小反芻獸疫及其診斷與防治的研究進(jìn)展

王永剛，于恒智，程 瑋，孫芳芳，李曉佳，陶 青，孫 妍

（ 1. 中華人民共和國沈陽海關(guān)，遼寧 沈陽 110623 ； 2. 遼寧省農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)校，遼寧 錦州 121007 ）

小反芻獸疫是由小反芻獸疫病毒引起的以腹瀉、口炎、發(fā)熱和肺炎為特征的一類傳染病，山羊發(fā)病比較嚴(yán)重，病死率可超過90%。小反芻獸疫的潛伏期為2～7 d，動(dòng)物感染后還會(huì)出現(xiàn)大腸埃希氏菌、支原體等的混合感染[1]。截至目前，全世界有70 多個(gè)國家和地區(qū)發(fā)生過小反芻獸疫[1]。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織規(guī)定小反芻獸疫為必須上報(bào)的動(dòng)物疫病，我國將其列為一類傳染病。高死亡率和高發(fā)病的發(fā)病特點(diǎn)給小反芻獸疫的診斷及治療帶來巨大挑戰(zhàn)，根除小反芻獸疫已成為世界各國的共同目標(biāo)。2015年，聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織和世界動(dòng)物衛(wèi)生組織聯(lián)合發(fā)布了《小反芻獸疫全球控制和根除戰(zhàn)略》，旨在于2030年前在世界范圍內(nèi)消滅小反芻獸疫[2]。本文綜述了小反芻獸疫病毒的病原學(xué)特征、流行病學(xué)、臨床癥狀，總結(jié)近年來小反芻獸疫的診斷及防治方法的研究進(jìn)展，以期為相關(guān)疾病在臨床中的診斷治療提供參考。

1 小反芻獸疫病毒的病原學(xué)特征

小反芻獸疫病毒是副黏病毒科、麻疹病毒屬病毒，此毒屬還包括犬瘟熱病毒、牛瘟病毒、海象瘟病毒。小反芻獸疫病毒基因組為單股負(fù)鏈無節(jié)段RNA，長15 948 bp。

1.1 小反芻獸疫病毒基因組結(jié)構(gòu)

小反芻獸疫病毒編碼6個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和2個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白以及1個(gè)血清型、4個(gè)基因譜系。兩個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白為C蛋白和V 蛋白（由P基因編碼）；6 個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白為磷蛋白（P 蛋白）、大蛋白（L蛋白）、核衣殼蛋白（N蛋白）、融合蛋白（F蛋白）、血凝素蛋白（H蛋白）和基質(zhì)蛋白（M蛋白）。4個(gè)基因譜系中的Ⅲ型流行于西亞、西非地區(qū)，Ⅰ型和Ⅱ型主要流行于西非部分地區(qū)，Ⅳ型流行于中東地區(qū)[3]。

1.2 小反芻獸疫病毒編碼蛋白功能

V 蛋白和C蛋白在結(jié)構(gòu)功能上類似，與病毒逃避宿主免疫相關(guān)；H 蛋白和F 蛋白在小反芻獸疫病毒侵染的過程中起到黏附和侵入靶細(xì)胞的作用；L 蛋白和P 蛋白一起完成病毒的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、mRNA 帽子結(jié)構(gòu)的功能；此外，M 蛋白是維持病毒顆粒穩(wěn)定的蛋白，起到連接N蛋白與表面糖蛋白的作用；C 蛋白調(diào)控病毒RNA 合成，能夠使成熟病毒顆粒順利出芽。N 蛋白是分型蛋白[3]。C蛋白和V 蛋白比較保守，與病毒在宿主體內(nèi)的復(fù)制和致病性具有一定關(guān)系[4]。Enchery 等[5]發(fā)現(xiàn)，不同小反芻獸疫病毒毒株之間存在一定的交叉保護(hù)。

