā)揮了重要作用。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)階段保存條件下，隨著保存時(shí)間延長(zhǎng)，羊膜中潛在有效成分出現(xiàn)不同程度的衰減，添加DMEM液對(duì)減緩早期有效成分含量下降起到了一定作用。但是中期保存時(shí)間不佳，可能是水溶液的環(huán)境加速了生物活性物質(zhì)的降解。凍干粉作為一種重要的保存形式，雖然保存前期有效成分含量依然會(huì)有下降，但中期保存穩(wěn)定性更好，可能相對(duì)干燥低溫的環(huán)境延緩了生物活性物質(zhì)降解。在相同保存液條件下，-18 ℃更有利于保存。4、-18 ℃是大多數(shù)使用場(chǎng)景可提供的保存環(huán)境，普通使用場(chǎng)景難以提供-80 ℃或更低的溫度。此外，是否研磨對(duì)保存在DMEM液中的羊膜的有效成分的影響不顯著。由于DMEM保存液中存在一定濃度的蛋白質(zhì)，但本試驗(yàn)未對(duì)蛋白質(zhì)含量進(jìn)行檢測(cè)，待后續(xù)發(fā)現(xiàn)更好的檢測(cè)蛋白質(zhì)含量手段，再對(duì)蛋白保存過(guò)程中的含量變化進(jìn)行記錄。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，犬羊膜存在一定含量的蛋白成分，同時(shí)存在不等含量的bFGF、TIMP 和TGF-β1 等具備生物學(xué)活性的有效成分，可能通過(guò)以上有效成分的作用路徑實(shí)現(xiàn)其作用效果。添加DMEM保存液成分的羊膜制品適合短期保存，凍干粉劑型適合中期保存，低溫冷凍（-18 ℃）可有效延緩相關(guān)有效成分的降解。本研究結(jié)果為犬羊膜中短期保存提供了一定參考。