1.3 小反芻獸疫病毒復(fù)制過程

小反芻獸疫病毒首先通過H 蛋白和N 蛋白與細(xì)胞表面受體結(jié)合，引起F 蛋白構(gòu)象發(fā)生改變并釋放融合肽，使病毒包膜與細(xì)胞膜發(fā)生融合，之后釋放螺旋化的核衣殼到胞質(zhì)中，從而開始病毒轉(zhuǎn)錄[6]。

2 小反芻獸疫的流行病學(xué)特征

2.1 傳染源

小反芻獸疫潛伏期通常為4～6 d，《陸生動(dòng)物衛(wèi)生法典》表述潛伏期最長為21 d，傳染源多為隱性感染動(dòng)物或患病動(dòng)物。

2.2 傳播方式

小反芻獸疫多通過與病羊直接接觸傳播，此外，接觸傳播（消化道和呼吸道）與被病毒污染的飼料飲水等發(fā)生間接接觸也會(huì)造成該病傳播。

2.3 流行情況

小反芻獸疫最早發(fā)現(xiàn)于西非，是WOAH 提供官方認(rèn)證的7 種疫病之一[7]。目前，WOAH 認(rèn)證的小反芻獸疫無疫國為57個(gè)，無疫區(qū)域1個(gè)。我國小反芻獸疫疫情流行分3個(gè)階段：2007—2010年，小反芻獸疫疫情傳播到我國西藏自治區(qū)；2013—2015年，新疆首次發(fā)現(xiàn)該疫病，隨后全國開始流行，涉及23 個(gè)省、自治區(qū)、直轄市[8]；2016 年至今呈散發(fā)狀態(tài)。2016—2022 年間，我國發(fā)生32 起小反芻獸疫疫病，大部分發(fā)生在新疆維吾爾自治區(qū)[9]。

3 小反芻獸疫的臨床癥狀

山羊的臨床癥狀比較典型，綿羊一般較輕。感染動(dòng)物的臨床癥狀與牛瘟病牛類似。小反芻獸疫根據(jù)癥狀可分為溫和型、標(biāo)準(zhǔn)型和急性型。最明顯的病理變化為結(jié)膜炎和壞死性的口炎；皺胃病變較為明顯，表現(xiàn)為糜爛，有出血斑點(diǎn)；大腸，尤其是結(jié)腸直腸交界處會(huì)出現(xiàn)斑馬條紋或特征性出血，還可見脾臟腫大和腸系膜淋巴結(jié)水腫。

4 小反芻獸疫診斷方法的研究進(jìn)展

小反芻獸疫是目前制約養(yǎng)羊業(yè)發(fā)展的主要因素之一。生產(chǎn)實(shí)際中，快速診斷對于該病的防控至關(guān)重要。小反芻獸疫實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢測方法包括病毒中和試驗(yàn)（VNT）[10]、瓊脂凝膠擴(kuò)散試驗(yàn)（AGID）[11]和對流免疫電泳試驗(yàn)（CIE）、免疫熒光抗體檢測試驗(yàn)（FAT）[12]、重組酶聚合酶擴(kuò)增（RTRPA）、逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（RT-LAMP）[13]、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）[14]、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）[15]、化學(xué)發(fā)光免疫分析法（CLIA）[16]、膠體金免疫層析技術(shù)（GICA）和量子點(diǎn)免疫層析法（QD-LFMA）[17]。

4.1 VNT

VNT 是WOAH 建議的抗體檢測金標(biāo)準(zhǔn)，原理是使用已知病毒檢測待檢血清的中和抗體，此方法敏感性高、特異性強(qiáng)，但費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不適合大規(guī)模檢測[18]。但許多新的檢測方法需要與之進(jìn)行比較[19]。

4.2 AGID和CIE

AGID 和CIE 均為檢測病毒抗原的方法。AGID 是一種廉價(jià)、簡便、適用于野外或在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行的小反芻獸疫病毒檢測技術(shù)，可檢查肛門排泄物、眼鼻口分泌物和病變組織，但存在時(shí)間長、靈敏度低等問題。CIE是檢測病毒抗原最快速的方法。與免疫層析法、ELISA 法、核酸法相比，CIE 和AGID 法的靈敏度較低。因此，CIE 和AGID 不是小反芻獸疫病毒感染早期快速檢測的最佳方法[9]。

4.3 FAT

該方法操作簡單快捷，但需要熒光顯微鏡觀察結(jié)果[9]。先用熒光物質(zhì)在已知的抗原或抗體上做標(biāo)記，利用抗原抗體反應(yīng)原理，檢查組織或細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。利用熒光顯微鏡可以看見熒光所在的組織或細(xì)胞。

4.4 RPA

目前已建立了多種小反芻獸疫病毒的RPA檢測方法。如李園麗[20]創(chuàng)建以P 基因作為檢測對象，檢測低限為0.326 TCID50/mL 或14.98 拷貝數(shù)的小反芻獸疫病毒實(shí)時(shí)RT-RPA。Yang 等[21]開發(fā)的LFS RT-RPA 檢測方法能夠檢測小反芻獸疫病毒N基因。但RPA 臨床和現(xiàn)場測試尚不夠成熟[9]，仍有待進(jìn)一步開發(fā)和研究。

4.5 RT-LAMP

RT-LAMP是能夠在恒溫條件下進(jìn)行快速擴(kuò)增核酸序列的技術(shù)，對小反芻獸疫病毒的M基因和N基因在原有的基礎(chǔ)上增加了逆轉(zhuǎn)錄酶以達(dá)到直接擴(kuò)增的目的。范晴等[22]建立一種可視化多重?zé)晒釸T-LAMP方法用于檢測小反芻獸疫病毒和藍(lán)舌病病毒，該方法對小反芻獸疫病毒和藍(lán)舌病病毒高度特異，與口蹄疫病毒、鹿流行性出血熱病毒、牛瘟病毒、山羊痘病毒等其他反芻動(dòng)物病毒均無交叉反應(yīng)，檢測靈敏度為200 copies/μL，干擾性小，可同時(shí)檢測兩個(gè)不同濃度的模板。張忠湛[23]設(shè)計(jì)了一種用于檢測小反芻獸疫病毒的LAMP 反應(yīng)體系并進(jìn)行了優(yōu)化，在62 ℃40 min 內(nèi)即可完成擴(kuò)增反應(yīng)，可檢測到1.6 個(gè)TCID50小反芻獸疫病毒。LAMP 對PCR 的敏感性是常規(guī)RT-PCR 的10 倍以上，其敏感性與熒光RT-PCR 相當(dāng)[21]，但該試驗(yàn)引物設(shè)計(jì)復(fù)雜，穩(wěn)定性不足，易出現(xiàn)假陽性[8]。

4.6 ELISA

小反芻獸疫病毒中最具抗原性的是核衣殼蛋白，常用于抗原檢測。Libeau 等[24]建立了基于小反芻獸疫病毒N蛋白單克隆抗體的免疫捕獲ELISA，可以快速精確地鑒別小反芻獸疫病毒和牛瘟病毒（RPV）兩種病原體。夾心ELISA也常用于進(jìn)行病毒抗原檢測，靈敏度比Vero細(xì)胞分離病毒法高。孫潔等[25]制備了針對小反芻獸疫病毒全病毒特異性卵黃抗體，利用PPRV N 蛋白特異性單克隆抗體和PPRV IgY 為主要材料，建立了PPRV 雙夾心ELISA 檢測方法檢測小反芻獸疫病毒。該方法可以特異性檢出小反芻獸疫病毒而與其他病毒間無交叉?；谛》雌c獸疫病毒M、N 蛋白單克隆抗體的dot-ELISA 也常用于田間檢測，與夾心ELISA 相比，該法的特異性和靈敏性分別為91.0%和82.5%。

4.7 PCR

PCR 也是一種病毒核酸檢測方法。師亞玲等[26]建立快速特異的小反芻獸疫病毒熒光定量RT-PCR檢測方法，與藍(lán)舌病、口蹄疫、山羊痘、羊口瘡等常見牛羊病毒均無交叉反應(yīng)，具有良好的特異性、較高的敏感性和穩(wěn)定性，可用于小反芻獸疫的初步篩查。Balamurugan等[27]設(shè)計(jì)了針對高度保守基因-N、M 兩種基因的多重RT-PCR，該方法能夠快速鑒別 RPV 和小反芻獸疫病毒兩種病原體，避免了假陽性的結(jié)果。使用RT-PCR-ELISA 方法檢測小反芻獸疫病毒N 基因靈敏性更高，比常規(guī)的瓊脂糖電泳分析的RT-PCR方法高10 000倍。結(jié)果表明，這種方法在病毒濃度非常低的情況下也能準(zhǔn)確地檢測出病毒，大大提高了檢測的靈敏度，可在早期發(fā)現(xiàn)病毒，從而為疾病的預(yù)防和治療提供寶貴的時(shí)間。此外，該方法還具有較高的穩(wěn)定性，可廣泛應(yīng)用于不同實(shí)驗(yàn)室和地區(qū)；但該方法容易污染，過程復(fù)雜，不適于小反芻獸疫病毒的高通量檢測?？傊谛》雌c獸疫病毒N 基因的RT-PCR-ELISA 檢測方法是一種高效、特異、靈敏的病毒檢測技術(shù)，適用于小反芻獸疫病毒早期和晚期的檢測，可鑒別RPV和小反芻獸疫病毒兩種病原體，將有助于更好地防控小反芻獸疫病毒，保護(hù)畜牧業(yè)的發(fā)展和公共衛(wèi)生安全。實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 具有更高的靈敏度，如Batten 等[28]創(chuàng)建的基于N基因的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 可測出4 個(gè)譜系中的小反芻獸疫病毒株，其檢測位點(diǎn)為N基因的N末端。

4.8 CLIA

CLIA是一種結(jié)合化學(xué)發(fā)光反應(yīng)與免疫反應(yīng)的免疫分析方法，具有靈敏度高、操作簡便、分析簡單、快速等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于傳染病的診斷。但這種方法對測試人員和儀器設(shè)備的要求均較高，不能廣泛地應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中[16]。

4.9 GICA和QD-LFMA

免疫層析是在免疫滲濾試驗(yàn)基礎(chǔ)上建立的新型免疫分析法，為一種抗原檢測方法。小反芻獸疫病毒檢測中常見的是量子點(diǎn)及金標(biāo)免疫層析技術(shù)。Chen 等[29]開發(fā)了可視化-化學(xué)發(fā)光雙讀的膠體金流動(dòng)免疫層析，并在膠體金表面分別對其進(jìn)行雙重標(biāo)記，從而達(dá)到雙讀和放大的目的。Cheng 等[17]利用量子點(diǎn)作為標(biāo)志物，構(gòu)建了一種新型的基于量子點(diǎn)的免疫層析檢測新方法，該方法具有光譜范圍廣、熒光獨(dú)特、熒光強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，其檢測靈敏度較傳統(tǒng)膠體金免疫色譜法高了一個(gè)數(shù)量級，可以滿足大樣本人群的檢測需求，但是試劑價(jià)格偏高。

5 小反芻獸疫疫苗防控的研究進(jìn)展

小反芻獸疫尚無有效的治療方法，防控方法主要為疫苗免疫。我國已將小反芻獸疫納入《2020年國家動(dòng)物疫病強(qiáng)制免疫計(jì)劃》，提出在全國范圍內(nèi)推廣小反芻獸疫疫苗。小反芻獸疫病毒屬麻疹病毒，小反芻獸疫病毒的疫苗的策略與其他麻疹病毒相同，可簡單地分為3類。

5.1 傳統(tǒng)疫苗

傳統(tǒng)疫苗包括小反芻獸疫病毒弱毒疫苗、牛瘟弱毒疫苗和小反芻獸疫病毒滅活疫苗，是應(yīng)用最廣泛的疫苗，但無法將接種疫苗的動(dòng)物與自然感染的動(dòng)物區(qū)分開。接種牛瘟弱毒疫苗可獲得良好的免疫保護(hù)作用。小反芻獸疫病毒弱毒疫苗可對不同群株進(jìn)行交叉免疫，且無不良反應(yīng)，但耐熱性能較差。而小反芻獸疫滅活疫苗需要進(jìn)行第二次免疫。

5.2 基因工程疫苗

基因工程疫苗包括重組亞單位疫苗、活載體疫苗、核酸疫苗和反向遺傳學(xué)技術(shù)重組苗。

5.2.1 重組亞單位疫苗

以致病蛋白為基礎(chǔ)構(gòu)建的亞單位疫苗具有更高的安全性和更高的免疫保護(hù)能力，有望成為防治小反芻獸疫的理想疫苗[30]。目前，H 蛋白已被證明是最重要的免疫抗原[31]，以病毒為載體，研制出了一種能夠有效預(yù)防綿羊感染小反芻獸疫的新型DIVA 疫苗，但該疫苗不能長期產(chǎn)生高水平抗體，有效保護(hù)周期存在一定的缺陷。

5.2.2 活載體疫苗

活載體疫苗包括痘載體疫苗和腺病毒載體疫苗。痘病毒基因組容量大，可載入大片段的外源基因，被用于構(gòu)建基因載體病毒疫苗。痘病毒載體疫苗沒有激活最佳的抗體反應(yīng)，疫苗接種員存在安全風(fēng)險(xiǎn)。腺病毒載體疫苗能夠誘導(dǎo)T 細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)烈免疫反應(yīng)，常用的為人5 型腺病毒[32]。重組腺病毒載體疫苗是一種高免疫原性的疫苗，可以引起獲得性和先天的免疫反應(yīng)，經(jīng)常被用于區(qū)分接種后的動(dòng)物和天然的動(dòng)物[33]。

5.2.3 反向遺傳學(xué)技術(shù)重組苗

利用反向遺傳學(xué)技術(shù)，通過對病毒RNA 的結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，剔除抗原組分和增加標(biāo)志基因，從而實(shí)現(xiàn)對小反芻獸疫病毒基因組的調(diào)控，為研制新型疫苗奠定基礎(chǔ)[34]。利用反向遺傳學(xué)方法構(gòu)建的重組苗，其致病力退化的可能性較低，且不具有DIVA的功能，因而具有較高的安全性。采用反向遺傳技術(shù)進(jìn)行疫苗研制存在的問題是，若將標(biāo)記蛋白與病毒囊膜結(jié)合，也許會(huì)改變宿主嗜性和致病力[33]。

5.3 多聯(lián)苗

由于小反芻獸疫可與其他病毒發(fā)生并發(fā)感染，如口蹄疫病毒[35]、藍(lán)舌病病毒[36]和山羊痘病毒[37]等，因此可使用多聯(lián)苗誘導(dǎo)中和反應(yīng)對抗多種小反芻動(dòng)物疫病。多價(jià)苗的使用使疫苗接種更加便利，并且明顯降低了疫苗成本，但免疫效果較差。

6 結(jié)論

小反芻獸疫作為一種危害比較嚴(yán)重的傳染性動(dòng)物疫病，已在非洲、歐洲及亞洲等70多個(gè)國家和地區(qū)發(fā)生，是目前制約養(yǎng)羊業(yè)發(fā)展的主要因素之一，給各國畜牧業(yè)發(fā)展均造成了一定的影響。在生產(chǎn)實(shí)踐中，高效的疫苗免疫和快速、準(zhǔn)確、特異和靈敏的檢測技術(shù)可提高疾病的防治效果，控制小反芻獸疫的流行。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織和聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織聯(lián)合制定并實(shí)施了小反芻獸疫全球控制和根除策略，相信隨著科學(xué)技術(shù)不斷進(jìn)步，小反芻獸疫的防控也將取得新進(jìn)展。